全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 22 期 2015 年 11 月

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野生大豆内生真菌及发酵液中高质量分数次生代谢产物菌株筛选
王鹤鸣 1，李凤姿 1，张 鸾 1，张秀峰 1，尹 静 1, 2*
1. 东北林业大学生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150040
2. 东北林业大学 林木遗传育种国家重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150040
摘 要：目的 以分离纯化的 42 株野生大豆内生真菌为材料，分析内生真菌菌丝及发酵液中次生代谢产物的积累，筛选高产次生
代谢产物内生菌株。方法 采用液体发酵摇瓶培养法及紫外分光光度法对不同内生真菌菌丝及发酵液中的总三萜、黄酮、多糖、
多酚与总酚的量进行检测。结果 42 株野生大豆内生真菌菌丝中，筛选获得高质量分数多糖菌株为 Y2S9、WDL3 和 WDL2，质
量分数最高可达 85.51 mg/g；高质量分数黄酮菌株为 Y1S9 和 Y6S8，质量分数分别为 2.99 和 2.24 mg/g；高质量分数三萜菌株为
Y6S8、Y2R1、Y6R2，质量分数分别为 25.55、17.89、15.96 mg/g；而 WDS7 总酚量最高，为 22.65 mg/g。内生真菌发酵液中，黄
酮量较高菌株为 Y1S8 和 SYS4，其质量浓度分别为 3.11 和 4.81 mg/L；总三萜质量浓度较高的菌株为 YSYL2、Y1S8、WDL3，质
量浓度分别为 17.46、35.00、42.98 mg/L。结论 不同生境可能是导致次生代谢产物量差异的主要原因，本研究筛选出高产次生代
谢产物野生大豆内生真菌菌株 11 株，为野生大豆内生真菌功能挖掘及新药筛选奠定了基础。
关键词：野生大豆；内生真菌；次生代谢产物；总三萜；黄酮；多糖
中图分类号：R282.2 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2015)22 - 3401 - 08
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2015.22.020
Screening of strains with high content of secondary production in endophytic
fungi and fermentation liquid from wild soybean
WANG He-ming1, LI Feng-zi1, ZHANG Luan1, ZHANG Xiu-feng1, YIN Jing1, 2
1. College of Life Sciences, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China
2. State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China
Abstract: Objective Using 42 endophytes separated and purified from wild soybean as materials, the accumulation of
secondary metabolites in hypha and fermentation liquid of endophytic fungi was analyzed so as to screen the strains with high
content of secondary production. Methods Liquid fermentation cultivation with shaking flask and ultraviolet
spectrophotometer was utilized to detect the contents of total triterpenoids, flavonoids, polysaccharides, polyphenols, and
total phenolic in different endophyte mycelia and their ferment liquids. Results For 42 endophytic fungi from wild soybean,
strains Y2S9, WDL3, and WDL2 had high content of polysaccharide up to 85.51 mg/g, then Y1S9 and Y6S8 had higher
content of the flavonoid with 2.99 and 2.24 mg/g, respectively; In addition Y6S8, Y2R1, and Y6R2 would produce more
triterpenoid with 25.55, 17.89, and 16.39 mg/g; Meanwhile WDS7 had the highest content of total phenol with 22.65 mg/g.
For the fermentation liquid of endophytic fungi, strains Y1S8 and SYS4 had higher contents of flavonoid with 3.111 and 4.809
mg/L; But strains YSYL2, Y1S8, and WDL3 had the higher levels of total triterpenoids up to 17.46, 35.00, and 42.98 mg/L,
respectively. Conclusion Different habitats might be the main factor causing difference in the contents of secondary
production. Eleven strains with high yield secondary metabolites selected from wild soybean would lay the foundation for
mining endophytic fungi function and screening new drugs.
Key words: wild soybean; endophytic fungi; secondary metabolism; screen; total triterpenoids; flavonoids; polysaccharides

植物中直接或间接的提取是目前人们获得天然
药物的主要手段，但随着人口的增多及市场需求量
的增加，直接从植物中提取次生代谢产物已经难以
满足需求，所以发展新的高效生产这些重要的次生

收稿日期：2015-06-07
基金项目：东北林业大学本科国家级创新项目（201410225022）；国家基础科学人才培养基金（J1210053）；国家自然科学基金资助项目（31101171）
作者简介：王鹤鸣（1994—），男，山东胶州人，在读本科，主要研究方向为植物次生代谢。
*通信作者 尹 静，副教授，博士，硕士生导师，主要研究方向为植物代谢调控。E-mail: yinjing20135@163.com
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代谢产物方法迫在眉睫[1-2]。长期寄生在某种植物上的
内生真菌通常能与该宿主植物协同演化，因而该宿主
植物与其内生真菌之间可能存在基因重组的现象，从
而使得宿主植物上的内生真菌能产生与宿主植物相
同的代谢产物[3-4]。近来发现的天然产物中有 51%来
自植物内生真菌，38%来自土壤微生物，11%来自植
物和动物，显然内生真菌己成为天然产物潜在的重要
资源，开发与研究内生真菌资源，并从中寻找和发现
新的先导化合物已成为国内外研究的热点[5-8]。
微生物这种高效的细胞反应器工厂的生物学特
点使微生物发酵工程的药物很好地满足了人们对快
速、高效、价廉的次生代谢产物药物的需求。在近
20 年中，已经从内生真菌中成功分离到许多抗微生
物、杀虫、细胞毒性和抗癌等具有重要价值的生物
活性物质[9-12]。涉及类异戊二烯、聚酮化合物、氨
基酸衍生物等合成途径代谢产物，包括萜类、类固
醇、杂氧蒽酮、醌、酚类、香豆素、苯骈吡喃酮、
恩镰孢菌素等类别。自从 Stierle 等[13]从短叶紫杉中
分离到一株能够产生肿瘤治疗剂紫杉醇的内生真菌
以来，学者们相继从其他内生真菌发酵产物中分离
得到了生物碱类、黄酮类、苯丙素类、甾体类等抗
肿瘤活性成分[14-16]。最近，Wellensiek 等[17]分离了
来自沙漠植物的内生真菌，筛选获得了 4 个几乎可
完全阻断 HIV-1 病毒复制的活性化合物。薄荷
Mentha haplocalyx Briq. 与 印 度 梨 形 孢
Piriformospora indicaleads 的共生相互作用促进植
物的地上部分生长、花的发育及改变薄荷次生产物
合成[18]。目前已分离鉴定的海洋植物红树林真菌超
过 200 种，成为海洋真菌的第 2 大类群，红树林内生
真菌次级代谢产物中具有抑制肿瘤细胞活性的物质
主要包括生物碱、黄酮、苯骈呋喃（吡喃）酮、有机
酸、蒽醌、环二肽、萜类、聚酮和香豆素类等[6,11]。
由于野生大豆原始生境复杂，种群多样性高，
抗逆性强[19-20]，其内生真菌的丰富度及多样性应较
其他物种更为优越。通过对野生大豆内生真菌的分
离，极有可能得到一些较为原始以及次生代谢产物
功能多样的内生真菌，但相关研究鲜见报道。本研
究以来自黑龙江省不同区域野生大豆中分离的 42
株内生真菌为试材，对分离、纯化的内生真菌进行
菌丝及发酵液中多糖、多酚、黄酮、总三萜类物质
的量进行检测，以期筛选出高产有用次生代谢产物
的内生菌株，为东北野生大豆内生真菌的功能菌株
的挖掘和利用奠定基础。
1 材料与仪器
1.1 材料
以来自于黑龙江省周边地区野生大豆中分离、
纯化的 42 株内生真菌为材料（深圳华大基因 ITS
测序鉴定），42 株菌株编号中，哈尔滨阿城区（Y1）、
同江市（Y2）、饶河（Y3）、铁力市（Y4）、宁安县
（Y5）、逊克县（Y6）和阿城区野生豌豆（WD）分
别代表黑龙江省不同生境的野生大豆，菌株中 S、L
和 R 分别代表野生大豆茎、叶和根来源内生菌株。
Z3 菌株来自普通栽培大豆黑农 48（紫花尖叶，哈
尔滨阿城区）根部分离的内生真菌。
1.2 试剂及仪器
1.2.1 主要试剂 蒽酮、硫酸、无水乙醇、蒸馏水、
盐酸、甲醇、香草醛、冰乙酸、醋酸乙酯、高氯酸、
硝酸铝、亚硝酸钠、葡萄糖均为分析纯，PDA 固体
培养基，PDB 液体培养基。
1.2.2 主要仪器 IKA HB10 旋转蒸发仪（德国），
DZ-900A 水平双层摇床（中国常州中捷），BSA124S
分析天平（德国赛多利斯），TU-1901 型双光束紫
外-可见分光光度（UV）计（北京普析通用仪器有
限责任公司），SEX-2P 超净工作台（中国苏州安泰
Air TECH 公司），恒温烘箱，超声仪。
2 方法
2.1 内生真菌的发酵培养
将保存在试管斜面中的野生大豆内生真菌在超
净工作台中重新接种到 PDA 平皿上活化培养，菌
落活化培养 7 d 后，用直径 1 cm 打孔器在平皿上取
出 3 块菌种块，接种到含 150 mL PDB 液体培养基
的 250 mL 三角瓶中培养，每种菌株培养 3 瓶，即 3
次重复。发酵培养置摇床上，速度 120 r/min，温度
25 ℃，光照 16 h/8 h，培养周期为 10 d，10 d 后分
别滤过收获菌丝和发酵液。
利用旋转蒸发仪（温度 70 ℃，转速 200 r/min）
将收获的每一个菌株发酵液浓缩 10 倍，装入 50 mL
离心管，4 ℃冰箱保存备用。将收获的野生大豆内
生真菌菌丝放置于锡箔纸上，60 ℃烘干至恒定质
量，使用分析天平称量菌丝干质量。
2.2 检测方法
2.2.1 内生真菌多糖的测定 菌丝中多糖样品制备
及检测参考朱伟[21]方法，略有改动，具体如下：准
确称取内生真菌菌丝干样 0.200 g，于 10 mL 试管中
加入 5 mL 蒸馏水，沸水浴加热 30 min，回收上清
液后，再加 5 mL 蒸馏水沸水浴加热 30 min，2 次上
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清液滤过回收至 25 mL 量瓶中，用蒸馏水定容备用。
取 0.5 mL 样品液加入 2 mL 蒸馏水与 6.5 mL 硫酸-
蒽酮溶液（1.0 g 蒽酮溶于 500 mL 浓硫酸），涡旋混
匀后立即于沸水中加热 5 min，冷却后，利用分光
光度计检测 625 nm 下的吸光度（A）值，依据线性
回归方程 Y＝260.08 X－4.544 8，R2＝0.998 5（式中
X 为 A 值，Y 为样品质量分数）计算内生真菌菌丝
中多糖的量。
2.2.2 菌丝中总黄酮样品制备及检测 参考李佳
等[22]方法，略有改动，具体如下：精确称取 0.200 g
样品于 25 mL 的量瓶中，加入 10 mL 50%乙醇，密
封好后超声提取 90 min，滤过并定容至 25 mL，备
用。精密移取待检测样品 4 mL 置于 25 mL 量瓶中，
加 5%亚硝酸钠溶液 1 mL，摇匀静置 6 min，再加
入 10%硝酸铝溶液 1 mL，摇匀静置 6 min，加 4%
氢氧化钠 10 mL，并用 50%乙醇定容至刻度，摇匀
静置 15 min，同时以试剂为空白对照，于 550 nm 下检
测 A 值。黄酮量计算依据线性回归方程 Y＝0.087 5
X＋0.000 2，R2＝0.999 7（式中 X 为 A 值，Y 为样
品质量浓度）。
2.2.3 发酵液中总黄酮的测定 精密量取 5 mL 浓
缩后的发酵液，加入 5 mL 无水乙醇定容至 10 mL，
密封好后超声提取 90 min，备用。精密移取 4 mL
定容后溶液，按照“2.2.2”项步骤操作，以检测发
酵液中黄酮量。
2.2.4 菌丝中总三萜样品制备及检测 参考李春晓
等[23]方法。
2.2.5 发酵液中总三萜的测定[23] 从浓缩后的发酵
液中取 1 mL，置于 10 mL 的离心管中，70 ℃水浴
蒸干，加入 200 μL 的 5%香草醛-冰乙酸和 800 μL 高
氯酸，70 ℃水浴 15 min，取出后迅速放入冰中冷却，
醋酸乙酯定容至 5 mL 后，利用分光光度计检测 551
nm 下的 A 值。根据回归方程计算总三萜量。
2.2.6 菌丝中多酚样品制备及检测：参考周曼等[24]
方法，略有改动，具体如下：精确称取 0.200 g 菌
丝样品置于 50 mL 三角瓶中，加入 7 mL 60%乙醇
后，置于超声仪中 40 Hz 超声提取 45 min，将上
清液转移至另一 50 mL 三角瓶中，向剩余固体样
品中再加入 7 mL 60%乙醇，重复超声提取 45
min，此过程共重复 3 次，回收 3 次所得滤液合并，
在 70 ℃下水浴将乙醇蒸干后，用蒸馏水定容至
15 mL。取 5 mL 定容后的样品液，加 3 mL 4%香
草醛-甲醇，再加入 1.5 mL 浓盐酸，最后用甲醇
定容至 10 mL。用分光光度计检测 500 nm 下的 A
值。多酚量计算依据线性回归方程 Y＝86.95 X－
0.679 2，R2＝0.998（式中 X 为 A 值，Y 为样品质
量分数）。
2.2.7 发酵液中多酚量测定 精密移取浓缩后的发
酵液 4 mL，加入 6 mL 无水乙醇后，超声 40 Hz 提
取 45 min，再在 70 ℃下水浴将乙醇蒸干，然后用
蒸馏水定容至 15 mL。精密称取 5 mL 定容后的样
液，按照“2.2.6”项方法检测发酵液中多酚的量。
2.2.8 内生真菌中总酚量的测定 菌丝总酚量测定
参考汪铁山等[25]方法。
3 结果与分析
3.1 不同野生大豆内生真菌生长量差异分析
分析显示，野生大豆内生真菌菌株 Y2R14
Fusarium oxysporum species complex 、 Y5R4
Fusarium 和 Y5R11 Fusarium oxysporum species 的
菌丝生长量较低，培养 10 d 后，菌丝干质量分别为
0.23、0.21、0.27 g。菌株 Y6S8、Y2S9 和 Y1S9 3
菌株生长量最高，质量分别为 5.46、4.65、4.49 g（表
1）。表明野生大豆中不同内生真菌的生长速率差异
显著，且 3 株生长量最低的菌株均分离自野生大豆
Y2 株及 Y5 株的根部，Y2R14、Y5R4 和 Y5R11 菌
株，生长速率分别为 0.03、0.02、0.03 g/d。3 株生
长量最高的菌株全部分离自野生大豆 Y1 株、Y2 株
以及 Y6 株的茎部，其生长速率分别为 0.56、0.47、
0.45 g/d。说明定殖在不同部位的内生真菌在生长速
率上存在较明显的差异。
3.2 不同野生大豆内生真菌多糖量差异分析
内生真菌菌丝多糖测定结果表明（表 1），菌
株 SYS1、Y5L12、Y5R10 3 株内生真菌菌丝中多
糖质量分数较低，分别为 0.91、0.33、1.80 mg/g。
菌株 Y2S9、WDL3、WDL2、Y2S10 的菌丝多糖
量较高，其多糖量分别达到了 85.51、41.70、37.23、
32.92 mg/g，其中菌株 Y2S9 多糖量显著高于其他
菌株。
3.3 不同野生大豆内生真菌总黄酮差异分析
内生真菌菌丝总黄酮量分析显示（表 1），菌株
Y4R6 和 Y4R7 内生真菌菌丝中总黄酮质量分数较
低，分别为 0.09、0.10 mg/g。而总黄酮质量分数较
高的野生大豆内生真菌有 Y1S9、Y6S8、WDS7，
质量分数分别为 2.99、2.24、1.99 mg/g。真菌发酵
液中总黄酮量测定结果表明（表 2），菌株 Y5S8、
Y6S8 2 株内生真菌菌丝中总黄酮量较低，其量分别
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表 1 野生大豆内生真菌菌丝质量及其次生代谢产物质量分数
Table 1 Contents of secondary metabolism of endophytic fungi from wild soybean
质量分数/(mg·g−1) 质量分数/(mg·g−1) 菌株 生长量/g 多糖 总黄酮 总三萜 多酚 总酚 菌株 生长量/g 多糖 总黄酮 总三萜 多酚 总酚
BYSS3 0.55 28.90 0.89 1.34 3.85 5.90 Y2S10 2.00 32.92** 0.50 9.48 2.02 5.48
SYS1 1.09 0.91 0.78 2.33 2.44 2.99 Y2S9 4.65** 85.52** 0.29 14.96 0.50 0.53
SYS4 0.74 16.13 1.96 6.19 4.34 4.67 Y4R1 1.02 10.38 0.39 1.25 0.26 1.89
WDL2 2.18 37.23** 1.22 4.39 1.97 3.34 Y4R6 2.72 20.04 0.09 2.10 0.73 2.94
WDL3 3.36 41.70** 0.71 14.39 0.70 1.09 Y4R7 2.00 16.19 0.10 1.91 0.63 1.22
WDR5 1.07 16.32 0.75 0.56 2.91 4.38 Y4S1 0.51 20.81 0.27 0.64 3.06 5.00
WDS3 1.68 16.73 0.87 2.60 1.40 3.48 Y5L2 0.89 5.26 0.62 1.23 0.31 3.21
WDS7 1.69 10.56 1.99** 1.11 2.96 22.65** Y5L10 2.41 13.98 0.44 2.32 0.55 2.15
WDS8 1.01 5.02 1.21 1.83 10.83** 4.50 Y5L11 2.94 25.63 1.32 1.54 1.94 6.52
Y1R3 0.63 4.51 1.93 2.66 1.95 3.36 Y5L12 1.13 0.33 0.52 3.69 1.36 2.21
Y1S5 1.83 19.25 1.15 0.93 3.79 12.23** Y5R10 1.32 1.80 0.52 2.34 1.76 7.53
Y1S6 0.55 2.98 0.54 6.79 4.30 7.97 Y5R11 0.27 18.11 1.28 8.68 5.76 5.68
Y1S8 2.76 11.36 0.76 3.28 2.11 4.68 Y5R14 2.66 2.81 0.89 1.48 1.97 9.72**
Y1S9 4.49** 8.96 2.99** 4.12 2.20 4.86 Y5R15 3.13 16.02 0.86 0.95 1.93 4.92
Y2L5 2.11 11.86 0.37 14.64 1.55 2.07 Y5R4 0.21 16.15 1.56 11.53 0.96 1.33
Y2L6 2.67 10.07 0.40 15.63 1.45 6.71 Y6R2 2.98 16.19 0.79 15.96** 1.83 2.21
Y2R1 1.32 8.41 0.27 17.89** 2.47 3.31 Y6S8 5.46** 17.50 2.24** 25.55** 0.53 0.59
Y2R12 1.75 4.51 0.46 1.94 0.78 2.19 YSYL3 3.03 21.13 0.04 1.96 1.05 2.39
Y2R13 1.72 16.90 0.12 2.27 1.81 1.37 YSYS1 3.85 31.62 0.48 5.06 1.38 5.06
Y2R14 0.23 15.96 1.15 15.73 1.02 4.17 YSYS7 2.95 5.74 0.73 1.35 1.37 1.44
Y2R15 1.86 15.02 0.31 1.95 1.76 1.92 YSYS8 2.39 29.32 0.24 1.49 1.01 5.97
Y2R5 4.09 18.29 1.40 6.66 5.47** 5.47 Z3 2.53 5.54 0.62 3.56 0.24 1.24
Y2R6 1.83 18.01 0.22 3.83 0.48 2.35
** 表示菌丝中次生产物质量分数或产量较高的内生菌，下同
** indicates strains of endophytic fungi with highest yield or highest mass fraction of per secondary metabolism products which were expressed in the
mycelium liquid, same as below

为 0.32、0.36 mg/L。发酵液中总黄酮量较高的 3
株为 Y6R2、Y1S8、SYS4，分别为 3.06、3.11、
4.81 mg/L。
3.4 不同野生大豆内生真菌总三萜量差异分析
野生大豆内生真菌菌丝总三萜测定结果表明，
WDR5、Y4S1、Y1S5 3 株内生真菌菌丝中总三萜量
较低，分别为 0.56、0.64、0.93 mg/g。菌丝中总三
萜量较高的野生大豆内生真菌有 Y6S8、Y2R1、
Y6R2，菌丝中总三萜量分别为 25.55、17.89、15.96
mg/g（表 1）。分析显示，野生大豆内生真菌菌丝中
总三萜量最高的菌株比总三萜量最低的菌株平均高
19.233 mg/g，约高 28.2 倍。
野生大豆内生真菌发酵液中总三萜量测定结果
表明，Y2R12、Y5S8、WDR5 3 株内生真菌发酵液
中总三萜量较低，分别为 0.26、0.37、0.40 mg/L。
YSYL2、Y1S8、WDL3 3 株菌发酵液中总三萜量最
高，分别为 17.46、35.00、42.98 mg/L。内生真菌发
酵液中总三萜量最高的菌株 WDL3 是最低的菌株
Y2R12 的 15.78 倍（表 2）。
3.5 不同野生大豆内生真菌多酚量差异分析
野生大豆内生真菌菌丝多酚测定结果表明，菌
株 Y5L2、Y4R1 和 Z3 3 株内生真菌菌丝中多酚量
较低，分别为 0.31、0.26、0.24 mg/g。菌丝中多酚
量较高的内生真菌有 WDS8、Y2R5，多酚量分别为
10.83 和 5.47 mg/g。多酚量较高的菌株 WDS8 是 Z3
的 44.9 倍（表 1）。
通过测定野生大豆内生真菌发酵液中多酚量发
现，菌株 Y6S8、Y5S8、Y2R1 中多酚量较低，分别
为 0.11、0.65、0.72 mg/L。野生大豆内生真菌发酵
液中多酚质量浓度最高的 3 株为 WDR5、Y2S9、
BYSS3，分别为 7.07、5.11、4.98 mg/L，WDR5 发
酵液中多酚是 Y6S8 的 64.23 倍（表 2）。
3.6 不同野生大豆内生真菌总酚量差异分析
野生大豆内生真菌菌丝总酚测定结果表明（表
1），菌株 Y6S8、Y4R7、Z3 3 株内生真菌菌丝中总
酚质量分数较低，分别为 0.59、1.22、1.24 mg/g。菌
丝中总酚质量分数较高的野生大豆内生真菌有
WDS7、Y1S5、YSR14，其菌丝中总酚质量分数分
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表 2 野生大豆内生真菌发酵液中次生代谢产物量
Table 2 Contents of secondary metabolism in fermentation liquid of endophytic fungi from wild soybean
质量浓度/(mg·L−1) 质量浓度/(mg·L−1) 菌株 多酚 总三萜 总黄酮 菌株 多酚 总三萜 总黄酮
BYSS3 4.98** 2.65 2.43 Y2S10 4.27 0.70 1.14
SYS1 2.47 1.01 1.21 Y2S9 5.11** 1.28 2.82
SYS4 3.72 0.75 4.81** Y4R1 2.19 — 1.21
WDL2 2.34 0.63 0.67 Y4R6 1.00 — 1.13
WDL3 — 42.98** 3.04 Y4R7 0.93 3.55 1.09
WDR5 7.07** 0.40 2.35 Y4S1 1.96 — —
WDS3 3.11 — 1.61 Y5L11 1.22 2.79 2.26
WDS7 2.48 1.49 2.43 Y5L12 1.01 — 1.40
WDS9 1.18 11.37 2.05 Y5R10 1.81 3.01 0.42
Y1L2 1.01 2.94 1.53 Y5R11 1.95 — 1.14
Y1R3 0.73 0.59 0.54 Y5R14 2.35 0.76 1.08
Y1S5 1.06 — 0.55 Y5R15 2.20 0.76 1.04
Y1S6 1.66 1.08 0.87 Y5R4 2.21 4.80 1.17
Y1S8 — 35.00** 3.11** Y5S6 — — 0.74
Y1S9 2.80 3.70 1.63 Y5S8 0.65 0.37 0.32
Y2L5 1.54 3.45 1.00 Y6R1 1.71 14.44 0.68
Y2L6 1.98 — — Y6R2 2.06 — 3.06**
Y2R1 0.72 14.51 0.92 Y6S8 0.11 15.26 0.36
Y2R12 1.83 0.26 1.91 YSYL2 1.56 17.46** 1.33
Y2R13 2.70 2.23 1.25 YSYL3 1.48 1.18 0.77
Y2R14 0.88 3.03 1.04 YSYS1 1.28 4.72 0.83
Y2R15 2.38 2.76 1.72 YSYS7 1.87 9.58 0.96
Y2R5 2.19 4.84 0.69 Z3 2.95 1.01 0.45
Y2R6 2.64 2.89 0.98

别为 22.65、12.23、19.72 mg/g。可见分离的内生真
菌菌丝中总酚物质量差异显著。
3.7 野生大豆内生真菌菌丝次生代谢产物总产量分析
野生大豆内生真菌菌丝中以菌株 Y2S9、
WDL3、YSYS1 的多糖产量最高，菌丝多糖总产量
分别达 398.02、140.14、121.60 mg；菌株 Y1S9、
Y6S8 菌丝中的黄酮总产量较高，分别达 13.41、
12.22 mg；菌株 Y6S8、Y2S9、WDL3 的总三萜产
量较高，分别达 139.40、69.67、48.36 mg；菌株Y2R5、
Y1S9、Y1S5 的多酚总产量较高，分别为 9.61、9.89、
6.93 mg；菌株 WDS7、Y5R14、Y2R5、Y1S5 的总
酚总产量较高，分别为 38.29、25.83、22.36、22.36
mg，共计筛选出 11 株野生大豆高产次生代谢产物
菌株（表 3）。
4 讨论
来源于植物内生真菌的天然活性化合物是农
业、医药和食品行业中的重要新资源，有广阔的应
用前景[1-3,5-8]。目前，许多有价值的抗菌、杀虫、细
胞毒性和抗癌活性的化合物已成功地从内生真菌中
发现[9-18,26-28]。在长期的协同进化中，内生菌与寄主
植物之间形成了友好的关系。一些内生菌能够产生
与源于宿主植物相同或相似的生物活性化合物。如
紫杉醇、足叶草毒素、喜树碱、长春花碱、金丝
桃素、薯蓣皂苷都在宿主植物内生真菌中被分离
和检测[9-17, 27-35]。
野生大豆起源于中国，是栽培大豆的原始祖先
种，隶属于 Glycine Willd.属 Moench 亚属[19-20]。在
自然生境中，野生大豆的遗传多样性及功能多样性
不受人工选择的影响。同时，由于原有野生大豆生
境复杂，其内生真菌的丰富度及多样性要明显优于
其他物种。通过对野生大豆内生真菌的分离，极有
可能得到一些较为原始以及次生代谢产物功能多样
的内生真菌。本研究前期对 6 个不同类型野生大豆
和 6 个栽培大豆内生真菌进行分离，共分离内生真
菌菌株 302 株，其中来自野生大豆菌株 215 株。本
研究中以前期分离鉴定的 42 株野生大豆内生真菌
为研究材料，对内生真菌的生长量及菌丝、发酵液
中多糖、总三萜、总黄酮、总酚物质量的测定，结
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 22 期 2015 年 11 月

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表 3 野生大豆内生真菌菌丝次生代谢产物总产量
Table 3 Total yields of secondary metabolism of endophytic fungi from wild soybean
总产量/mg
菌株 多糖 总黄酮 总三萜 多酚 总酚
BYSS3 15.94 0.49 0.74 2.12 3.25
SYS1 0.99 0.85 2.55 2.66 3.27
SYS4 11.94 1.452 4.59 3.22 3.46
WDL2 81.06 2.66 9.57 4.30 7.28
WDL3 140.14** 2.40 48.36** 2.37 3.65
WDR5 17.48 0.80 0.60 3.12 4.70
WDS3 28.05 1.46 4.36 2.35 5.83
WDS7 17.86 3.35 1.88 5.01 38.29**
Y1R3 2.86 3.12 1.69 1.24 2.13
Y1S5 35.20 2.10 1.70 6.93** 22.36**
Y1S6 1.64 0.30 3.72 2.35 4.37
Y1S8 31.40 2.10 9.08 5.85 12.93
Y1S9 40.21 13.41** 18.49 9.89** 21.80
Y2L5 25.06 0.78 30.93 3.28 4.37
Y2L6 26.89 1.07 41.71 3.87 17.91
Y2R1 11.10 0.36 23.62 3.26 4.37
Y2R12 7.91 0.81 3.40 1.37 3.84
Y2R13 29.00 0.20 3.89 3.10 2.36
Y2R14 3.62 0.26 3.57 2.01 3.21
Y2R15 27.88 0.57 3.61 3.27 3.57
Y2R5 74.82 5.74 27.26 9.61** 22.36**
Y2R6 33.00 0.40 7.01 0.87 4.30
Y2S10 65.83 1.01 18.96 4.03 10.96
Y2S9 398.02** 1.34 69.66** 2.34 2.48
Y4R6 54.42 0.23 5.71 1.99 7.98
Y4R7 32.42 0.20 3.82 1.27 2.44
Y4S1 10.67 0.14 0.33 1.57 2.56
Y5L10 33.69 1.07 5.58 1.32 5.17
Y5L11 75.37 3.89** 4.53 5.70 19.17
Y5L12 0.37 0.59 4.18 1.54 2.51
Y5R10 2.38 0.69 3.08 2.33 9.93
Y5R11 4.92 0.89 2.36 1.56 4.26
Y5R14 7.48 2.36 3.26 5.24 25.83**
Y5R15 50.18 2.68 2.99 6.03 15.40
Y5R4 3.32 0.32 2.37 2.36 3.56
Y6R2 48.29 2.37 47.60 5.47 6.59
Y6S8 95.50 12.22** 139.40** 2.89 3.19
YSYL3 64.12 0.12 5.96 3.19 7.26
YSYS1 121.60** 1.86 19.48 5.30 19.47
YSYS7 16.92 2.15 3.97 4.04 4.24
YSYS8 70.16 0.58 3.57 2.42 14.27
Z3 14.00 1.58 9.00 0.79 3.14
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果表明，菌株 Y2S9、WDL3、WDL2、Y1S9、Y6S8、
Y2R1、Y6R2、WDS7、SYS4、YSYL2、Y1S8，共
11 株内生真菌中次生代谢产物产量较高。其中菌株
Y6S8 黄酮量与总三萜量均较高，分别为 2.24 和
25.55 mg/g。菌株 WDS7 的黄酮量与总酚量较高，
分别为 1.98 和 22.65 mg/g。而发酵液中，黄酮量最
高的为 SYS4，为 4.81 mg/L；Y1S8 和 WDL3 菌株
发酵液中总三萜量较高，总三萜量分别为 35.00
mg/L 和 42.96 mg/L。上述结果表明，来源黑龙江省
不同生境的野生大豆内生真菌次生产物组成差异显
著，次生代谢产物量高的菌株均来自野生大豆，而
本研究中来自栽培大豆分离的内生真菌 Z3 虽能合
成次生产物，但量不高。分析可能是不同野生大豆
均采自黑龙江省不同市县的林区、公路旁、池塘边
及田地边，生长环境较恶劣，抗逆性较强，其内生
真菌数量及次生产物量也相对丰富，如本研究中次
生产物较丰富的 Y6S8 来自黑龙江省逊克县林区野
生大豆根部分离菌株，生长地为第 5 积温带，活动
积温在 2 000～2 100 ℃，无霜期短，仅 85～115 天。
而来自栽培大豆品种内生真菌 Z3，生长在栽培条件
良好的阿城区实验地，为第 1 积温带，年活动积温
在 2 800 ℃以上，土质相对肥沃，水分也较充足，
长势良好。分析不同野生大豆及栽培大豆生长环境
的差异是导致其内生真菌中次生产物量变化较大的
主要原因。该研究结果筛选出的 11 株高产次生产物
内生真菌菌株，为野生大豆内生真菌的功能挖掘以
及后续抗逆菌株筛选研究奠定基础，同时这些内生
真菌也是新药用活性物质的重要来源，是寻找药用
植物替代物的重要资源。
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