全 文 :中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 23 期 2014 年 12 月
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栀子大黄汤血清药物化学的初步研究
唐 峥 1,尹 然 2*,毕开顺 2,朱鹤云 2,张晓书 2,毛新娟 2
1. 沈阳药科大学中药学院,辽宁 沈阳 110016
2. 沈阳药科大学药学院,辽宁 沈阳 110016
摘 要:目的 对栀子大黄汤(Zhizi Dahuang Decoction,ZDD)的入血成分进行分析研究,进而探讨其药效物质基础。方
法 采用血清药物化学研究方法,建立口服 ZDD 后大鼠血清的超快速液相色谱(UFLC)指纹图谱;通过比较 ZDD、缺味
方、单味药以及各组给药后所得血清样品,初步确定口服 ZDD 后大鼠血中移行成分及其来源生药。结果 口服 ZDD 后在
大鼠血中发现了 21 个入血成分,其中 12 个为代谢产物,9 个为原型成分;经与对照品比对,指认了 3 个原型入血成分,分
别为京尼平苷、芦荟大黄素和大黄酸。结论 初步确定了 ZDD 的入血成分,为其药效物质基础的阐明奠定了基础。
关键词:栀子大黄汤;血清药物化学;入血成分;指纹图谱;物质基础;京尼平苷;芦荟大黄素;大黄酸
中图分类号:R286.02 文献标志码:A 文章编号:0253 - 2670(2014)23 - 3377 - 06
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.23.004
Preliminary study on serum pharmacochemistry of Zhizi Dahuang Decoction
TANG Zheng1, YIN Ran2, BI Kai-shun2, ZHU He-yun2, ZHANG Xiao-shu2, MAO Xin-juan2
1. School of Traditional Chinese Materia Medica, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China
2. School of Pharmacy, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China
Abstract: Objective To study the blood components in Zhizi Dahuang Decoction (ZDD) and to further explore its pharmacodynamic
material basis. Methods UFLC fingerprints of serum in rats after ZDD treatment were established with serum pharmacochemistry
method. The UFLC profiles of serum samples collected after the treatment of ZDD, ZDD without one of the component herbs and
single crude herb were compared, and the transitional constituents to blood and their metabolites were analyzed. Results Twenty-one
constituents absorbed into rat blood were detected after oral administration of ZDD, 12 of which were metabolites. Other nine were
prototype constituents, three of which were recognized as geniposide, aloeemodin, and rhein by comparing with reference substances,
respectively. Conclusion The constituents of ZDD absorbed into blood are preliminarily identified, which could lay the foundation
for the illumination of its pharmacodynamic material basis.
Key words: Zhizi Dahuang Decoction; serum pharmacochemistry; constituents absorbed into blood; fingerprint; material basis;
geniposide; aloeemodin; rhein
传统中药多采用口服给药方式,口服后药物所
含成分或经消化道直接吸收入血;或经消化液、消
化酶及肠内菌群的作用分解成次生代谢产物被吸收
入血;或经肝微粒体酶代谢为活性代谢产物[1]。无论
经过上述哪一种途径,其有效物质必须以血液为媒介
输送到靶点,才能发挥相应的药效,因此,被吸收入
血的成分才是中药的体内直接作用物质[2]。基于以上
理论,日本学者田代真一于 1988 年提出了“血清药
物化学”的概念[3]。近年来,血清药物化学研究方法
引起了众多研究者的重视,并广泛将其运用于中药药
效物质基础研究[4-9],显示出了很好的应用前景。
栀子大黄汤(Zhizi Dahuang Decoction,ZDD)
始载于《金匮要略》,由栀子、大黄、枳实、淡豆豉
4 味中药组成,是张仲景治疗酒黄疸的经典名方,
现代临床应用广泛,对于酒精性肝炎、黄疸型肝炎、
急慢性肝炎、急性胰腺炎、心系重症等具有确切疗
效[10-12]。本实验室前期利用超快速液相色谱(UFLC)
方法建立了 ZDD 的指纹图谱[13],但尚未见有关该
收稿日期:2014-06-23
基金项目:国家自然科学基金青年科学基金项目(81202893);辽宁省教育厅科学研究一般项目(L2012360)
作者简介:唐 峥(1988—),女,硕士研究生。Tel: (024)23986296 E-mail: tangzheng1988@163.com
*通信作者 尹 然,副教授。Tel: (024) 23986296 E-mail: yinran_syphu@163.com
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方血清药物化学方面的研究。因此,本实验在前期
体外分析的基础上,建立 ZDD 大鼠血清指纹图谱,
初步确定其入血成分及其来源,从而为深入研究
ZDD 的效应物质奠定基础。
1 材料
1.1 实验仪器
日本岛津 LC—30AD UFLC 色谱仪系统,包括
二元高压梯度泵、在线真空脱气机、自动进样装置、
SPD—20A 型紫外检测器、柱温箱,LabSolutions
色谱工作站;KQ—250DB 数控超声波清洗器(昆
山市超声仪器有限公司);AB135—S 十万分之一天平
(瑞士 Mettler Toledo 仪器有限公司);TGL—16 高速
台式冷冻离心机(沈阳杰龙仪器有限公司);XW—
80A 旋涡混合器(上海医科大学仪器厂);MTN—
2800D 氮吹浓缩仪(天津奥特赛恩斯仪器有限公
司);VFD—2000 真空冷冻干燥机(北京博医康实
验仪器有限公司)。
1.2 试剂与药品
色谱用乙腈和甲醇均购自美国 Fisher 公司,色
谱用甲酸购自天津市科密欧化学试剂有限公司,水
为二次蒸馏水,其他试剂均为分析纯。
对照品京尼平苷(批号 110749-201115)、芦荟
大黄素(批号 110795-201007)和大黄酸(批号
110757-200206)购自中国食品药品检定研究院,质
量分数均大于 98%。
栀子、大黄、枳实、淡豆豉药材均购自沈阳天
益堂药店,经沈阳药科大学中药学院袁久志副教授
鉴定栀子为茜草科植物栀子 Gardenia jasminoides
Ellis 的干燥成熟果实,大黄为蓼科植物掌叶大黄
Rheum palmatum L. 的干燥根和根茎,枳实为芸香
科植物酸橙 Citrus aurantium L. 的干燥幼果,淡豆
豉为豆科植物大豆 Glycine max (L.) Merr. 的成熟
种子的发酵加工品。
1.3 实验动物
雄性 SD 大鼠,清洁级,体质量(200±20)g,
由沈阳药科大学实验动物中心提供,实验动物生产
许可证号 SCXK(辽)2010-0001。将实验动物置于
昼夜节律光照条件下,自由进食进水,室温在 18~
22℃,饲养 1 周以适应环境,每日触摸动物以适应
实验人员的操作。
2 方法
2.1 体外供试品溶液的制备
参照《金匮要略》原文,折合成现代剂量,按
栀子-大黄-枳实-淡豆豉3∶1∶4∶8称取栀子(GJE)
9 g、大黄(RPL)3 g、枳实(CAL)12 g、淡豆豉
(SSP)24 g,用 10 倍量水浸泡 30 min 后,回流提
取 1 h,纱布滤过,药渣加 10 倍量水重复提取 1 次,
合并 2 次滤液,经冷冻干燥制成 ZDD 冻干粉样品,
密封置于干燥器中,备用。同法制备 5 批 ZDD 冻
干粉样品,编号 S1~S5,并计算各批次样品的出粉
率(样品出粉率=所得冻干粉质量/生药总质量)。
取 ZDD 冻干粉 0.1 g(相当于生药约 0.33 g),精密
称定,置 50 mL 具塞碘量瓶中,加甲醇 25 mL,称
定质量,超声提取 30 min 后,放冷,再次称定质
量,并用甲醇补足减失的质量,提取液经 13 000
r/min离心 10 min,上清液用 0.22 μm微孔滤膜滤过,
取续滤液作为体外供试品溶液。另按上述方法分别
制备各缺味方及单味药的冻干粉样品及其体外供试
品溶液。
2.2 混合对照品溶液的制备
称取京尼平苷、芦荟大黄素和大黄酸对照品适
量,精密称定,分别置于 5 mL 量瓶中,加甲醇溶
解并稀释至刻度,摇匀,得各对照品储备液;精密
吸取各对照品储备液适量,置于同一 10 mL量瓶中,
加甲醇稀释至刻度,摇匀,配制成质量浓度分别为
京尼平苷 500 μg/mL、芦荟大黄素 4.1 μg/mL 和大黄
酸 9.8 μg/mL 的混合对照品溶液。
2.3 血清样品的采集
取 ZDD 冻干粉适量,加水配成含生药 1.6 g/mL
的体内供试品溶液,同法制备各缺味方和单味药体
内供试品溶液(浓度均按照 ZDD 药液浓度进行折
算)。取雄性 SD 大鼠,禁食 12 h(自由饮水),称
体质量,随机分为 10 组,分别为空白组、ZDD 全
方给药组、4 个缺味方给药组和 4 个单味药给药组,
ZDD 全方给药组 5 只,其余各组 3 只。空白组 ig
给予蒸馏水;ZDD 全方给药组分别 ig 给予由 5 批
ZDD 冻干粉样品制备的体内供试品溶液;其余各给
药组分别 ig 给予栀子、大黄、枳实、淡豆豉、缺栀
子、缺大黄、缺枳实和缺淡豆豉方的体内供试品溶
液。按照 1 mL/100 g 单次给药。各组分别于给药后
1 h 摘眼球取血,室温下静置 30 min,然后在 13 000
r/min 条件下离心 3 min,取上清液,−80 ℃冷藏备用。
2.4 血清样品的处理
取血清 2 mL,加 3 倍量乙腈,涡旋混合 5 min,
离心(13 000 r/min)5 min,取上清液在氮气流下吹
干(30 ℃),残渣加 100 μL 甲醇复溶,超声 3 min,
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涡旋 1 min,离心(13 000 r/min)3 min,取上清液,
备用,供 UFLC 分析。
2.5 色谱条件
色谱柱:Shimadzu Shim-pack XR-ODS(75
mm×3.0 mm,2.2 μm);流动相:乙腈(A)-0.1%
甲酸水溶液(B);梯度洗脱:0~8 min,5%~8% A;
8~21 min,8%~17% A;21~24 min,17%~18% A;
24~33 min,18%~40% A;33~38 min,40%~90%
A;体积流量 1.0 mL/min;检测波长 254 nm;柱温
35 ℃;进样量 5 μL。
2.6 方法学考察
2.6.1 精密度试验 取同一份 ZDD 血清样品供试
品溶液,连续进样 6 次,记录色谱图,结果各共有
峰的相对保留时间的 RSD 均小于 0.4%,相对峰面
积的 RSD 均小于 2.8%,表明仪器精密度良好。
2.6.2 重复性试验 取同一批次 ZDD 血清样品,
按上述血清样品处理方法制备 6 份供试品溶液,进
样分析,记录色谱图,结果各共有峰的相对保留时
间的 RSD 均小于 0.8%,相对峰面积的 RSD 均小于
3.0%,表明方法重复性良好。
2.6.3 稳定性试验 将同一份 ZDD 血清样品供试
品溶液,分别于 0、2、4、8 和 12 h 进样分析,记
录色谱图,结果各共有峰的相对保留时间的 RSD 均
小于 0.6%,相对峰面积的 RSD 均小于 3.0%,表明
供试品溶液在测定的 12 h 内稳定性良好。
2.7 ZDD 及其血清中成分的分析
取 3 批 ZDD 体外供试品溶液,以及 5 批 ZDD
血清样品在相同的色谱条件下进样分析,建立
UFLC 色谱图,比较分析确定入血成分。进而,通
过各缺味方、各单味药体外供试品溶液及其血清样
品的测定,综合比较分析相应的色谱图,确定各入
血成分的生药来源。
3 结果与讨论
实验对最佳采血时间进行了考察,分别于 ig 后
0.17、0.5、1、2、3、4 h 取血,结果表明,给药后
1 h 的血清样品中,ZDD 的血中移行成分最多,且
各成分色谱峰响应值较高,最适于分析,因此,选
定 1 h 为最佳采血时间。
通过指纹图谱的方法研究分析了 ZDD 的入血
成分,结果表明,大鼠 ig 给予 ZDD 后血中出现了
21 个移行成分(图 1),与体外样品比较可知,其中
9 个为体外成分直接吸收入血,即 2、7、8、13~15、
17~19 号峰所对应的成分为 ZDD 中所含的原型成
2-京尼平苷 18-芦荟大黄素 19-大黄酸,下图同
2-geniposide 18-aloe emodin 19-rhein, following figures are same
图 1 空白血清 (A)、ZDD 含药血清 (B)、ZDD (C) 和混合
对照品 (D) 的 UFLC 图
Fig. 1 UFLC of blank serum (A), serum after ZDD treatment
(B), ZDD (C), and mixed reference substances (D)
分,而其他 12 个成分色谱峰推测为复方原型成分经
代谢转化而生成的代谢产物。经与混合对照品溶液
色谱图对照可知,原型成分中的 2、18、19 号峰分
别为京尼平苷、芦荟大黄素和大黄酸。2 和 13 号峰
(原型成分)转运入血后的相对含量明显下降,其原
因可能是二者在大鼠体内部分代谢转化为其他化学
成分,例如,已有报道显示京尼平苷(2 号峰)在
肠道 β-葡萄糖苷酶的作用下代谢为京尼平[14];而 19
号峰(大黄酸)入血后的相对含量则有较大的提高,
分析其原因可能是其他蒽醌类成分在体内经肠道菌
群代谢转化成为大黄酸,其代谢机制尚需进一步探
讨。此外,ZDD 体外样品中响应较高的原型成分 I
和 II 在血清样品中并未被检出,推测二者转运入血
能力较弱或是在体内代谢为其他药效活性成分。
综合比较 ZDD、ZDD 缺味方及各单味药的体
外样品和给药后血清样品色谱图可知(表 1):2 号
峰为栀子所含成分直接入血而形成,20 号峰为栀子
吸收入血后的代谢成分(图 2、3);15、17~19 号
峰为大黄所含成分直接入血而形成,10、12、16 号
峰为大黄入血后形成的代谢产物(图 4、5);6 号峰
为枳实所含成分入血代谢后产生(图 6、7);7 号峰
为淡豆豉所含成分直接入血而形成,3~5、11 号峰
为淡豆豉入血后形成的代谢产物(图 8、9);1、8、
13 号峰为大黄和枳实共同产生的入血成分;9 号峰
为大黄和淡豆豉中所含成分入血代谢产生;14 号峰
为枳实和淡豆豉共同产生的入血成分;21 号峰为大
1 2 3 4 5 6
7
8
9
10 11 12 13 14 15
16 1718
19
20 21
2
1819
D
C
B
A
0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0
t / min
I
II
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表 1 血中各移行成分的药材归属与判断
Table 1 Medicinal material assignment and identification
of blood transitional constituents
峰号 tR / min 归属药材 推测化合物
1 4.286 大黄、枳实 未知
2 8.885 栀子 京尼平苷
3 11.292 豆豉 未知
4 12.857 豆豉 未知
5 14.543 豆豉 未知
6 14.714 枳实 未知
7 15.229 豆豉 未知
8 16.928 大黄、枳实 未知
9 17.571 大黄、淡豆豉 未知
10 18.171 大黄 未知
11 18.802 豆豉 未知
12 22.285 大黄 未知
13 23.810 大黄、枳实 未知
14 27.499 枳实、淡豆豉 未知
15 28.686 大黄 未知
16 29.023 大黄 未知
17 30.706 大黄 未知
18 31.629 大黄 芦荟大黄素
19 33.011 大黄 大黄酸
20 35.426 栀子 未知
21 37.687 大黄、枳实、淡豆豉 未知
图 2 ZDD (A)、ZDD 缺栀子 (B) 和栀子 (C) 体外供试品
溶液的 UFLC 图
Fig. 2 UFLC of in vitro samples of ZDD (A), ZDD decoction
without GJE (B), and GJE decoction (C)
黄、枳实和淡豆豉 3 味药材共同产生的代谢物。栀
子虽为方中主药,但其对复方血中移行成分的贡献
却相对较小,分析原因可能一方面是由于栀子所含
成分多为极性较大的化合物,血清样品中受干扰较
大,另一方面,推测栀子在 ZDD 中的作用并非主
要依靠自身成分入血来发挥,而很有可能是通过调
图 3 空白血清 (A)、ZDD 含药血清 (B)、ZDD 缺栀子含
药血清 (C) 和栀子含药血清 (D) 的 UFLC 图
Fig. 3 UFLC of blank serum (A), serum after ZDD treatment
(B), serum after ZDD treatment without GJE (C),
and serum after GJE treatment (D)
图 4 ZDD (A)、ZDD 缺大黄 (B) 和大黄 (C) 体外供试品
溶液的 UFLC 图
Fig. 4 UFLC of in vitro samples of ZDD (A), ZDD decoction
without RPL (B), and RPL decoction (C)
图 5 空白血清 (A)、ZDD 含药血清 (B)、ZDD 缺大黄含
药血清 (C) 和大黄含药血清 (D) 的 UFLC 图
Fig. 5 UFLC of blank serum (A), serum after ZDD treatment
(B), serum after ZDD treatment without RPL (C), and
serum after RPL treatment (D)
2
0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0
t / min
A
B
C
0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0
2 20
t / min
D
C
B
A
0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0
t / min
8
13 15
17 18
19
C
B
A
0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0
t / min
1 8910 12 13 15
16 1718
19 21
D
C
B
A
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图 6 ZDD (A)、ZDD 缺枳实 (B) 和枳实 (C) 体外供试品
溶液的 UFLC 图
Fig. 6 UFLC in vitro samples of ZDD (A), ZDD without
CAL (B), and CAL (C)
图 7 空白血清 (A)、ZDD 含药血清 (B)、ZDD 缺枳实含
药血清 (C) 和枳实含药血清 (D) 的 UFLC 图
Fig. 7 UFLC of blank serum (A), serum after ZDD treatment
(B), serum after ZDD treatment without CAL (C),
and serum after CAL treatment (D)
图 8 ZDD (A)、ZDD 缺淡豆豉 (B) 和淡豆豉 (C) 体外供
试品溶液的 UFLC 图
Fig. 8 UFLC of in vitro samples of ZDD (A), ZDD without
SSP (B), and SSP (C)
图 9 空白血清 (A)、ZDD 含药血清 (B)、ZDD 缺淡豆豉含药
血清 (C) 和淡豆豉含药血清 (D) 的 UFLC 图
Fig. 9 UFLC of blank serum (A), serum after ZDD treatment
(B), serum after ZDD treatment without SSP (C),
and serum after SSP treatment (D)
节其他组成药味中所含有效成分的溶出及转运入血
来发挥药效。
中药血清药物化学研究旨在通过血中移行成
分的分析最终确定中药的药效物质基础。本实验
依据中药血清药物化学研究思路,运用 UFLC 法
对大鼠口服 ZDD 后的血中移行成分进行分析,初
步阐明了 ZDD 含药血清中的部分化学成分及其
来源,为该方体内药效物质的研究奠定了基础。
然而,药物血清化学成分的分析存在着含量低、
组分多、分离难的特点,LC 法仅适用于血清中有
紫外吸收的成分,且灵敏度较低,亦无法对代谢
产物进行定性[6]。因此,有待于结合 LC-MSn 等更
为灵敏的分析手段,进一步探究 ZDD 的体内效应
物质。
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0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0
t / min
C
B
A
13
0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0
1 8 6 13 14 21
A
B
C
D
t / min
0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0
t / min
A
B
C
14 7
0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0
C
D
B
A
3 4
5
7
9 11 14 21
t / min
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