全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 4 期 2015 年 2 月

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叶下珠指纹图谱及模式识别研究
吴玲芳 1，林 琛 1，袁永兵 2，孙雪飞 1，朱 丹 1，杨光辉 1，邵岩岩 1，毛 鑫 1，张兰珍 1*，石任兵 1*
1. 北京中医药大学中药学院，北京 100102
2. 天津药物研究院，天津 300193
摘 要：目的 建立叶下珠 HPLC 指纹图谱评价体系。方法 采用 Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，乙
腈-0.2%冰醋酸水溶液为流动相梯度洗脱，检测波长 270 nm，体积流量 1.0 mL/min。测定 9 个不同产地叶下珠指纹图谱，
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A 版）计算相似度，并用对照品和液质联用技术指认色谱峰。结果 建立
了叶下珠指纹图谱共有模式，标定了 11 个共有峰，指认了其中 8 个主要色谱峰，用聚类分析和主成分分析对指纹图谱进
行模式识别。结论 将指纹图谱和模式识别结合起来对叶下珠进行质量控制是一种有效的评价方法，为叶下珠的全面质
量控制提供了基础。
关键词：叶下珠；指纹图谱；模式识别；HPLC；聚类分析
中图分类号：R286.022 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2015)04 - 0572 - 04
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2015.04.021
Fingerprint analysis and chemical pattern recognition for whole plant
of Phyllanthus urinaria
WU Ling-fang1, LIN Chen1, YUAN Yong-bing2, SUN Xue-fei1, ZHU Dan1, YANG Guang-hui1, SHAO Yan-yan1,
MAO Xin1, ZHANG Lan-zhen1, SHI Ren-bing1
1. School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China
2. Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, Tianjin 300193, China
Abstract: Objective To establish the HPLC fingerprint and its evaluation system for the whole plant of Phyllanthus urinaria.
Methods Diamonsil C18 column（250 mm × 4.6 mm, 5 μm）was used with acetonitrile and 0.2% acetic acid solution in gradient
elution mode. The detective wavelength was 270 nm and the flow rate was 1.0 mL/min. The fingerprints for the whole plant of P.
urinaria and phenolic acids part from nine different sources were set up, the similarity assay for the whole plant of P. urinaria from
nine different sources was carried out to evaluate their quality by Chinese material medica (CMM) fingerprint similarity evaluation
system ( 2004A edition), and the peaks were identified by comparing the reference substance with LC-MS/MS. Results The
common mode of HPLC fingerprints for the whole plant of P. urinaria were set up. There were 16 common peaks in the fingerprints
and eight peaks were identified. The cluster analysis and principal component analysis were applied to studying the HPLC
fingerprint and chemical pattern recognition. Conclusion The combination of fingerprint and chemical pattern recognition is an
effective method for the quality control of the whole plant of P. urinaria. The study lays the foundation for the full quality
evaluation for the whole plant of P. urinaria.
Key words: whole plant of Phyllanthus urinaria L.; fingerprint; pattern recognition; HPLC; cluster analysis

叶 下 珠 为 大 戟 科 叶 下 珠 属 植 物 叶 下 珠
Phyllanthus urinaria L. 干燥全草，具有清热利尿、
明目、消积的功效，主要用来治疗肝炎、肠炎、痢
疾、肾炎水肿。现代药理学研究表明叶下珠具有抗
炎、抗癌、抗病毒等多种功效，其抗病毒作用的强
弱与产地有关[1-2]。酚酸类成分是叶下珠的主要活性

收稿日期：2014-10-14
基金项目：国家自然科学基金资助项目（30171197）；北京市自然基金项目（7073093）；北京市教育委员会科技成果转化与产业化项目；北京
中医药大学科研创新团队（2011-CXTD-12）
作者简介：吴玲芳，女，在读博士。
*通信作者 张兰珍 Tel: (010)84738629 E-mail: zhanglanzhen01@126.com
石任兵 Tel: (010)84738601 E-mail: shirb@126.com
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成分，本课题组已经建立了叶下珠酚酸部位大孔树
脂纯化制备工艺，并测定了叶下珠中总酚酸量和 4
个单体化合物的量[7-9]。
由于个别成分的测定不能完全代表中药质量的
复杂体系，本研究旨在建立不同产地叶下珠的
HPLC 指纹图谱，通过与对照品对照、液质联用技
术、相似度评价、主成分分析、聚类分析等识别技
术，对所收集的 9 个不同产地叶下珠药材进行分析
归类，以便更加全面地体现不同产地药材之间的质
量差异，为制定全面而的叶下珠质量控制方法提供
实验依据。
1 仪器与材料
Waters1525 型高效液相色谱仪；PAD 检测器；
Empower 软件；25 μL 可调进样器；KQ-00DE 超声
波清洗器（昆山超声仪器有限公司）。
自制没食子酸、柯里拉京、老鹳草素、短叶苏
木酚酸对照品，经 HPLC 检测质量分数均大于
98.5%。乙腈（Sigma-aldrich 公司）色谱纯；屈臣氏
纯净水；其他试剂均为分析纯。
产地为陕西安康、商洛的叶下珠药材经陕西中医
研究院郭五保副研究员鉴定为大戟科植物叶下珠
Phyllanthus urinaria L. 的干燥全草；其他叶下珠药材
产自安徽、福建、河南、广东、广西等地，由北京中
医药大学刘春生教授鉴定为大戟科植物叶下珠
Phyllanthus urinaria L.，样品保存于北京中医药大学
中药化学系，具体产地见表 1。
表 1 药材产地信息
Table 1 Information on habitat of medicinal materials
编号 产地 编号 产地
S1 陕西商洛 S6 广西
S2 安徽 S7 河南
S3 陕西安康 S8 四川
S4 福建 S9 安徽（同仁堂）
S5 广东

2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5
μm）；柱温 30 ℃；体积流量 1 mL/min；检测波长
270 nm；流动相为乙腈（A）-0.2%冰醋酸水溶液（B），
梯度洗脱，洗脱程序见表 2。
2.2 供试品溶液的制备
称取不同产地叶下珠药材粉末（过 50 目筛）约
300 mg，精密称定，置 100 mL 锥形瓶中，加入 50%
表 2 流动相梯度程序
Table 2 Gradient of mobile phase
时间/min A/% B/%
0 5 95
10 15 85
15 25 75
30 30 70
50 60 40
55 90 10
62 90 10
甲醇 50 mL，称定质量，100 MHz 超声 60 min，放
冷后补足质量，滤过，进样前经 0.45 μm 微孔滤膜
滤过。
2.3 对照品溶液的制备
分别精密称取没食子酸、柯里拉京、老鹳草素、
短叶苏木酚酸各适量，分别置 10 mL量瓶中，用 50%
甲醇溶解并稀释至刻度。摇匀，各溶液再精密移取
1 mL，分别置 10 mL 量瓶中，用 50%甲醇溶解并稀
释至刻度。得到没食子酸、柯里拉京、老鹳草素、
短叶苏木酚酸的质量浓度分别为 31.1、65.2、123.2、
32.5 μg/mL 的混合对照品溶液。
2.4 不同产地叶下珠指纹图谱的建立及相似度分析
分别取 9 个不同产地的叶下珠药材，按“2.2”
项方法制备供试品溶液，按照“2.1”项色谱条件分
别测定，得到 9 个不同产地的叶下珠药材 HPLC 指
纹图谱。使用《中药色谱特征图谱相似度评价系统
软件》（2004 版 A）对 9 个不同产地叶下珠药材的
实验数据进行相似度计算，对照图谱采用“平均数”
法生成，得到 9 批叶下珠药材特征图谱，相似度计
算生成叶下珠共有模式的对照指纹图谱，相对保留
时间及相对峰面积见表 3、4，不同产地叶下珠药材
共有色谱峰 11 个，见图 1。
结果表明，9 个不同产地叶下珠药材各色谱峰相
似度在 0.983～0.705，其中安徽、安康、广西、广东、
河南、商洛 6 个产地叶下珠相似度在 0.9 以上，安徽
（同仁堂）、四川、福建的药材相似度在 0.9 以下。9
个不同产地药材与对照谱之间的相似度结果见表 5。
2.5 叶下珠 HPLC 指纹图谱主要色谱峰指认
2.5.1 HPLC-MS 色谱条件 1100 LC- MSD-Trap-
XCT_plus 型液质联用仪（美国 Agilent 公司）；HPLC
色谱条件同“2.1”项。质谱条件：ESI 离子源；离
子源温度为 350 ℃；负离子检出模式；雾化气压力：
413.7 kPa；干燥气氮气；体积流量 12 L/min；扫
描范围 m/z 50～2 200。
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表 3 9 批样品共有峰相对保留时间
Table 3 Relative retention time of common peaks for nine batches of samples
相对保留时间 样品 峰 1 峰 2 峰 3 峰 4 峰 5 峰 6 峰 7 峰 8 峰 9 峰 10 峰 11
S1 3.316 7.919 10.207 14.880 16.100 23.059 29.272 31.837 34.217 44.054 52.642
S2 3.238 7.974 10.346 14.585 16.814 23.568 29.242 31.893 34.999 44.145 52.558
S3 3.235 7.968 10.119 14.608 16.773 23.516 29.388 31.989 34.100 44.805 52.419
S4 3.251 7.955 10.352 14.854 16.811 23.562 29.417 31.837 34.953 44.149 52.549
S5 3.251 7.955 10.352 14.623 16.811 23.562 29.417 31.837 34.953 44.149 52.549
S6 3.252 7.978 10.366 14.717 16.824 23.575 29.275 31.800 34.972 44.133 52.560
S7 3.251 7.955 10.352 14.623 16.811 23.562 29.417 31.837 34.953 44.149 52.549
S8 3.254 7.938 10.539 14.68 16.861 23.564 29.383 31.84 34.146 44.247 52.678
S9 3.239 7.940 10.294 14.587 16.799 23.654 29.285 31.814 34.733 44.118 52.537
平均值 3.245 7.954 10.330 14.672 16.734 23.513 29.344 31.854 34.67 44.127 52.560
RSD/% 0.75 0.24 1.12 0.76 1.42 0.74 0.25 0.18 1.14 0.51 0.14
表 4 9 批样品共有峰相对峰面积
Table 4 Relative peak areas of common peaks for nine batches of samples
相对峰面积 样品 峰 1 峰 2 峰 3 峰 4 峰 5 峰 6 峰 7 峰 8 峰 9 峰 10 峰 11
S1 141 128 594 125 75 747 62 783 660 450 182 632 40 131 70 037 42 570 12 334 12 112
S2 77 574 175 866 47 419 70 048 382 208 1 470 491 27 908 273 109 17 424 99 902 28 735
S3 52 650 86 406 74 527 22 710 443 037 1 932 896 39 637 216 404 3 439 21 119 18 032
S4 92 572 109 780 13 001 24 437 732 277 928 340 61 866 538 530 4 790 224 124 33 613
S5 92 572 109 780 13 001 11 288 732 277 928 340 61 866 538 530 4 790 224 124 33 613
S6 56 448 101 364 44 573 31 930 312 086 1 015 517 9 461 39 836 28 415 17 010 13 997
S7 109 780 33 613 13 001 11 288 732 277 928 340 61 866 538 530 4 790 224 124 33 613
S8 115 179 20 173 11 930 20 171 562 293 1 172 977 8 776 514 424 10 388 221 899 20 173
S9 136 433 24 025 21 579 60 425 419 476 1 383 252 18 591 295 217 23 526 226 830 24 025
平均值 97 148 139 459 34 975 35 008 552 931 1 104 754 36 678 336 068 15 570 141 274 24 212
RSD/% 32.59 127.47 75.87 65.94 30.34 43.57 59.79 60.73 87.46 71.94 78.29


R-对照图谱 2-没食子酸 5-柯里拉京 6-老鹳草素 7-短叶苏
木酚酸甲酯 8-叶下珠素 9-短叶苏木酚酸 10-鞣花酸
11-叶下珠素 A
R-common mode of HPLC fingerprints 2-galic acid 5-corilagin
6-geraniin 7-methyl brevifolin-carboxylate 8-phyllanthin
9-brevifolin-carboxylic acid 10-ellagic acid 11-phyllanthin A
图 1 不同产地叶下珠药材 HPLC 指纹图谱
Fig. 1 HPLC fingerprint for whole plant of P. urinaria from
nine different habitats
表 5 叶下珠指纹图谱相似度
Table 5 Similarity evaluation on whole plant of P. urinaria
编号 相似度 编号 相似度
S1 0.972 S6 0.957
S2 0.983 S7 0.966
S3 0.964 S8 0.865
S4 0.899 S9 0.705
S5 0.948 对照图谱 1.000

2.5.2 叶下珠药材指纹图谱特征峰指认 精密吸取
叶下珠药材供试品溶液注入 HPLC 仪及 LC-MS 仪，
按上述条件进行检测，根据叶下珠药材总离子流图
各色谱峰的保留时间，结合各色谱峰的一级、二级
质谱信息及紫外光谱信息，确定主要色谱峰结构。
同时通过添加对照品对照，指认出不同产地叶下珠
8 个共有峰，分别为没食子酸（2 号峰）、柯里拉京
（5 号峰）、老鹳草素（6 号峰）、短叶苏木酚酸甲酯

R
S9



S1
1
2
3 4
5 6
7 8 9
10
11
0 8.4 16.8 25.2 33.6 42.0 50.4 58.8
t/min
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（7 号峰）、叶下珠素 C（8 号峰）、短叶苏木酚酸（9
号峰）、鞣花酸（10 号峰）叶下珠素 A（11 号峰）。
2.6 聚类分析
分别以叶下珠指纹图谱中标定的共有峰的相对
峰面积为变量，采用 SPSS16.0 数据统计软件，采用
欧氏距离进行聚类分析，结果见图 2。根据叶下珠
药材 HPLC 特征图谱聚类分析的结果，将叶下珠药
材大致可分为 2 类，I 类包括 S2、S9、S4、S8、S6、
S7、S3；II 类包括 S1、S5。

图 2 叶下珠药材 HPLC 特征图谱聚类分析
Fig. 2 HPLCl cluster analysis on whole plant of P. urinaria
2.7 主成分分析
分别以叶下珠指纹图谱中标定的共有峰的峰面
积为变量，用 SPSS 16.0 统计分析软件对原始数据
做标准化处理后进行主成分分析（PCA），以主成分
的特征根及贡献率作为选择主成分的依据。
对9个不同产地叶下珠药材合格样品的11个共
有峰进行主成分分析，主成分个数提取原则是取主
成分对应的特征值大于 1 的前 3 个主成分，其累计
贡献可以达到 80.13%，包含了大部分信息，其中第
1 主成分特征值为 3.998，方差贡献率为 35.44%；
其中第 2 主成分特征值为 3.15，方差贡献率为
28.95%；其中第 3 主成分特征值为 1.77，方差贡献
率为 16.05%。分别以第 1、2、3 主成分来建立坐标
系，进行投影即可得到所有样本的 PCA 三维投影
图，见图 3，图中每个点对应 1 个共有峰，11 个共
有峰可分为 3 类。叶下珠药材 PCA 旋转后的公共因
子负荷矩阵见表 6。
3 讨论
本实验建立了 9 个不同产地叶下珠指纹图谱并
进行了相似度分析，结果表明不同产地叶下珠药材
质量存在一定差异，但叶下珠酚酸部位质量稳定，
差异较小。说明建立的酚酸部位制备工艺可以很好
地富集叶下珠酚酸类成分。
本研究首次建立了叶下珠药材及其酚酸部位的

图 3 叶下珠药材主成分得分图
Fig. 3 PCA score figure for whole plant of P. urinaria
表 6 药材因子负荷矩阵
Table 6 Factor loading matrix for whole plant of P. urinaria
成分值 共有峰
1 2 3 4
F1 −0.781 0.590 0.002 −0.017
F2 0.243 0.885 0.337 −0.040
F3 0.477 −0.641 0.430 0.217
F4 0.205 0.443 0.781 0.238
F5 −0.280 0.869 0.183 −0.223
F6 0.723 0.491 −0.393 0.131
F7 −0.153 0.439 −0.677 0.483
F8 −0.873 0.080 −0.074 −0.310
F9 −0.625 0.012 0.390 0.643
F10 0.747 0.233 0.144 −0.460
F11 0.789 0.403 −0.180 0.299

指纹图谱并进行了计量学分析，综合叶下珠相似
度分析、聚类分析、主成分分析、总酚酸量[4-5]、
4 个单一成分量结果，说明安徽、福建、四川、
陕西安康产叶下珠药材质量最好，广东和湖南产
叶下珠质量较差，为叶下珠药材质量评价和合理
应用提供依据。
参考文献
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珠属植物在体外细胞培养中抗 HBV 作用的研究 [J].
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量测定 [J]. 中国实验方剂学杂志, 2013, 19(13): 110-112.
0 5 10 15 20 25
S2
S9
S4
S8
S6
S7
S3
S1
S5


第
2
主
成
分
第 3 主成分
1.0
0.5
0.0
−0.5
−1.0
0.0 0.5 1.0 0.5 0.0
第 1 主成分
−0.5 −1.0
−0.5 −1.0