全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 6 期 2015 年 3 月

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• 药材与资源 •
罗汉果三倍体雌株与二倍体雄株遗传背景的 ISSR 分析
韦荣昌 1, 2，白隆华 1*
1. 广西药用植物园，广西 南宁 530023
2. 中国医学科学院 北京协和医学院药用植物研究所，北京 100193
摘 要：目的 探索罗汉果 Siraitia grosvenorii 三倍体雌株与二倍体雄株的遗传背景，为无籽罗汉果优良品种的选育提供分
子生物学依据。方法 利用 ISSR 分子标记对 28 份罗汉果种质进行遗传背景分析，用 AFLP-SURV 计算材料间遗传距离；用
TSYS-pc 和 GenAIEx 分别进行聚类和主坐标分析。结果 从 100 条 ISSR 引物中筛选出 13 条用于扩增，共获得 131 条清晰
可辨条带，其中多态性条带 99 条，多态性位点百分率为 75.57%。聚类和主坐标分析表明罗汉果三倍体雌株和二倍体雄株的
遗传背景存在一定的丰富性，但大多遗传相似性系数较大，遗传距离较近。结论 罗汉果三倍体雌株和二倍体雄株遗传背景
的复杂性较低，应该尽快采取相应措施，进行种质创新，丰富无籽罗汉果亲本的遗传背景。
关键词：罗汉果；二倍体；三倍体；遗传背景；ISSR
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2015)06 - 0881 - 06
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2015.06.019
ISSR analysis of genetic background of triploid female and diploid male strains
of Siraitia grosvenorii
WEI Rong-Chang1, 2, BAI Long-hua1
1. Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plants, Nanning 530023, China
2. Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing
100193, China
Abstract: Objective To evaluate the genetic background of triploid female and diploid male strains of Siraitia grosvenorii and
provide the biological reference for good varieties breeding of seedless S. grosvenorii. Methods Inter simple sequence repeats (ISSR)
marker was developed to analyze the genetic background among 28 samples of S. grosvenorii, and cluster analysis and double principal
coordinate analysis were revealed by the NTSYS-pc software and GenAIEx software, respectively. Results Out of 100 ISSR primers
selected, 13 primers were used for amplification and a total of 131 unambiguous bands were obtained, among which 99 (PPB =
75.57%) were polymorphic. The results of cluster analysis and double principal coordinate analysis showed that there was a certain rich
of genetic background in triploid female and diploid male strains of S. grosvenorii. But the genetic similarity coefficients of majority
were bigger and the genetic distance was closer. Conclusion The complexity of the genetic background in triploid female and diploid
male strains of S. grosvenorii is lower and germplasm innovation strategies should be carried out to enrich the genetic background of
the parents of seedless S. grosvenorii.
Key words: Siraitia grosvenorii (Swingle) C. Jeffrey ex A. M. Lu et Z. Y. Zhang; diploid; triploid; genetic background; inter simple sequence repeats

罗汉果 Siraitia grosvenorii (Swingle) C. Jeffrey
ex A. M. Lu et Z. Y. Zhang 是雌雄异株的葫芦科
（Cucurbitaceae）罗汉果属 Siraitia Merr. 多年生藤本
植物[1]，为我国特有的珍贵药用和甜料植物，主要
产于广西的永福、临桂、龙胜等地[2]。罗汉果果实
是传统中药，可用于治疗气管炎、急慢性咽喉炎、

收稿日期：2014-09-01
基金项目：国家“十二五”科技支撑计划项目（2011BAI01B03）；国家自然科学基金资助项目（81373914）；广西自然科学基金资助项目
（2013GXNSFDA019021，2013GXNSFBA019170）
作者简介：韦荣昌（1983—），男，广西梧州人，助理研究员，博士，研究方向为分子生药学。Tel: (0771)2443056 E-mail: wrc830612@163.com
*通讯作者 白隆华（1967—），男，广西灌阳人，研究员，研究方向为中药资源学。Tel: (0771)2443056 E-mail: whitefh2008@126.com
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哮喘和感冒等。此外，其果实中还含多种甜苷，其
中甜苷 V 为世界上最强的非糖甜味物质之一，为蔗
糖甜度的 300～400 倍，是一种综合性状极佳的天然
甜味剂，广泛应用于食品、保健品、药品中，适合
所有人群长期食用，是糖尿病人、肥胖者、高血压
患者的理想糖替代品[3-4]，也是我国出口增长最快的
植物提取物之一。多倍体罗汉果可大幅提高根、茎、
叶、果实等部位的生物量和产量，增强抗逆性，提
高活性成分的量，其中三倍体还具有无籽的特性，
大大提高了整果利用率和甜苷提取收得率，对整个
罗汉果产业具有里程碑的意义[5]。
罗汉果三倍体雌株经二倍体雄株授粉后所结
的果实即为无籽罗汉果。本研究拟利用 ISSR 分子
标记技术 [6-8]探讨罗汉果三倍体雌株和二倍体雄
株的遗传背景，为无籽罗汉果优良品种的选育提
供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
材料采自广西桂林兴安县漠川乡的罗汉果种植
基地，总共采集到 28 份材料：二倍体雄株 7 份；三
倍体雌株 21 份，利用二倍体（或四倍体）父本花粉
对四倍体（或二倍体）母本柱头进行人工授粉杂交
获得（表 1）。每份材料选取生长状况良好的罗汉果
单株 3～5 株，采集约 10 片健康成熟叶片混合成该
份材料的样品，所有材料经广西药用植物园白隆华
研究员鉴定为葫芦科植物罗汉果 Siraitia grosvenorii
(Swingle) C. Jeffrey ex A. M. Lu et Z. Y. Zhang 的叶
片，用硅胶干燥保存，带回实验室中待用。
表 1 材料来源、倍性和雌雄
Table 1 Material source, ploids, and male/female used in study
编号 材料 倍性 雌/雄 编号 材料 倍性 雌/雄
M201 Dongguaguo 2x ♂ F308 Keyan1 C×M202 3x ♀
M202 Qingpiguo 2x ♂ F309 Keyan1 C×M204 3x ♀
M203 Male 1 2x ♂ F310 Nongjia×M205 3x ♀
M204 Hongmaoguo 2x ♂ F311 Nongjia×M206 3x ♀
M205 Dongguaguo 2 2x ♂ F312 Nongjia×M201 3x ♀
M206 Changtanguo 2x ♂ F313 Nongjia×M202 3x ♀
M207 Hongmaoguo 2 2x ♂ F314 Nongyuan B6×M205 3x ♀
F301 Bolin 3×M205 3x ♀ F315 Nongyuan B6×M204 3x ♀
F302 Bolin 3×M206 3x ♀ F316 Yongqing 1×M205 3x ♀
F303 Bolin 3×M204 3x ♀ F317 Yongqing 1×M206 3x ♀
F304 Bolin 3×M202 3x ♀ F318 Yongqing 1 (2n)×Dongguaguo (4n) 3x ♀
F305 Keyan1 C×M205 3x ♀ F319 Yongqing 1 (2n)×Changtanguo (4n) 3x ♀
F306 Keyan1 C×M206 3x ♀ F320 Keyan1 C (2n)×Dongguaguo (4n) 3x ♀
F307 Keyan1 C×M201 3x ♀ F321 Keyan1 C (2n)×Changtanguo (4n) 3x ♀

1.2 ISSR 分析
采用改良的 CTAB 法[9]提取罗汉果叶片的总
DNA。
1.2.1 PCR-ISSR 反应体系及反应程序[10] 25 μL
PCR 扩增反应体系中含 10×缓冲液 2.5 μL，MgCl2
2.0 mmol/L，脱氧核糖核苷酸（dNTP）0.2 mmol/L
（上海生工生物工程技术服务有限公司），ISSR 引物
0.5 μmol/L（上海生工生物工程技术服务有限公司），
Taq DNA 聚合酶（MBI Fermentas 公司）1.0 U，模
板 DNA 约 30～50 ng，超纯水补至 25 μL。在 PCR
仪（美国 BIO-RAD 伯乐公司，型号 PTC-200）上
进行以下扩增反应程序：94 ℃预变性 3 min，接着
进行 40 个循环（94 ℃变性 1 min，52 ℃退火 52 s，
72 ℃延伸 2 min），循环结束后 72 ℃延伸 7 min。
1.2.2 引物筛选 随机选出 6 份样品（包含二倍体
和四倍体）进行引物筛选，从 100 条 ISSR 引物中
筛选出 13 条扩增反应稳定、条带清晰、具有多态性
的引物，并用于所有材料的扩增。13 个 ISSR 引物
名称、序列（表 2）。
1.2.3 琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物 将扩增产物
置于 1.5%的琼脂糖凝胶中电泳，凝胶上所加电压不
超过 5 V/cm，用 Lambda DNA/EcoR I＋Hind III
Marker（MBI Fermentas 公司）作为标准相对分子质
量对照，经溴化乙锭（EB）染色 20～30 min，在凝
胶成像系统上观察照相、记录。
ISSR 为显性标记，同一引物的扩增产物中电泳
迁移率一致的条带被认为具有同源性，相同迁移位
置上有扩增条带记录为“1”，无扩增条带记录为“0”，
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表 2 引物名称、序列及其对 28 份材料的扩增条带统计
Table 2 Primers, sequences, and amplification bands on 28 individuals
引物 引物序列 5’-3’ 扩增总条带数 多态性条带数 多态性百分比/%
UBC823 (TC)8C 8 6 75.00
UBC825 (AC)8T 8 4 50.00
UBC826 (AC)8C 7 3 42.86
UBC827 (AC)8G 9 5 55.56
UBC846 (CA)8RT 10 7 70.00
UBC850 (GT)8YC 5 4 80.00
UBC857 (AC)8YG 8 5 62.50
UBC873 (GACA)4 15 13 86.67
UBC881 (G)3(TGGGG)2TG 11 10 90.91
UBC889 DBD (AC)7 9 5 55.56
UBC891 HVH (TG)7 9 7 77.78
UBC896 AGGT (CG)2G CCGC(N)5ATG 11 10 90.91
UBC900 AC(T)2(C)3(CA)2 (G)2(T)2(A)2(CA)2 21 20 95.24
总计 131 99 75.57
N = (A, G, C, T), R = (A, G), Y = (C, T), B = (C, G, T) ( i. e. not A), D = (A, G, T) ( i. e. not C), H = (A, C, T) ( i. e. not G), V = (A, C, G) (i. e. not T)
构建“0”“1”原始矩阵。仅清晰、稳定、可分辨的
并且长度在 400～2 000 bp 内的 ISSR 扩增条带才
被记录。用 AFLP-SURV version 1.0[11]计算材料间
遗传距离，并计算 Nei & Li 遗传相似性系数；用
NTSYS-pc version 2.02[12]软件的 UPGMA（unweighted
pair group method using arithmatic average）方法进
行聚类分析；用 GenAIEx version 6.3[13]进行主坐标
分析。
2 结果与分析
2.1 多态性分析
用 13 个 ISSR 引物对 28 份材料的总 DNA 进行
PCR 扩增，重复 2 次，扩增产物重复性好且稳定，
扩增得到的条带数及多态性条带见表 2。13 个引物
扩增条带数的范围为 5～21 条，共同带在 1～4 条内，
多态性条带数范围为 3～20 条，多态性百分比为
42.86%～95.24%，且由总计的结果可知，扩增总条
带数为 131 条（平均每个引物 10.08 条），其中多态
性总条带数为 99 条，多态性条带百分比为 75.57%。
引物 UBC900 得到的条带数最多，为 21 条；引物
UBC850得到的条带最少，为 5条。其中引物UBC873
的扩增图谱见图 1。此外，在不同罗汉果品种间存在
的多态性条带可作为鉴定品种的特征带。

图 1 引物 UBC873 对 28 份材料的 ISSR 扩增图谱
Fig. 1 ISSR amplification from DNA of 28 individuals using Primer UBC873
2.2 遗传相似性系数及遗传距离
28 份材料间的相似性系数变化为 0.639 9～
0.915 7，其中 F311 与 M205 间的相似性系数最低
（0.639 9），遗传距离最高（0.446 5）；而 F307 与 F318
间的相似性系数最高（0.915 7），遗传距离最小（0.088 1）。
2.3 聚类分析
图 2 为 28 份材料的聚类树状图，从图 2 中可看
出：F307 和 F318 直接聚为一类，具有很高的相似
性系数，两者距离最近，与上面的相似性系数及遗
传距离的数值是一致的。
在相似性系数为 0.82 处，28 份三倍体雌株与
二倍体雄株被分为 4 大类，第 1 类为 F301、F302；
第 2 类为 F303、F304；第 3 类为 F305、F312、
F313、F314、M201、M202、M203、F306、F307、
Marker 1 14 Marker 15 28
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图 2 供试 28 份材料的 UPGMA 聚类图
Fig. 2 UPGMA dendrogram for 28 individuals
F308、F315、F316、317、F318、F319、F320、
F321、F309、F310、F311；第 4 类为 M204、M205、
M206、M207。
2.4 双变量主坐标分析
主坐标分析（principal coordinate analysis，PCoA）
是基于 Nei & Li 遗传距离及相应的相似性系数进行
的。因此，主坐标分析图中各个个体（品种）间的
位置关系反映了它们在遗传上的相似性。由于每份
试验材料都是通过选取生长状况良好的罗汉果单株
3～5 株，共采集约 10 张健康成熟叶片混合而成的，
故此 28 份材料的主坐标分析可看作“双变量主坐标
分析”（double principal coordinate analysis，DPCoA：
一种将物种与物种之间差异考虑到群体间相互关系
的测度之中的排序方法）[14-15]。通过 ISSR 标记对 28
份材料进行 DPCoA 排序，发现前 3 个主坐标的方差
贡献率分别为 22.76%、19.70%和 18.21%，相对应的
累积贡献率分别为 22.76%、42.46%和 60.67%。一般
认为，如果前 3 个主要特征向量的方差占总方差的
40%以上，则排序效果是满意的[16]，本实验结果 28
份材料的前 3 个主要特征向量的方差累积贡献率高
达 60.67%，说明了降维效果较好。因此，保留 DPCoA
的前二轴对 28 份材料进行排序分析，应用 GenAIEx
version 6.3 获取坐标轴特征值及样品特征向量，并据
此划分出 28 份不同材料在 DPCoA 前二轴空间中的
排序（图 3）。

图 3 28 份材料的第 1、2 主坐标二维散点图
Fig. 3 Scatterplot of first and second double principal
coordinates on 28 individuals
由 Proj 划分而得的 28 份材料在 PCoA 排序图
中空间分布十分明显，除 F315 和 F320 有部分交叉
重叠外，其余样品间均无交叉重叠现象。PCoA 排
序图把 28 份材料分为 3 大类。
第 1 大类包括三倍体雌株 14 份（F301、F302、
F303、F304、F305、F308、F311、F312、F313、F314、
F315、F319、F320、F321），二倍体雄株 3 份（M201、
M202、M203）。
第 2 大类包括三倍体雌株 7 份（F306、F307、
F309、F310、F316、F317、F318），二倍体雄株 2
份（M206、M207）。
第 3 大类包括二倍体雄株 2 份（M204、M205）。
比较图 2 和图 3 可知，对 28 份材料所进行的亲
缘关系聚类分析和双变量主坐标分析的结果基本上
是一致的，雌雄株间距离相对较近的聚在一起，而
双变量主坐标分析能从多个方向、多个层面更直观
和准确地反映材料间的遗传关系。
3 讨论
3.1 ISSR 技术多态性分析及其应用
研究种质资源的遗传背景、遗传结构及亲缘关
系，可以为优良品种的选育提供帮助，这就需要一
0.79 0.83 0.87 0.91 0.95
相似系数
坐标（22.76%）
坐
标
（
19
.7
0%
）

主坐标
F301
F302
F303
F304
F305
F312
F313
F314
M201
M202
M203
F306
F307
F318
F320
F321
F319
F308
F315
F316
F317
F309
F310
F311
M204
M205
M206
M207
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种甚至多种可靠的、鉴别力强的分子鉴定手段[17]。
采用 13 个 ISSR 引物对 28 份罗汉果（三倍体雌株
与二倍体雄株）进行 PCR 扩增，结果呈现出不同程
度的多态性和共同性，这一方面说明罗汉果种质遗
传背景的复杂性，另一方面也说明材料之间具有一
定的共同性[18]。其中，某些种质的父本（或母本）
是相同的，它们之间的距离相对较近，说明 ISSR
对于亲缘关系较近的材料能检测出较高的多态性。
此外，在亲缘关系较远的种质间检测出数目不等的
特征带，说明 ISSR 技术也可用于遗传距离较远的
种质间鉴别。
3.2 罗汉果三倍体雌株与二倍体雄株的 ISSR 相关
遗传分析
在 ISSR 结果分析中，遗传相似性系数和遗传
距离的结果是一致的；而且系统聚类分析和主坐标
分析的结果基本上也是一致的，虽然聚类和主坐
标都能对样品进行聚类分析，但它们所反映的信
息却有所不同，系统聚类分析对密切相关的个体
间有很高的分辩率，其最终结果将所有的种质都
聚为一类，而双变量主坐标分析却能在不同群体
之间的距离上、从不同的方向和层面提供更多的
信息，可以更加直观的揭示供试材料间的差异[19]。
因此，两者并不重复，一般将主坐标分析和系统
聚类分析结合起来使用，以便对聚类结果做更全
面的解释[20]；所以，本研究将遗传相似性系数、
遗传距离和聚类、双变量主坐标分析结合起来，
全面分析罗汉果三倍体雌株与二倍体雄株的遗传
背景。
根据 ISSR 分析结果，有的材料之间虽然是不
同的种质，但遗传相似性系数较高，说明了它们的
亲缘关系近；如：F313 因为由 Nongjia 与 M202 株
系杂交而成，所以与 M202 关系较近，其相似性系
数高达 0.839 1。此外，在三倍体雌株中，如果其亲
本相同或相似性系数较高，由于子代继承了亲本一
定的遗传物质，从而子代间的相似性系数也会较高，
如 F305 和 F306、F320 与 F321，由于其母本都是
Keyan 1 C，故它们的相似性系数分别高达 0.919 3
和 0.900 4；而 F305 和 F310 也都为同一父本 M205，
所以其相似性系数也高达 0.855 6。
3.3 罗汉果三倍体雌株与二倍体雄株的合理组配
多倍体育种，主要利用多倍体效应和杂交优势，
就后者来说，要求亲本的优良性状能互补，并且亲
缘关系较远。本研究根据陈受良等[21]提出的结合线
法，将 28 份罗汉果材料的 ISSR 聚类结果进行了划
分，认为无籽罗汉果亲本间的相似性系数以 0.82 较
为合适，这是因为：相似性系数过低，亲本间的同
源性随之降低，容易向远缘杂交方向偏移，尤其是
栽培种和野生种间的杂交，经常会伴随部分野生性
状，降低杂种优势的利用效率，从而难以获得生产
上需要的新类型；反之，相似性系数过高，亲本间
趋于同源，杂种优势减弱。
在本实验中，F311 与 M205 间的相似性系数仅
为 0.639 9，F321 与 M204、F321 与 M205 间的相似
性系数也都仅为 0.678 2，遗传距离较大；而且 M205
与其他 27 份材料间的相似性系数在 0.6～0.7 的有 6
个之多，其中母本 5 个。推测在罗汉果三倍体雌株
与二倍体雄株中，最适合作雌雄组配的是 F311 和
M205，其次是 F321 和 M204、F321 和 M205。
值得指出的是，虽然罗汉果三倍体雌株和二倍
体雄株的遗传背景存在一定的复杂性，但大多遗传
相似性系数较大，遗传距离较近，应该尽快采取相
应措施，进行种质创新，进一步丰富三倍体雌株和
二倍体雄株的遗传背景，为无籽罗汉果优良品种的
选育奠定坚实基础。
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