全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 9 期 2014 年 5 月

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芪骨胶囊 HPLC 指纹图谱研究
范 兴 1，杨成梓 1*，包侠萍 2，南淑华 2
1. 福建中医药大学药学院，福建 福州 350122
2. 厦门中药厂有限公司，福建 厦门 361100
摘 要：目的 建立芪骨胶囊 HPLC 指纹图谱，为评价其质量提供依据。方法 Platisil-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；
以甲醇-乙腈-水为流动相梯度洗脱；柱温 30 ℃；体积流量 1.0 mL/min；检测波长 270 nm。结果 建立了 15 批芪骨胶囊的
对照指纹图谱，确定了 16 个共有峰，其中 15 个归属到各药材，其相似度均大于 0.9。通过对照品对照、UFLC-ESI-MS/MS
鉴定了其中 8 个色谱峰的化学成分。通过聚类分析，15 批芪骨胶囊可分为 3 类。结论 该方法操作简便、准确可靠、重复
性较好，为芪骨胶囊的质量控制提供了有效手段。
关键词：芪骨胶囊；HPLC；指纹图谱；UFLC-ESI-MS/MS；聚类分析；质量控制
中图分类号：R286.02 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)09 - 1257 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.09.011
HPLC fingerprint of Qigu Capsules
FAN Xing1, YANG Cheng-zi1, BAO Xia-ping2, NAN Shu-hua2
1. College of Pharmacy, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, China
2. Xiamen Chinese Materia Medica Co., Ltd., Xiamen 361100, China
Abstract: Objective To establish the HPLC fingerprint of Qigu Capsules for its quality control. Methods Platisil-C18 column (250
mm × 4.6 mm, 5 μm) was used with acetonitrile-methanol-water in gradient elution mode. The detective wavelength was 270 nm, the
column temperature was set at 30 ℃, and the flow rate was 1.0 mL/min. Results Fingerprints of 15 batches of Qigu Capsules were
established and 16 common peaks were identified, 15 of which belonged to herbs. The similarity was more than 0.9. Eight chemical
compounds were identified by comparing the reference substance with UFLC-ESI-MS/MS. Sixteen samples were classified into three
groups based on cluster analysis. Conclusion The method can be used for the quality control of Qigu Capsules with good precision,
accuracy, and reproducibility.
Key words: Qigu Capsules; HPLC; fingerprint; UFLC-ESI-MS/MS; cluster analysis; quality control

芪骨胶囊是上海名中医石印玉教授在长期的临
床实践中摸索出来的经验方。该药由淫羊藿、肉苁
蓉、制首乌、骨碎补、黄芪、石斛、菊花 7 味中药
组成，具有补肾壮骨的功效，主要适用于中医辨证
属于肝肾不足证型的原发性骨质疏松症[1]。
目前芪骨胶囊的企业质量控制方法采用 TLC
法对成品中黄芪等药材进行定性鉴别，采用 HPLC
法对方中淫羊藿苷进行定量测定，但由 7 味药物
组成的芪骨胶囊成分复杂，仅以一两种有效成分
不能从整体上反应其内在质量。本实验对芪骨胶
囊开展 HPLC 指纹图谱研究，并对指纹图谱中主
要特征峰进行化学指认以及组方中药来源的初步
确定，综合运用相似度评价、聚类分析等识别技
术，为制定全面而整体的芪骨胶囊质量控制方法
提供实验依据。
1 仪器与材料
HPLC—20AT 高效液相色谱分析仪、UFLC—
20A 高效液相色谱仪，日本岛津公司；API 3200 三
重四极杆串联质谱仪（美国 AB 公司）；KQ—250E
型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；电子
分析天平（北京赛多利斯天平有限公司）。
柚皮苷（批号 20120221，质量分数≥98%）、

收稿日期：2013-11-14
基金项目：福建省科技厅对外合作重点项目（2012I0004）
作者简介：范 兴（1987—），男，硕士研究生，研究方向为中药资源及品质评价。Tel: 15806020326 E-mail: yunshuiyuan0123@126.com
*通信作者 杨成梓（1972—），男，副教授。Tel: 13600871781 E-mail: tiebaojin@163.com
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松果菊苷（批号 20121125，质量分数≥98%）、朝
藿定 B（批号 20120928，质量分数≥98%）、朝藿定
C（批号 20120618，质量分数≥98%）、淫羊藿苷（批
号 20120706，质量分数≥98%），均购自上海源叶
生物科技有限公司；15 批芪骨胶囊（批号 S1：
110101-1、S2：110701、S3：111101、S4：120301、
S5：120401、S6：120501、S7：120503、S8：120505、
S9：120701、S10：121101、S11：121201、S12：
130101、S13：130102、S14：130301、S15：130302），
单味药以及阴性药均由厦门中药厂有限公司提供；
各单味药淫羊藿、肉苁蓉、制首乌、骨碎补、黄芪、
石斛、菊花均经福建中医药大学药学院杨成梓副教
授鉴定，分别为小檗科淫羊藿属植物淫羊藿
Epimedium brevicornum Maxim. 的干燥叶、列当科
肉苁蓉属植物肉苁蓉 Cistanche deserticola Y. C. Ma
的干燥带鳞叶的肉质茎、蓼科何首乌属植物何首乌
Polygonum multiflorum Thunb. 的干燥块根的炮制
加工品（符合《中国药典》2010 年版规定）、水龙
骨科骨碎补属植物槲蕨 Drynaria fortune (Kunze) J.
Sm. 的干燥根茎、豆科黄芪属植物膜荚黄芪
Astragalus membranaceus (Fisch.) Bunge 的干燥根、
兰科石斛属植物金钗石斛 Dendrvbium nobile Lindl.
的干燥茎、菊科菊属植物菊 Chrysanthemum
morifolium Ramat. 的干燥头状花序。
甲醇、乙腈为色谱纯，水为纯化水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱为 Platisil-C18 柱（250 mm×4.6 mm，5
μm）；以甲醇-乙腈-水为流动相，按表 1 程序进行梯
度洗脱；体积流量为 1 mL/min；柱温为 30 ℃；检
测波长为 270 nm；进样量为 10 μL。
2.2 质谱条件
离子源扫：ESI；描方式：正、负离子扫描；减
簇电压（DP）：50 V；Q1 入口电压（EP）：10 V；

表 1 流动相梯度洗脱条件
Table 1 Gradient elution conditions of flow phase
t / min
甲醇 /
%
乙腈 /
%
水 /
%
t / min
甲醇 /
%
乙腈 /
%
水 /
%
0 4 1 95 47 17 26 57
10 11 7 82 57 25 34 41
33 13 19 68 67 50 33 17
37 13 22 65
碰撞室入口电压（CEP）：10 V；碰撞室出口电压
（CXP）：2.0 V；离子源电压（IS）：5 500 V；碰撞
电压（CAD）：8.0 V；温度（TEM）：500 ℃；气帘
气（CUR）：172.40 kPa；GS1：344.80 kPa；GS2：
379.28 kPa；碰撞离子强度 CE：137.90 kPa。
2.3 对照品溶液的制备
取松果菊苷、柚皮苷、朝藿定 B、朝藿定 C、
淫羊藿苷对照品适量，精密称定，加甲醇配成质量
浓度分别为 310.73、62.99、37.78、86.33、97.59 μg/mL
的混合对照品溶液，过 0.45 μm 微孔滤膜，取续滤
液作为混合对照品溶液，即得。
2.4 供试品溶液的制备
取芪骨胶囊内容物约 0.55 g，精密称定，置具
塞锥形瓶中，精密加入 30 mL 甲醇，超声 30 min（50
℃，250 W，40 kHz），放冷，用甲醇补足减失的质
量，滤过，取续滤液，经 0.45 μm 微孔滤膜滤过，
取续滤液，备用。
2.5 单味药材与阴性供试液的制备
芪骨胶囊的各单味药材与阴性供试液的制备，
按芪骨胶囊的企业制备标准，并按“2.4“项下的方
法处理，即得单味药材与阴性供试液。
2.6 精密度试验
精密称定芪骨胶囊内容物（批号 110101-1）约
0.55 g，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”
项下条件连续进样 6 次，记录色谱图，以淫羊藿苷
为参照峰，考察各共有峰的相对保留时间和相对峰
面积的 RSD。结果各共有峰相对保留时间的 RSD
均＜0.12%，相对峰面积的 RSD 均＜2.31%，符合
指纹图谱要求，表明仪器精密度良好。
2.7 重复性试验
精密称定芪骨胶囊内容物（批号 110101-1）约
0.55 g，按“2.4”项下分别制备供试品 6 份，按“2.1”
项下条件进样分析，以淫羊藿苷为参照峰，结果各
共有峰相对保留时间的 RSD 均＜0.13%，相对峰面
积的 RSD 均＜3.65%，符合指纹图谱要求，表明仪
器精密度良好。
2.8 稳定性试验
精密称定芪骨胶囊内容物（批号 110101-1）约
0.55 g，按“2.4”项下制备供试品溶液，分别于 0、
2、4、8、12、24 h 进样，以淫羊藿苷为参照峰，结
果各峰相对保留时间的 RSD 均＜0.11%，相对峰面
积的 RSD 均＜2.59%，符合指纹图谱技术要求，表
明供试品溶液在 24 h 内稳定。
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2.9 指纹图谱的建立与共有峰的确定
分别制备 15 批芪骨胶囊供试品溶液，按“2.1”
项色谱条件测定，记录色谱图。根据 15 批芪骨胶囊
HPLC 指纹图谱的检测结果，生成芪骨胶囊共有模
式的对照指纹图谱。
分析 15 批芪骨胶囊 HPLC 色谱图，因为 16
号峰（淫羊藿苷）是淫羊藿的主要成分，也是其主
要活性成分之一，且淫羊藿是复方的君药；淫羊藿
苷与相邻峰分离较好，其量较高且相对稳定，因此
以 16 号峰（淫羊藿苷）为参照峰（S 峰），将各色
谱峰保留时间和保留峰面积与同一图谱中 S 峰的
保留时间和保留峰面积比值，即得到相对保留时间
和相对峰面积，计算 15 批芪骨胶囊指纹图谱中各
色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，确定芪骨胶
囊指纹图谱中的 16 个色谱峰为其共有特征峰，见
图 1。




2-松果菊苷 9-柚皮苷 14-朝藿定 B 15-朝藿定 C 16-淫羊藿苷
2-echinacoside 9-naringin 14-epimedin B 15-eimedin C 16-icariin

图 1 混合对照品 (A) 与对照指纹图谱 (B)
Fig. 1 Chromatogram of mixture reference substances (A) and reference fingerprint (B) of Qigu Capsules

2.10 指纹图谱的相似度评价
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件
（2004A 版）将将 15 批不同批次芪骨胶囊指纹图谱
数据导入，以第 15 批药材图谱作为参照谱进行指纹
匹配，采用中位数法生成对照谱，匹配结果见图 2。
得出 15 批芪骨胶囊的相似度计算结果，见表 2。从
结果可以看出，相似度大于 0.9，表明 15 批胶囊的
化学成分分布较稳定。
2.11 指纹图谱共有峰的归属
分别精密吸取单味药材及阴性缺味供试品溶
液，注入液相色谱仪，采集色谱图。对保留时间一
致且阴性样品图谱中未出现的色谱峰进行分析比
较，并根据紫外光谱信息，确认指纹图谱共有峰的
药材归属。通过对比分析，结果表明在 16 个共有峰
中，峰 11、13、14、15、16 号峰来自淫羊藿药材；
峰 2、5、8 来自肉苁蓉药材；峰 4、9 来自骨碎补药




图 2 15 批芪骨胶囊的 HPLC 指纹图谱
Fig. 2 HPLC fingerprints of 15 batches of Qigu Capsules
2
9
A B
14
15
16 16 (S)
15
11 13 12
14
0 10 20 30 40 50 60 0 10 20 30 40 50 60
t / min
10
1
2
43
6
7 5 8
9
R
S15



↑



S1
0 9.71 19.42 29.13 38.84 48.55 58.26 67.98
t / min
1
2
34
5
6
7 8
9
10 11
16（S）
15
14
13
12
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表 2 15 批芪骨胶囊的相似度结果
Table 2 Similarities of 15 batches of Qigu Capsules
编号 相似度 编号 相似度 编号 相似度
S1 0.971 S6 0.964 S11 0.992
S2 0.987 S7 0.996 S12 0.984
S3 0.95 S8 0.964 S13 0.993
S4 0.944 S9 0.967 S14 0.992
S5 0.967 S10 0.972 S15 0.992

材；峰 3、12 来自黄芪药材；峰 7、10 来自菊花药
材；峰 6 来自制首乌药材，见图 3。
2.12 芪骨胶囊特征指纹峰的结构鉴定
2.12.1 对照品对照法 利用对照品对各峰的成分
进行指认，分别精密吸取供试品溶液、混合对照品
溶液各 10 μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，
见图 1。通过各峰保留时间定位和化学成分的 PDA
光谱图信息对比，对各峰进行指认。共指认了 5 个
色谱峰，分别为 2 号峰（松果菊苷）、9 号峰（柚皮
苷）、14 号峰（朝藿定 B）、15 号峰（朝藿定 C）、
16 号峰（淫羊藿苷）。



图 3 芪骨胶囊与各单味药 HPLC 图
Fig. 3 HPLC fingerprint of Qigu Capsules
and its single herb medicine

2.12.2 UFLC-ESI-MS/MS 成分鉴别 为进一步阐
明芪骨胶囊的化学组成，采用 UFLC-ESI-MS/MS 技
术对 HPLC 指纹图谱指认，由于芪骨胶囊中的化学
成分、结构差别较大，故同时采用正、负离子模式
进行扫描。通过质谱中分子离子峰和碎片离子峰的
分子量匹配，结合紫外吸收光谱特征，相关文献[2-6]
以及对照品对照，鉴定了芪骨胶囊指纹图谱中 8 个
色谱峰的化学成分，结果见表 3。

表 3 芪骨胶囊指纹图谱化学成分质谱归属
Table 3 MS attribution of chemical components in HPLC fingerprint of Qigu Capsules
峰号 t / min 化合物 相对分子质量 准分子离子峰 [M－H]−/ [M＋H]+ MS/MS (m/z)
2 29.06 松果菊苷 786 785.1 623.0、477.0
4 34.54 新北美圣草苷 596 597.0 451.5、435.1、289.0
5 34.99 毛蕊花糖苷 624 623.0 416.3、315.1
9 39.36 柚皮苷 580 581.1 527.1、419.3
13 53.09 朝藿定 A 838 839.0 531.1、369.1
14 54.05 朝藿定 B 808 809.3 531.4、369.2
15 55.02 朝藿定 C 822 823.4 531.1、369.1
16 55.99 淫羊藿苷 676 677.5 531.3、369.2

2.13 聚类分析
将峰面积数据标准化（即对同一变量减去其均
值，再除以标准差，以消除原始数据之间的量纲影
响），采用 SPSS 19.0 统计分析软件中的系统聚类法
中的类间平均链锁法，选取欧氏距离平方作为样品
测度。利用此方法对 15 批芪骨胶囊进行系统聚类分
析，绘出树状图，见图 4。由聚类结果可知：15 批
样品大体上分为 3 类，批次 S1、S2 与 S5～S15 归
为一类，说明 13 个批次的样品均较接近，S3、S4
分别单独归为一类，其中，S3 的 15 号峰比其他批
次高，S4 的 3、7、10 号峰较高。而且 S3、S4 的相

图 4 聚类分析树状图
Fig. 4 Dendrogram of cluster analysis
7 10
3
2 5
6
8
9 4
1 2
3 4 5
6
7 8
9
12
11 1314
15
16
10 11 1213
14
15
16 (S)
菊花
石斛
黄芪
淫羊藿
肉苁蓉
制首乌
骨碎补
芪骨胶囊
0 10 20 30 40 50 60
t / min
距离
0 5 10 15 20 25
S14
S15
S13
S10
S11
S12
S7
S9
S5
S6
S1
S8
S2
S3
S4
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似度在 15 批次中相对较小，说明聚类和相似度分析
结论基本一致，2 种方法得到了相互印证。
3 讨论
3.1 提取条件的优化
以 HPLC 图谱的出峰灵敏度和分离完整性为标
准，通过对不同溶媒进行筛选，结果以甲醇溶液提
取，效果较好。在提取方法上，对超声、回流与索
氏提取方法作了平行比较，结果显示甲醇超声 30
min 的提取方法总峰面积较大，提取效率较高，最
后选用甲醇超声 30 min 的提取方法。
3.2 色谱条件的优化
在流动相选择上，筛选了甲醇-乙腈与水、磷
酸溶液、冰醋酸及甲酸溶液等组合，结果以甲醇-
乙腈-水组合的梯度洗脱效果最佳。在检测波长选
择方面关注了各药材主要有效成分，分别对 208、
254、270、283、330 nm 进行筛选，确定检测波长
270 nm 比较适合，此时大部分色谱峰达到基线分
离，各色谱峰的吸收较强。
本实验建立了芪骨胶囊的 HPLC 指纹图谱，通
过相似度计算和聚类分析可知芪骨胶囊的批间稳定
性较高，故能够用来控制本品的质量，以保证不同
批次产品质量的一致性，从而为芪骨胶囊制备工艺
稳定性提供重要依据。
参考文献
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