全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46卷 第 21期 2015年 11月

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• 药剂与工艺 •
Box-Behnken设计-响应面法优化地龙活性组分的冻干工艺
陈立军 1, 3，黄文芳 1, 3，石召华 1, 2*
1. 武汉爱民制药有限公司，湖北 鄂州 436070
2. 湖北省天然组分药物工程技术研究中心，湖北 鄂州 436070
3. 湖北李时珍药物研究院，湖北 武汉 430061
摘 要：目的 优选地龙活性组分的冻干工艺。方法 采用单因素试验结合 Box-Behnken 响应面法，以冻干率为指标，考
察 1次升华温度、升华时间、解析干燥温度、解析干燥时间等因素对冻干工艺的影响，优化地龙活性组分的冻干工艺，采用
HPLC法，测定优化后工艺样品的指纹图谱，并比较其与地龙药材指纹图谱相似度，确定最佳冻干工艺。结果 确定地龙活
性组分的最佳冻干工艺条件：预冻温度−26.5 ℃，预冻 4 h，升华干燥温度−20 ℃、升华时间 7 h、解析干燥温度 30 ℃、解
析干燥时间 3.5 h，冻干率为 96.55%，与对照药材的氨基酸指纹图谱相似度均大于 0.9。结论 Box-Behnken响应面法用于地
龙活性组分冻干工艺条件的优选是可行的，模型预测效果较好，优化工艺具备可行性。
关键词：地龙；活性组分；指纹图谱；冷冻干燥；Box-Behnken响应面法
中图分类号：R284.2 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2015)21 - 3166 - 07
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2015.21.007
Optimization of technology of freeze-dried powder of various fractions from
Pheretima by Box-Behnken design and response surface method
CHEN Li-jun1, 3, HUANG Wen-fang1, 3, SHI Zhao-hua1, 2
1. Wuhan Aimin Pharmaceutical Co., Ltd., Ezhou 436070, China
2. Hubei Engineering Technology Centre of Natural Component Medicine, Ezhou 436070, China
3. Lishizhen Institute of Natural Medicine, Wuhan 430061, China
Abstract: Objective To optimize the technology of freeze-dried powder of various fractions from lumbricus (Pheretima) by
Box-Behnken design and response surface method. Methods Using single factor experiment with Box-Behnken response surface
method, freeze-dried rate as the index, the effects of sublimation temperature, sublimation time, analytical drying temperature, and
drying time on the freeze-drying process were observed; The freeze-drying process of the active components in lumbricus was
optimized; Using HPLC method, the fingerprint of the sample by the optimized technology was investigated, and the similarity of
fingerprint was compared with the earthworm medicine, and the optimum freeze-drying process was obtained. Results The best
freeze-drying process conditions of active components in lumbricus were as follows: frozen temperature of −26.5 ℃, precool for 4 h,
sublimation drying temperature of −20 ℃, sublimation time of 7 h, analytical drying temperature of 30 ℃, analytical drying time of
3.5 h, freeze-dried rate of 96.55%, and compared with medicinal materials of amino acid, the similarities of fingerprint were both
greater than 0.9. Conclusion Box-Behnken response surface method is used for the freeze-drying process conditions of active
components in the lumbricus, the optimization is feasible, the effect of model is good, and this optimization process has the feasibility.
Key words: lumbricus (Pheretima); active components; fingerprint; freeze-drying; Box-Behnken design and response surface method



收稿日期：2015-06-08
基金项目：国家“十二五”重大新药创制科技重大专项资助项目（2014ZX09201-022-03）；湖北省重大科技创新专项资助项目（2013ACC005）
作者简介：陈立军，工程师，从事中药及天然药物冻干制剂研究。Tel: 18071097003 E-mail: 0207130031@163.com
*通信作者 石召华，博士，高级工程师。Tel: (0711)3818216 E-mail: whimzy@163.com
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地 龙 为 钜 蚓 科 动 物 参 环 毛 蚓 Pheretima
aspergillum (E. Perrier)，习称“广地龙”[1]，性味咸
寒，现代药理研究表明，地龙具有溶栓、抗肿瘤、
增强免疫力、降压镇静、改善微循环和心脑血管病
理状态、调节肝脏等作用，其主要活性成分是可溶
性蛋白质[2-6]。有研究发现可溶性蛋白是地龙溶血
栓、抗血栓的主要活性物质[7]。
目前，对从地龙中提取得到地龙蛋白的工艺研
究较多[8-9]，但对已获得的活性蛋白后续处理工艺的
研究较少，因此本实验旨在能够最大程度确保其活
性组分有效性的基础上，通过工艺处理后，较稳定
地保存已提取蛋白。本实验采用单因素试验结合
Box-Behnken响应面法[10]，以冻干率为指标，优化
地龙活性组分的冻干工艺，采用 HPLC法，测定优
化后工艺样品的指纹图谱，并比较其与地龙药材指
纹图谱相似度，确定最佳冻干工艺，为地龙同体制
剂的研制提供实验依据。
1 仪器与试剂
UV-2600 型紫外可见分光光度计，日本岛津公
司；电子分析天平，梅特勒-托利多（上海）仪器有
限公司；LYO-0.5（CIP）真空冷冻干燥机，上海东
富龙科技股份有限公司；SPX-250BZ 型生化培养
箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；TD5A-WS
台式低速离心机，长沙湘鹰离心机有限公司；安捷
伦 1260液相色谱仪系统，美国安捷伦公司；相似度
软件为“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”，中国
药典委员会。17种氨基酸混合对照品（门冬氨酸、
谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨
酸、丙氨酸、脯氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、
异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸）、
衍生试剂 A（异硫氰酸苯酯-乙腈溶液）和衍生试剂
B（三乙胺-乙腈溶液）均来自月旭公司氨基酸分析
包；尿激酶、凝血酶（牛血）、纤维蛋白原（牛血）
均购自中国食品药品检定研究院，批号分别为
140604-201224、140605-201125、140607- 201338；
琼脂糖，BR 级，批号 121129，上海如吉生物科技
发展有限公司；地龙对照药材，批号 120987-201107，
购自中国食品药品检定研究院；实验用水为娃哈哈
纯净水；其他试剂为分析纯。地龙药材购自亳州中
药材市场，产地广东佛山，批号 20131106，经湖北
省药学会中药鉴定分会陈科力教授鉴定为钜蚓科动
物参环毛蚓 Pheretima aspergillum (E. Perrier) 的干
燥体。
2 方法与结果
2.1 地龙药材提取物的制备
称取地龙粗粉 100 g，加水 500 mL，浸泡 60
min，超声处理（250 W，50 Hz）60 min，12 000 r/min
离心 10 min，得上清液。分别将 A、B 2种衍生试
剂用乙腈稀释至原来浓度的 1/5，精密量取上清液 1
mL，置于试管中，加入稀释后的 A溶液 0.5 mL和
稀释后的 B溶液 0.5 mL，涡旋混合 1 min，在 50 ℃
水浴中加热 45 min，取出，加入正己烷溶液 1 mL，
振摇，涡旋混合 1 min，静置 30 min，吸取下层澄
清液体，用孔径为 0.45 μm有机滤膜滤过，即得到
衍生化后的样品溶液。
2.2 评价指标
2.2.1 冻干率[11] 冻干率是物料冻干后脱水质量
占物料水分总量的比例，本实验采用费休氏水分测
定法测定样品中的含水量从而计算出冻干率。
冻干率＝1－含水量
2.2.2 指纹图谱相似度分析[12-13]
（1）对照品溶液的制备：取 Welch 公司 17 种
氨基酸混合对照品溶液（原浓度）用水稀释至原来
浓度的 1/10作为对照品溶液。
（2）色谱条件：色谱柱为 Ultimate Amino Acid
AAA氨基酸分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，月
旭材料科技有限公司）；体积流量 1.0 mL/min；柱温
40 ℃；进样量 5 μL；检测波长 254 nm。流动相 A
为 0.1 mol/L醋酸钠溶液（pH 6.5）-乙睛（93∶7）；
流动相 B为水-乙腈（20∶80），二元梯度洗脱，洗
脱程序：0～11 min，100%～93% A；11～13.9 min，
93%～88% A；13.9～14 min，88%～85% A；14～
29 min，85%～66% A；29～32 min，66%～30% A；
32～35 min，30%～0% A；35～45 min，0% A；45～
60 min，100% A。
（3）精密度试验：取“2.1”项下衍生化后供试
品溶液，按照上述色谱条件连续进样 6次。将 6次
测定图谱转化为 AIA格式后依次导入相似度软件，
输出 17个共有峰峰面积的 RSD为 0.12%～3.43%，
保留时间的 RSD为 0.04%～0.31%，表明仪器精密
度良好。
（4）稳定性试验：取“2.1”项下制备的同 1份
衍生化后供试品溶液，在上述色谱条件下分别在 0、
2、4、6、8、12、24、48、72 h进样，进行测定。
测定图谱转化为 AIA格式后依次导入相似度软件，
输出 17个共有峰峰面积的 RSD为 0.17%～2.81%，
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保留时间的 RSD为 0.03%～0.13%，表明样品在 72
h内稳定。
（5）重复性试验：取“2.1”项下平行制备的 6
份衍生化后供试品溶液，按照上述色谱条件进行测
定。测定图谱转化为 AIA格式后依次导入相似度软
件，输出 17 个共有峰峰面积的 RSD 为 0.41%～
3.58%，保留时间的 RSD为 0.03%～0.15%，表明方
法的重复性良好，证明分析方法和提取工艺的稳定
性和可靠性。
（6）共有图谱的建立：取“2.1”项下的衍生化
后供试品溶液，按照上述色谱条件连续进样 10次，
取对照品溶液，按色谱条件项下条件进行测定并标
示，如图 1所示，峰 1～17为地龙氨基酸组分提取
物中含有的 17种氨基酸成分，分别为门冬氨酸、谷
氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、
丙氨酸、脯氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮
氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸。其中
峰 10（胱氨酸）在 HPLC图谱中分离良好，质量分
数较高且稳定，所以选择其为参照峰，共标示了 17
个共有峰。



1-门冬氨酸 2-谷氨酸 3-丝氨酸 4-甘氨酸 5-组氨酸 6-精氨酸 7-苏氨酸 8-丙氨酸 9-脯氨酸 10-胱氨酸 11-缬氨酸 12-蛋氨酸
13-异亮氨酸 14-亮氨酸 15-酪氨酸 16-苯丙氨酸 17-赖氨酸
1-aspartic acid 2-glutamic acid 3-serine 4-glycine 5-histidine 6-arginine 7-threonine 8-alanine 9-proline 10-cystine acid 11-valine
12-methionine 13-isoleucine 14-leucine 15-tyrosine 16-phenylalanine 17-lysine

图 1 地龙氨基酸组分提取物参照图谱
Fig. 1 Reference fingerprint of extract components of amino acid in lumbricus

2.3 冻干工艺单因素试验考察
2.3.1 共晶点（共融点）的测定及预冻温度的确定
溶液装入 10 mL烧杯中，置于冻干机前箱，插入共
晶点探头及温度探头，启动共晶点测定仪，设定冻
干机预冻温度为−50 ℃，预冻 3 h，测定共晶点。
按照冻干理论[7]，为保证物料完全冻结，产品预冻
温度一般应选择在共晶点温度以下 5～15 ℃为宜，
经测定该制品溶液的共晶点为−16.5 ℃，共融点为
−17.9 ℃，据此推测预冷冻温度应低于−26.5 ℃，
为确保产品在预冻时完全冻结，试验选择−26.5 ℃
为预冻温度。
2.3.2 预冻时间的确定 精密吸取地龙药液，在
−26.5 ℃下预冻，在−25 ℃进行升华干燥 16 h，
40 ℃进行解析干燥 6 h，绝对压力维持在 15 Pa左
右[14]，预冻时间分别设置为 2、3、4、5 h，以冻干
产品外观性状和冻干率为指标考察不同预冻时间对
产品质量的影响，结果见表 1。预冻时间仅 2 h时，
冻干产品外观收缩，呈黄色团块，随着预冻时间的
延长，产品的性状良好，质地疏松，在预冻时间为
4～5 h时，冻干品的外观及冻干率质量最好，因此
确定预冻时间为 4 h。
2.3.3 升华干燥温度对产品质量影响的单因素试验
1
2
3
4
5
8
6
7 9
10
11
12
13
14
15
16
17
0 5 10 15 20 25 30 35
t/min
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表 1 预冻时间对产品质量的影响
Table 1 Effects of pre freezing time on product quality
预冻时间/h 性状 冻干率/%
2 收缩，黄色团块 50.00
3 略有鼓泡，淡黄色块状物，
质地疏松
93.46
4 淡黄色块状物，质地疏松 94.31
5 淡黄色块状物，质地疏松 94.33

升华干燥又称第 1阶段干燥，是指冻结产品中的冰
晶升华成水蒸气逸出而使产品脱水干燥。当全部冰
晶除去时，第 1阶段干燥完成，此时除去全部水分
的 90%左右。升华时所需热量由搁板供给，产品在
干燥时期温度必须低于其共融点的温度，同时考虑
到产能，因此在−26.5 ℃的温度下预冻 4 h，绝对压
力维持在 15 Pa左右，40 ℃进行解析干燥 6 h的条
件下，选择升华干燥温度−18、−20、−22、−24 ℃ 4
个水平进行单因素试验，结果见表 2。升华阶段搁
板温度在低于共融点下，温度越高，产品的性状良
好，质地疏松，颜色均匀，产品冻干率提高；温度
越低，在同等升华干燥时间内，产品外观颜色深，
冻干率明显降低，可能是产品干燥不充分，需要延
长升华干燥时间，但是从能耗角度，已经不具备可
行性，因此确定升华干燥温度−18、−20、−22 ℃作
为 Box-Behnken设计实验的 3个水平。
表 2 升华干燥温度对产品质量的影响
Table 2 Effects of sublimation drying temperature on
product quality
搁板温度/℃ 性状 冻干率/%
−18 质地疏松，淡黄色块状，颜色均匀 92.60
−20 质地疏松，淡黄色块状，颜色较均匀 96.01
−22 质地疏松，淡黄色块状，颜色均匀 94.18
−24 质地疏松，淡黄色块状，中间颜色深 88.75

2.3.4 升化时间对产品质量影响的单因素试验 在
升华干燥阶段，升华时间是很关键的因素，时间太
短，搁板温度很快达到预定的温度，使供给物料的
热量也增加的过快，导致超过物料的共融点温度使
其融化。因此在确定−26.5 ℃的温度下预冻 4 h，
40 ℃进行解析干燥 6 h，暂定升华温度为−20 ℃不
变的条件下，选择以下 4个时间段位因素进行考察，
结果见表 3。进入升华干燥阶段，升华时间过短会
导致冰晶融化，冻干率很低，随着升温时间的延长，
产品性状良好，时间过长会加长冻干周期且消耗不
表 3 升华时间对产品质量的影响
Table 3 Effects of sublimation time on product quality
升华时间/h 性状 冻干率/%
5 收缩，颜色不均匀 33.00
6 质地疏松，淡黄色块状，颜色均匀 94.18
7 质地疏松，淡黄色块状，颜色均匀 96.01
8 质地疏松，淡黄色块状，颜色均匀 95.60

必要的能量，因此确定升华时间 6、7、8 h 作为
Box-Behnken设计实验的 3个水平。
2.3.5 解析干燥温度对产品质量影响的单因素试验
为了使产品达到合格的残余含水量，必须对产品进
一步干燥，产品的热量主要靠搁板供给，所以在
−26.5 ℃的温度下预冻 4 h，−20 ℃进行升华干燥 7
h 不变的条件下，选择 20、25、30、35 ℃ 4 个温
度进行单因素试验，结果见表 4。在解析干燥阶段，
随着温度的上升，冻干效果显著，当搁板温度为
30 ℃时，冻干产品性状良好，骨架结构完整，海绵
状，颜色均匀，冻干效果已经较好，随着搁板温度
继续增高，冻干率也不能增加，且增加产能，因此
确定解析温度 20、25、30 ℃作为 Box-Behnken 设
计实验的 3个水平。
表 4 解析干燥温度对产品质量的影响
Table 4 Effects of analytical drying temperature on product
quality
搁板温度/℃ 性状 冻干率/%
20 质地疏松，黄色块状物，中间颜色
稍深
93.08
25 质地疏松，淡黄色块状，颜色均匀 94.25
30 质地疏松，淡黄色块状，颜色均匀 95.51
35 质地疏松，淡黄色块状，颜色均匀 95.48

2.3.6 解析干燥时间对产品质量影响的单因素试验
解析干燥时间同样是影响冻干工艺样品的参数之
一，因此在−26.5 ℃的温度下预冻 4 h，−20 ℃进行
升华干燥 7 h，解析干燥温度暂定为 30 ℃不变的条
件下，选择以下 4 个时间进行试验，结果见表 5。
在解析干燥阶段，随着解析干燥时间的延长，冻干
效果显著，冻干周期也延长，能耗越来越高，至解
析干燥 4 h后，再延长时间，已基本无影响，因此
确定解析干燥时间 3.0、3.5、4.0 h作为 Box-Behnken
设计实验的水平。
2.4 响应面优化试验
2.4.1 试验设计及结果 通过预试验和单因素试验
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表 5 解析干燥时间对产品质量的影响
Table 5 Effects of analytical drying time on product quality
解析时间/h 性状 冻干率/%
3.0 质地疏松，淡黄色块状，颜色均匀 95.06
3.5 质地疏松，淡黄色块状，颜色均匀 95.25
4.0 质地疏松，淡黄色块状，颜色均匀 96.01
4.5 质地疏松，淡黄色块状，颜色均匀 95.94
的考察，仅确定部分参数，其最佳工艺需进一步优
选，本实验选取升华干燥温度（A）、升华时间（B）、
解析干燥温度（C）、解析干燥时间（D）为考察因
素，以冻干率为评价指标，采用 Box-Behnken响应
面法对工艺进行优化，考察各因素对产品质量的综
合影响，试验设计及结果见表 6。方差分析见表 7。
2.4.2 回归模型的建立及方差分析 采用 Design
表 6 地龙活性组分冻干工艺响应面优化试验设计及结果
Table 6 Design and experimental results of process of freeze-dried optimization of active components in lumbricus
试验号
因素 冻干率/%
试验号
因素 冻干率/%
A/℃ B/h C/℃ D/h 实测 预测 A/℃ B/h C/℃ D/h 实测 预测
1 −18 (1) 7 (0) 25 (−1) 3.5 (0) 94.06 94.44 15 −20 (0) 8 (1) 30 (0) 3.0 (−1) 91.28 91.67
2 −18 (1) 6 (−1) 30 (0) 3.5 (0) 93.90 93.63 16 −20 (0) 6 (−1) 35 (1) 3.5 (0) 94.66 94.36
3 −20 (0) 6 (−1) 30 (0) 4.0 (1) 93.82 94.21 17 −20 (0) 7 (0) 30 (0) 3.5 (0) 96.57 96.62
4 −20 (0) 7 (0) 30 (0) 3.5 (0) 96.50 96.62 18 −20 (0) 7 (0) 30 (0) 3.5 (0) 96.79 96.62
5 −20 (0) 8 (1) 30 (0) 4.0 (1) 94.45 94.81 19 −20 (0) 6 (−1) 30 (0) 3.0 (−1) 90.58 91.01
6 −22 (−1) 6 (−1) 30 (0) 3.5 (0) 94.79 94.67 20 −22 (−1) 7 (0) 35 (1) 3.5 (0) 94.76 95.16
7 −18 (1) 7 (0) 30 (0) 3.0 (−1) 89.92 89.64 21 −20 (0) 7 (0) 35 (1) 3.0 (−1) 90.66 90.37
8 −18 (1) 8 (1) 30 (0) 3.5 (0) 94.52 94.26 22 −22 (−1) 8 (1) 30 (0) 3.5 (0) 95.42 95.30
9 −20 (0) 7 (0) 25 (−1) 4.0 (1) 93.96 93.86 23 −18 (1) 7 (0) 35 (1) 3.5 (0) 91.12 91.82
10 −20 (0) 6 (−1) 25 (−1) 3.5 (0) 94.82 94.69 24 −20 (0) 7 (0) 25 (−1) 3.0 (−1) 90.82 90.69
11 −22 (−1) 7 (0) 30 (0) 4.0 (1) 93.96 93.84 25 −18 (1) 7 (0) 30 (0) 4.0 (1) 93.07 92.80
12 −20 (0) 7 (0) 35 (1) 4.0 (1) 93.79 93.54 26 −20 (0) 8 (1) 35 (1) 3.5 (0) 95.27 95.00
13 −20 (0) 8 (1) 25 (−1) 3.5 (0) 95.41 95.31 27 −22 (−1) 7 (0) 25 (−1) 3.5 (0) 93.10 93.18
14 −22 (−1) 7 (0) 30 (0) 3.0 (−1) 90.79 90.67

表 7 方差分析
Table 7 ANOVA regression analysis
方差来源 平方和 自由度 F值 P值 显著性 方差来源 平方和 自由度 F值 P值 显著性
A 3.23 1 17.71 0.001 2 ** A2 14.92 1 81.70 ＜0.000 1 **
B 1.19 1 6.52 0.025 3 * B2 1.25 1 6.84 0.022 6 *
C 0.30 1 1.66 0.221 3 C2 8.94 1 48.98 ＜0.000 1 **
D 30.08 1 164.75 ＜0.000 1 ** D2 55.00 1 301.20 ＜0.000 1 **
AB 2.50×10−5 1 1.37×10−4 0.990 9 残差 2.19 12
AC 5.29 1 28.97 0.000 2 ** 失拟项 2.15 10 9.37 0.100 2
AD 1.00×10−4 1 5.48×10−4 0.981 7 纯误差 0.046 2
BC 1.00×10−4 1 5.48×10−4 0.981 7 总和 103.27 26
BD 1.23×10−3 1 6.71×10−3 0.936 1 变异系数 0.004 6
CD 2.50×10−5 1 1.37×10−4 0.990 9 校正决定系数 0.978 8
*P＜0.05，模型或考察因素有显著影响；**P＜0.01，模型或考察因素有极显著影响
*P < 0.05, model or investigation factor with significant effect; **P < 0.01, model or investigation factor with extremely significant effect
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Expert 8.05软件，分别对各因素水平进行多元线性
回归和非线性回归（二项式拟合），建立地龙活性组
分冻干率（Y）对 4个因素（A、B、C、D）的 2次
回归模型方程为 Y＝96.62－0.52 A＋0.32 B－0.16
C＋1.58 D－0.002 5 AB－1.15 AC－0.005 AD＋
0.005 BC－0.017 BD－0.002 5 CD－1.67 A2－0.48
B2－1.29 C2－3.21 D2。
经方差分析（表 7）得知，自变量 1次项 B，2
次项 B2显著（P＜0.05），1次项 A、D，2次项 AC、
A2、C2、D2极显著（P＜0.01），表明模型具有统计
学意义。失拟项用来表示所用模型与实验拟合的程
度，即二者差异的程度，本例 P值为 0.100 2＞0.05，
对模型是有利的，无失拟因素存在。进一步，校正
决定系数（0.978 8＞0.80）和变异系数为 0.46%，
说明该模型只有 2.12%的变异，表明该模型拟合优
度较好，可用该模型及回归方程代替试验真实点对
实验结果进行分析和预测（预测结果见表 6）。
2.4.3 反应条件的优化及模型验证 各因素之间的
响应面图和等高线图见图 2，由 Design Expert 8.05
软件分析得响应面值最大时，A、B、C、D对应的
编码值分别为 0、0、0、0，与之对应的地龙活性组
分最佳冻干工艺条件为升华干燥温度−20 ℃、升华








图 2 Y与 4因素的三维效应面图和等高线图
Fig. 2 3D Response surface plots and contour plots of Y and four factors
97
Y/%
A/℃ B/h
B/h
A/℃ A/℃
Y/
%

Y/
%

Y/
%

Y/
%

Y/
%

Y/
%

C/℃ B/h
C/℃ D/h
C/℃ D/h D/h
−21 A/℃ −19
6.5 B/h 7.5 27 C/℃ 33
B
/h

C
/℃

D
/h

C
/℃

D
/h

D
/h

95
93
7.5
6.5
−19
−21
97
94
91
33
27
−19
−21
90
94
98
3.2
3.8
−21
−19
97
96
95
94
33
27
7.5
6.5
97
94
91
3.2
3.8
6.5
7.5
91
94
97
3.8
3.2
33
27
7.5
6.5 27
33
3.2
3.8
−21 A/℃ −19 −21 A/℃ −19
Y/% Y/%
27
33
3.2
3.8 3.8
3.2
6.5 B/h 7.5
Y/% Y/% Y/%
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46卷 第 21期 2015年 11月

·3172·
时间 7 h、解析干燥温度 30 ℃、解析干燥时间 3.5 h，
此时冻干率的理论值达 96.62%。
2.5 验证试验
为检验单因素及响应面预测的可靠性，选择最
佳冻干工艺条件（预冻温度−26.5 ℃，预冻 4 h，升
华干燥温度−20 ℃、升华时间 7 h、解析干燥温度
30 ℃、解析干燥时间 3.5 h）进行 3批放大工艺验
证试验，测定冻干率，并为确认本工艺不影响地龙
氨基酸组分的活性，将验证批样品与对照药材的氨
基酸指纹图谱进行相似性分析，判断是否最大程度
保留其活性组分的有效性[2-3]。
结果 3 批样品的冻干率分别为 96.59%、
96.45%、96.61%，指纹图谱相似度分别为 0.912、
0.905、0.915。采用最佳冻干工艺条件得到的地龙
提取物颜色均匀，性状良好，测得冻干率在 96.55%，
与预测值 96.62%基本吻合，说明响应面法优化的冻
干工艺条件稳定，与对照药材的氨基酸指纹图谱相
似度均大于 0.9，表明该工艺具备可行性。
3 讨论
动物药活性成分以多肽和蛋白质为主，地龙中
含量最为丰富的物质即为蛋白质，但其主要成分氨
基酸类具有水溶性和对热不稳定的性质，因此对提
取后活性成分处理和保存是非常关键的。本实验采
用冷冻干燥技术，应用单因素及 Box-Behnken响应
面设计方法，对其活性组分冻干工艺进行优化。结
果表明，此优化方法在保证获得较好冻干率的基础
上，能够最大程度地保留地龙提取物有效成分的活
性，工艺稳定可行，为地龙制剂研究及临床应用提
供一定的实验基础。
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