全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 13 期 2016 年 7 月

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• 药材与资源 •
基于多基因组片段构建枸杞属药用植物 DNA 条形码
倪梁红，赵志礼*，陆佳妮
上海中医药大学中药学院 生药学教研室，上海 201203
摘 要：目的 采用核基因组核糖体 DNA ITS 区、叶绿体基因组 9 个 DNA 片段和线粒体基因组 2 个 DNA 片段构建国产
枸杞属药用植物 DNA 条形码。方法 采集枸杞属黑果枸杞 Lycium ruthenicum、黄果枸杞 L. barbarum var. auranticarpum、
宁夏枸杞 L. barbarum、枸杞 L. chinense 和新疆枸杞 L. dasystemum 5 个分类群标本及实验样品，测定各样品的核糖体 ITS
区，叶绿体 matK、rbcL、rpoC1、trnL(UAA)intron、psbA-trnH、atpB-rbcL、trnS(GCU)-trnG(UCC)、rpl20-rps12、trnL(UAA)-
trnF(GAA)和线粒体 nad1 第 2 内含子、nad5 第 4 内含子序列；以全萼秦艽 Gentiana lhassica 为外类群，进行系统学分析。
结果 共获得 108 条序列，ITS 区变异位点最为丰富；筛选出 6 个叶绿体 DNA 片段；2 个线粒体 DNA 片段可作为该属 3 个物种
的条形码推荐序列；构建各物种多基因组多片段组合 DNA 条形码。结论 ITS 区及筛选的 6 个叶绿体 DNA 片段均具有物种鉴别
意义；2 个线粒体 DNA 片段具有一定鉴别意义；为枸杞类物种鉴定及遗传背景分析提供基础资料。
关键词：枸杞属；ITS；叶绿体 DNA；线粒体 DNA；DNA 条形码
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2016)13 - 2328 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.13.021
DNA barcoding construction of medicinal plants in genus Lycium L. based on
multiple genomic segments
NI Liang-hong, ZHAO Zhi-li, LU Jia-ni
Department of Pharmacognosy, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China
Abstract: Objective To construct the DNA barcoding of medicinal plants in genus Lycium L. from China based on sequences of
ITS, nine chloroplast DNA segments, and two mitochondrial DNA segments. Methods Specimens and samples of Lycium
ruthenicum, L. barbarum var. auranticarpum, L. barbarum, L. chinense, and L. dasystemum were collected and nuclear DNA ITS,
chloroplast DNA matK, rbcL, rpoC1, trnL (UAA) intron, psbA-trnH, atpB-rbcL, trnS (GCU)-trnG (UCC), rpl20-rps12, trnL
(UAA)-trnF (GAA), and mitochondrial DNA nad1/b-c and nad5/d-e were sequenced from these samples. Gentiana lhassica was used
as the external group to make statistical analysis. Results One hundred and eight sequences were obtained. The mutation site of ITS
region was the most abundant; The six chloroplast DNA fragments were selected; Two mitochondrial DNA fragments could be used as
the bar code recommendation sequences of the three species from the genus, and the multiple genomic and multi fragment combination
DNA bar code of each species was constructed. Conclusion ITS region and the screening of six chloroplast DNA fragments have the
significance of species identification; The two mitochondrial DNA fragments have a certain significance. The study may provide the
reference for the species identification and genetic background of the plants in Lycium L. from China.
Key words: Lycium L.; ITS; chloroplast DNA; mitochondrial DNA; DNA barcoding

茄科（Solanaceae）枸杞属 Lycium L. 植物国产
7 种 3 变种；其果实、根或叶在各地多药用或作为
保健品食用，具有很高的药用及经济价值[1]。《中国
药典》2015 年版[2]规定中药枸杞子的基原植物为该
属宁夏枸杞 Lycium barbarum L.，但实际应用情况
较为复杂，该属一些近缘植物的红色果实亦作为混
淆品使用[3]。同时，宁夏枸杞及枸杞 Lycium chinense
Mill. 的干燥根皮作为中药地骨皮入药。
因枸杞属植物近缘物种形态相近，营养器官变
异幅度较大，加上产地、环境等因素的影响，应用

收稿日期：2015-12-30
基金项目：国家自然科学基金资助项目（81173654）
作者简介：倪梁红（1980—），男，讲师，研究方向为民族药资源与品种鉴定。
*通信作者 赵志礼，男，教授，博士生导师，从事中药资源与品种鉴定研究。Tel: (021)51322202 E-mail: zhilzhao@sohu.com
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传统鉴定方法存在一定局限性。近年来，随着分子
生物学技术的快速发展，植物 DNA 序列被大量应
用于药用植物的分子鉴定，显示出极大的优势[4-6]。
然而，对于亲缘关系相近的物种，仅凭单一 DNA
序列片段常无法提供很好的物种分辨率；往往通过
筛选大量多基因组序列，寻找多片段组合有效物种
鉴定信息，以提升鉴别效率。
目前，已有学者[3]进行枸杞类核基因组 ITS2 条
形码鉴定等工作，取得一定进展。在参考国内外相
关研究工作的基础上，本课题组扩大国产枸杞属近
缘物种采集数量，并进一步开展了核基因组 ITS 区、
叶绿体基因组 matK、rbcL、rpoC1、trnL(UAA)intron、
psbA-trnH 、 atpB-rbcL 、 trnS(GCU)-trnG(UCC) 、
rpl20-rps12、trnL(UAA)-trnF(GAA)及线粒体基因组
nad1 第 2 内含子（nad1/b-c）和 nad5 第 4 内含子
（nad5/d-e）序列（共 12 个片段）的筛选，评价各
片段的物种鉴定意义，寻找稳定、高效的片段组合，
构建各物种的 DNA 条形码，以期为国产枸杞属药
用植物物种鉴定及遗传背景分析提供基础资料。
1 材料
标本均为自采，同时取新鲜叶片，经硅胶快速
干燥，备用。凭证标本经赵志礼教授鉴定，存放于
上海中医药大学中药学院药用植物标本室，样品信
息及鉴定结果见表 1。
表 1 样品与凭证标本
Table 1 Samples and voucher specimens
植物名称 凭证标本 采集地
黑果枸杞 Lycium ruthenicum NX2015001 宁夏同心县河西镇
黄果枸杞 L. barbarum var. auranticarpum NX2015002 宁夏同心县河西镇
NX2015003-1 宁夏同心县河西镇 宁夏枸杞-1 L. barbarum
宁夏枸杞-2 L. barbarum NX2015003-2 宁夏同心县河西镇
SH2015001 上海中医药大学百草园 枸杞-1 L. chinense
枸杞-2 L. chinense SH2015002 上海中医药大学百草园
2015LZ001-1 甘肃兰州白塔山 新疆枸杞-1 L. dasystemum
新疆枸杞-2 L. dasystemum 2015LZ001-2 甘肃兰州白塔山
全萼秦艽 Gentiana lhassica（外类群） XZ201303-1 西藏米拉山口山坡草地

2 方法
2.1 总 DNA 提取
取上述干燥植物叶片，液氮中研磨成粉末，采
用改良 CTAB 法[7]进行总 DNA 提取。
2.2 PCR 扩增和测序
对核糖体 ITS 区、叶绿体 matK、rbcL、rpoC1、
trnL(UAA)intron、psbA-trnH、atpB-rbcL、trnS(GCU)-
trnG(UCC)、rpl20-rps12、trnL(UAA)-trnF(GAA)
及线粒体 nad1/b-c 和 nad5/d-e 共 12 个片段进行扩
增，引物及 PCR 反应条件参考相关文献方法[8-9]。
扩增产物经电泳确认有清晰目的条带后送上海
生工生物有限公司纯化并测序（ABI 3730xl 型测
序仪）。
2.3 序列数据分析
各片段的起止范围参考 GenBank 中相关序列。
应用 MEGA 5.03 软件计算 ITS 区各段的碱基量，并
计算成对比较时的位点变异值及 K2P 遗传距离。各
物种的 ITS 区、叶绿体 DNA 和线粒体 DNA 序列分
别应用 ClustalW 对齐，分析变异位点。
3 结果与分析
3.1 序列的获得
直接测序法获得 108 条序列，全部上传至
GenBank，共获得 108 个登录号（表 2）。物种内各
样品间序列均分别一致。
3.2 序列分析
3.2.1 ITS 区序列分析 ITS 区序列分析显示，枸杞
属 5 种样品的 ITS 区长度范围在 611～630 bp，其中
ITS1 长度为 222～241 bp，5.8 S 区均为 164 bp，ITS2
长度为 220～225 bp。任意两组序列比较，均有位点
变异情况，变异位点数为 14～56；同时，每个物种
均有可与其他 4 个物种区分的鉴别位点，其中新疆
枸杞鉴别位点最为丰富，共有 22 个。K2P 遗传距
离变异幅度为 0.025～0.107，新疆枸杞与其他物种
的遗传距离相对较远（表 3 和表 4）。
3.2.2 叶绿体DNA序列分析 基于叶绿体DNA序列
比对，各物种的 atpB-rbcL、rpoC1 和 rbcL 序列分别
完全一致，无变异位点；而其他 6 个片段均具有变异
位点，且每个物种均具有鉴别位点（表 5）。基于 trnL
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表 2 序列 GenBank 登录号
Table 2 GenBank accession numbers
物种 ITS matK rpoC1 trnL rbcL trnS-trnG psbA-trnH atpB-rbcL rpl20-rps12 trnL-trnF nad1/b-c nad5/d-e
黑果枸杞 KT906358 KT906308 KT906328 KT906333 KT906318 KT906343 KT906313 KT906303 KT906323 KT906338 KT906348 KT906353
黄果枸杞 KT906359 KT906309 KT906329 KT906334 KT906319 KT906344 KT906314 KT906304 KT906324 KT906339 KT906349 KT906354
宁夏枸杞-1 KT906360 KT906310 KT906330 KT906335 KT906320 KT906345 KT906315 KT906305 KT906325 KT906340 KT906350 KT906355
宁夏枸杞-2 KU314470 KU314446 KU314458 KU314461 KU314452 KU314467 KU314449 KU314443 KU314455 KU314464 KU314473 KU314476
枸杞-1 KT906361 KT906311 KT906331 KT906336 KT906321 KT906346 KT906316 KT906306 KT906326 KT906341 KT906351 KT906356
枸杞-2 KU314471 KU314447 KU314459 KU314462 KU314453 KU314468 KU314450 KU314444 KU314456 KU314465 KU314474 KU314477
新疆枸杞-1 KT906362 KT906312 KT906332 KT906337 KT906322 KT906347 KT906317 KT906307 KT906327 KT906342 KT906352 KT906357
新疆枸杞-2 KU314472 KU314448 KU314460 KU314463 KU314454 KU314469 KU314451 KU314445 KU314457 KU314466 KU314475 KU314478
全萼秦艽 KJ947801 KJ947441 KJ947631 KJ947676 KJ947541 KJ947766 KJ947491 KJ947394 KJ947586 KJ947721 KP718881 KR184744
表 3 ITS 区序列信息
Table 3 Basic information of ITS sequences
占比/% 长度/bp 物种
T C A G ITS1 5.8 S ITS2 总长 鉴别位点数
黑果枸杞 19.31 32.57 18.49 29.62 222 164 225 611 7
黄果枸杞 19.42 32.04 18.93 29.61 229 164 225 618 5
宁夏枸杞 20.32 31.04 19.04 29.60 241 164 220 625 18
枸杞 18.25 33.81 17.14 30.79 241 164 225 630 7
新疆枸杞 20.00 32.06 19.68 28.25 241 164 225 630 22
表 4 ITS 序列成对比较时的位点变异值 (上三角：变异位点；下三角：K2P 遗传距离)
Table 4 Pairwise comparison on ITS sequences of point mutations (above diagonal) and K2P genetic distance (below diagonal)
物种 黑果枸杞 黄果枸杞 宁夏枸杞 枸杞 新疆枸杞
黑果枸杞 — 14 53 33 56
黄果枸杞 0.025 — 48 34 55
宁夏枸杞 0.098 0.088 — 38 54
枸杞 0.059 0.061 0.069 — 41
新疆枸杞 0.107 0.102 0.100 0.075 —
表 5 叶绿体 DNA 片段变异位点信息
Table 5 Variable sites of chloroplast DNA segments
matK/bp rpl20-rps12/bp trnL/bp trnL-trnF/bp trnS-trnG/bp psbA-trnH/bp 物种
206 508 61c 208d 681 159a 381 31 306b 311 377 429e 10 个位点 b 220 313
黑果枸杞 C G C C T A C C A A A C — G G
黄果枸杞 C G C C T G C C G A A C * G G
宁夏枸杞 A A A C C G T A A T T C — T T
枸杞 A A C A C G T A A T A C — G T
新疆枸杞 A A C C C G T A A T T A — T T
a-黑果枸杞鉴别位点 b-黄果枸杞鉴别位点 c-宁夏枸杞鉴别位点 d-枸杞鉴别位点 e-新疆枸杞鉴别位点 *黄果枸杞的 10 个鉴别位点
a-black fruit wolfberry loci identified b-cambogia wolfberry differential sites c-means Ningxia wolfberry differential sites d-lysergic wolfberry
differential sites EUI of L.barbarum differential sites *psbA-trnH sequence cambogia medlar ten loci identified
(UAA)intron 片段可鉴别黑果枸杞；trnL(UAA)-
trnF(GAA) 和 psbA-trnH 片段均可鉴别黄果枸杞；
rpl20-rps12 片 段 可 鉴 别 宁 夏 枸 杞 和 枸 杞 ；
trnS(GCU)-trnG(UCC)片段可鉴别新疆枸杞。黄果枸
杞的鉴别位点最为丰富，其中 trnL(UAA)-trnF(GAA)
片段中有 1 个，psbA-trnH 片段中有 10 个。
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3.2.3 线粒体DNA序列分析 基于线粒体DNA序
列比对，nad1/b-c 片段具有 1 个变异位点；nad5/d-e
片段具有 3 个变异位点，基于此 2 个片段可鉴别枸
杞和黄果枸杞（表 6）。
3.2.4 各物种多片段组合 DNA 条形码序列 综合
以上分析，ITS 区及筛选出的 6 个叶绿体 DNA 片段
均具有物种鉴别意义；线粒体 DNA 2 个片段可鉴别
枸杞、黑果枸杞和黄果枸杞，但不能区别宁夏枸杞
及新疆枸杞 2 个物种。为提高 DNA 条形码的实用
性及可操作性，分别选取各基因组鉴别位点最为丰
富的片段，进一步优化组合，提出该物种的 DNA
条形码鉴定序列（表 7）。
表 6 线粒体 DNA 片段变异位点信息
Table 6 Variable sites of mitochondrial DNA segments
nad5/d-e 变异位点/bp nad1/b-c 变异位点物种
597a 704 880b 902
黑果枸杞 T A A T
黄果枸杞 T A C T
宁夏枸杞 T C A G
枸杞 G C A G
新疆枸杞 T C A G
a-枸杞鉴别位点 b-黄果枸杞鉴别位点
a-lysergic wolfberry differential sites EUI of L.barbarum
differential sites b-cambogia wolfberry differential sites
表 7 枸杞属 5 种植物物种鉴定 DNA 条形码推荐序列组合
Table 7 Proposed DNA barcoding markers for five taxa of
Lycium L.
物种 序列组合
黑果枸杞 ITS、trnL(UAA)intron、nad5/d-e、nad1/b-c
黄果枸杞 ITS、psbA-trnH、nad5/d-e、nad1/b-c
宁夏枸杞 ITS、rpl20-rps12
枸杞 ITS、rpl20-rps12、nad5/d-e、nad1/b-c
新疆枸杞 ITS、trnS(GCU)-trnG(UCC)

3.3 NJ 系统树
分别将各样品的 ITS 区、9 个叶绿体片段和 2 个
线粒体片段组合，以全萼秦艽为外类群，基于所有序
列构建 NJ 系统树（Kimura 2-parameter 模型，bootstrap
1 000 次重复）。结果显示，外类群首先单独区分开；
宁夏枸杞和新疆枸杞聚为一小支，再与枸杞聚为一
支；黑果枸杞和黄果枸杞聚为一支（图 1）。
4 讨论
鉴于植物物种进化程度、物种数量的多样性
及各自遗传背景的复杂性等，构建相应的 DNA 条

图 1 基于所有 DNA 序列构建的 NJ 系统树
Fig. 1 NJ phylogenetic tree based on all DNA sequences
形码是一项长期艰巨的系统工作。核基因组核糖
体 DNA ITS 区因其具多拷贝[10]，易扩增、进化速
率快及变异位点丰富等特点，常被用作构建条形
码的候选序列。但双亲遗传，存在杂合现象，较
易受环境等因素影响而发生变异。而被子植物叶
绿体和线粒体 DNA 均为单亲遗传，不存在序列杂
合的影响[11]，且序列较为保守。同时，对来源于植
物地下部分的药材（如根、根茎类等）而言，获取
线粒体 DNA 鉴定信息更为可行[12]。
本实验分别评价了3个基因组12个片段的枸杞
属物种鉴别意义，即具物种分辨率的 ITS 区序列及
筛选出的 6 个叶绿体 DNA 片段；线粒体 DNA 2 个
片段可鉴别枸杞、黑果枸杞和黄果枸杞，但不能区
别宁夏枸杞及新疆枸杞 2 个物种。为提高 DNA 条
形码的实用性及可操作性，分别选取各基因组鉴别
位点最为丰富的片段，进一步优化组合，提出了该
物种的 DNA 条形码鉴定序列，以提升这些条形码
的实际应用价值。同时，本实验可为枸杞类遗传背
景分析提供基础资料。
据《中国植物志》记载，黄果枸杞为宁夏枸杞
一变种，与原种的主要区别在于叶形狭窄，果实橙
黄色，种子较少[1]。而在上述 NJ 系统树中，黄果枸
杞和黑果枸杞聚为一支，与宁夏枸杞相对较远，在
基因水平上显示了显著的物种间断特性，提示该分
类群可能为一与黑果枸杞近缘的独立物种。陈天云
等[13]发表一新种小叶黄果枸杞，据原始文献描述，
该新种与宁夏枸杞相接近，且模式标本采自中宁县；
然而令人遗憾的是并未指出其与黄果枸杞的系统关
系。本实验 DNA 数据似支持黄果枸杞独立为一个
物种。当务之急是开展该分类群系统位置及合法名
称的进一步确定；黄色果实品质的深入评价、栽培
学研究及市场开发可行性的分析等。
宁夏枸杞-1（NX2015003-1）
宁夏枸杞-2（NX2015003-2）
新疆枸杞-1（2015LZ001-1）
新疆枸杞-2（2015LZ001-2）
枸杞-1（SH2015001）
枸杞-2（SH2015002）
黑果枸杞-1（NX2015001）
黄果枸杞-2（NX2015002）
全萼秦艽（XZ201303-1）
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枸杞属植物栽培历史悠久，同一物种具有不同
的品种（系），品种（系）间遗传背景复杂多样，给
应用分子手段进行种间区分带来一定难度，特别是
变种与原变种的区分[14-15]。下一步需加大样本量，
广泛筛选更多 DNA 片段，为解决复杂的品种鉴定
问题提供坚实的基础资料。
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