全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 15 期 2016 年 8 月

• 2721 •
刺五加 GAPDH 基因组 DNA 的克隆与分析
杨 果，尤鹏升，国红玉，李志栋，龙月红，邢朝斌*
华北理工大学生命科学学院，河北 唐山 063000
摘 要：目的 克隆刺五加 GAPDH 基因的 DNA 及启动子序列，并进行生物信息学分析。方法 以刺五加的基因组 DNA
为模板，采用 PCR 和 TAIL-PCR 技术克隆 GAPDH 基因的全长 DNA 序列及 5’端上游启动子序列，并对其进行生物信息学分
析。结果 克隆到长 4 103 bp 的刺五加 GAPDH 基因全长 DNA 及启动子序列。该基因共包含 12 个外显子和 11 个内含子，
其剪切均符合 GT-AG 原则。刺五加 GAPDH 的启动子片段长 1 304 bp，转录起始位点 A 位于起始密码子 ATG 上游 61 bp 处。
启动子除含有 TATA-box、CAAT-box 等基本元件外，还有诸多与激素应答、光响应和胁迫信号等有关的顺式作用调控元件。
结论 首次克隆到刺五加 GAPDH 基因的全长 DNA 及启动子序列，为深入研究 GAPDH 基因结构特征与功能奠定基础。
关键词：刺五加；GAPDH 基因；内含子；启动子；生物信息学分析
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2016)15 - 2721 - 06
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.15.021
Cloning and analysis on GAPDH genomic DNA from Eleutherococcus senticosus
YANG Guo, YOU Peng-sheng, GUO Hong-yu, LI Zhi-dong, LONG Yue-hong, XING Zhao-bin
College of Biology, North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, China
Abstract: Objective To clone and analyze the full length DNA and promoter sequence of GAPDH gene from Eleutherococcus
senticosus. Methods PCR and TAIL-PCR techniques were used to clone the full length DNA sequence and promoter sequence of
GAPDH gene of E. senticosus, then these two sequences were analyzed by bioinformatics methods. Results Length of 4 103 bp of E.
senticosus GAPDH gene DNA and promoter sequence was cloned. Gene structure analysis showed that it contained 12 exons and 11
introns, and the splicing principles of its exon and intron were consistent with GT-AG; The promoter sequence length was 1 304 bp, and
the transcription start site located 61 bp upstream of the initiation codon ATG; The promoter elements such as TATA-box, CAAT-box,
as well as many cis-regulatory elements were related to hormone signal response, light response and stress signals. Conclusion The
full length DNA and promoter sequence of GAPDH gene in E. senticosus is successfully cloned and reported for the first time, and it
provides a stable foundation for further study of GAPDH gene structure and function of E. senticosus.
Key words: Eleutherococcus senticosus (Rupr. et Maxim.) Maxim.; GAPDH gene; intron; promoter; bioinformatic analysis

刺五加 Eleutherococcus senticosus (Rupr. et
Maxim.) Maxim. 为五加科五加属植物，是我国传统
的珍贵药用植物[1]。在临床上刺五加被称之为“适
应原”样药物[2]，具有抗衰老、抗辐射、抗病毒、
抗肿瘤等药理作用[1]。
甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）由 4 个 30～
40 000 的亚基组成，相对分子质量为 1.64×105，是
糖酵解过程中的关键酶。GAPDH 具有高度保守性、
稳定表达的管家基因特点，因此作为内参基因广泛
用于功能基因表达量的研究[3]。在刺五加中 GAPDH
也被广泛作为研究刺五加三萜皂苷类化合物生物合
成关键酶基因的内参基因[1]。在真核生物的基因中，
内含子一度被视为是无基因功能的垃圾序列，然而
现有研究表明，内含子在基因的表达调控中起着重
要作用[4]，在基因表达调控方面，扮演着不可或缺
的重要角色[5-6]。同时，启动子也是位于基因 5’端上
游区的一段能与 RNA 聚合酶和转录因子特异结合
的 DNA 序列，决定基因转录、表达及调控的重要

收稿日期：2015-12-14
基金项目：国家自然科学基金资助项目（31570683）；河北省教育厅资助科研项目（QN2014102）；华北理工大学培育基金（SP201508）；华北
理工大学大学生创新创业训练计划（X2015171）
作者简介：杨 果（1994—），男，研究方向为药用植物分子生物学。
*通信作者 邢朝斌（1975—），男，教授，研究方向为分子生药学。Tel: (0315)3725859 E-mail: xzbheuu@126.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 15 期 2016 年 8 月

• 2722 •
顺式作用元件[7-9]。但对刺五加 GAPDH基因 DNA
序列中内含子及启动子的克隆分析研究尚未见
报道。目前有关刺五加 GAPDH 基因内含子结构
和启动子的研究尚未见报道。本研究首次克隆并
分析了刺五加 GAPDH 基因的 DNA 及启动子序
列，为进一步研究该基因的表达调控和功能奠定
基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
刺五加采自辽宁省本溪市桓仁满族自治县，经
华北理工大学生命科学学院邢朝斌教授鉴定为五加
科植物刺五加 Eleutherococcus senticosus (Rupr. et
Maxim.) Maxim.。以新鲜嫩叶作为提取基因组 DNA
的试材。
Ex Taq DNA 聚合酶、LA Taq DNA 聚合酶、dNTP、
DL5000 DNA Marker 购自TaKaRa 宝生物工程（大连）
有限公司，新型植物基因组DNA 提取试剂盒、琼脂糖
凝胶 DNA 回收试剂盒、pGM-T 克隆试剂盒、TOP-10
感受态细胞购自天根生化科技（北京）有限公司，琼
脂糖购自 Sigma-Aldrich 公司，氨苄青霉素、IPTG、
X-gal 购自北京拜尔迪生物技术有限公司，其他试剂均
为国产分析纯。引物由Thermo Fisher 公司合成。
1.2 方法
1.2.1 刺五加 GAPDH 基因 DNA 序列的克隆 按
照试剂盒说明书的要求，称取 0.1 g 刺五加叶片，提
取基因组 DNA。利用 1%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA
完整性。
根据刺五加 GAPDH 基因的 cDNA 序列[1]，应
用 Primer premier 5.0 软件设计 2 对 PCR 扩增 DNA
序列的引物。引物分别为 GAPDHQS、GAPDHQX、
GAP11S 和 GAPBY3（表 1）。以提取的刺五加基因
表 1 引物列表
Table 1 List of primers
引物名称 引物序列 (5’→3’)
GAPDHQS ATCAAGATCGGGATCAACG
GAPDHQX AAACGAACGGGAGACTCAA
GAP11S TTCCTCTGTTTCCCAATACCAA
GAPBY3 AACTGGCCTCTCACCAAAGAGAA
GAPBY2 CAACTCTAGCAACCAGACGACCG
GAPBY1 TCATTTACCGTTGATCCCGATCT
GAPBYN0 GCTTTAGATCGATTGAACAGGG
AD6 CA(A/T)CG(A/T/G/C)C(A/T/G/C)GA(A/T/G/C)
组 DNA 为模板进行 PCR 扩增，反应体系为 25 μL：
模板 1 μL，dNTP 4 μL，10×Ex Taq Buffer 2.5 μL，
上下游引物各 1 μL，Ex Taq DNA 酶 0.2 μL，ddH2O
15.3 μL。反应条件：94 ℃预变性 1 min，94 ℃变
性 30 s，53 ℃退火 50 s，72 ℃延伸 8 min，共 40
个循环，最后 72 ℃补充延伸 15 min。
1.2.2 PCR 产物回收、克隆及序列测定 PCR 产
物经 2%琼脂糖凝胶电泳后，切下目的条带，按照
琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒说明书进行回收纯
化。将回收的 PCR 产物连接入 pGM-T Vector，转
化入大肠杆菌 TOP-10 感受态细胞中，涂布于含
氨苄青霉素、IPTG、X-gal 的 LB 平板上培养 13 h。
随机挑选 20 个阳性克隆子送往 Invitrogen 公司进
行测序。
1.2.3 刺五加 GAPDH 基因启动子的克隆 根据
“1.2.1”项中获得的刺五加GAPDH 基因的DNA 序列，
设计 3 个嵌套的反向特异下游引物 GAPBY2、
GAPBY1、GAPBYN0（表 1）。并利用交错式热不对
称 PCR （ thermal asymmetric interlaced PCR ，
TAIL-PCR）的上游随机简并引物 AD6 依次与
GAPBY2、GAPBY1、GAPBYN0 配对进行连续 3 轮
的 TAIL-PCR 扩增。第 1 轮 TAIL-PCR 扩增的反应体
系为 25 μL：刺五加基因组 DNA 1 μL，dNTP 4 μL，
2×GC Buffer I 12.5 μL，引物 GAPBY2 1 μL，AD6 引
物 2.5 μL，LA Taq DNA 聚合酶 0.25 μL，ddH2O 3.75
μL。反应结束后取第 1 轮 PCR 产物稀释 10 倍作为模
板进行第2轮PCR扩增，反应体系为25 μL：模板DNA
1 μL，dNTP 4 μL，2×GC Buffer I 12.5 μL，GAPBY1
引物 1 μL，AD6 引物 2.5 μL，LA Taq DNA 聚合酶 0.25
μL，ddH2O 3.75 μL。最后取第 2 轮 PCR 产物稀释 100
倍作为模板进行第 3 轮 PCR 扩增，反应体系为 25 μL：
模板 1 μL，dNTP 4 μL，2×GC Buffer I 12.5 μL，
GAPBYN0 引物 1 μL，AD6 引物 2.5 μL，LA Taq DNA
聚合酶 0.25 μL，ddH2O 3.75 μL。3 轮 PCR 的反应条
件见表 2。反应结束后将 TAIL-PCR 产物按照“1.2.2”
项中的方法电泳、回收、克隆及测序。
1.2.4 生物信息学分析 利用 NCBI 的 Spidey
（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/spidey/）工具分析GAPDH
基因结构；利用 BDGP（http://www.fruitfly.org/seq_
tools/splice.html）预测 5’端上游转录起始位点；利
用 PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/
webtools/plantcare/html/）分析 GAPDH 基因启动子
的顺式作用元件。
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 15 期 2016 年 8 月

• 2723 •
表 2 TAIL-PCR 反应程序
Table 2 TAIL-PCR reaction process
反应 循环次数 温度设定
1 94 ℃、2 min
5 94 ℃、30 s，62 ℃、1 min，72 ℃、3 min
1 94 ℃、30 s，25 ℃、3 min，72 ℃、3 min
94 ℃、30 s，62 ℃、1 min，72 ℃、3 min
94 ℃、30 s，62 ℃、1 min，72 ℃、3 min
15
94 ℃、30 s，44 ℃、1 min，72 ℃、3 min
第 1 轮 TAIL-PCR
1 72 ℃、10 min
94 ℃、30 s，62 ℃、1 min，72 ℃、3 min
94 ℃、30 s，62 ℃、1 min，72 ℃、3 min
15
94 ℃、30 s，44 ℃、1 min，72 ℃、3 min
第 2 轮 TAIL-PCR
1 72 ℃、10 min
第 3 轮 TAIL-PCR 与第 2 轮 PCR 的条件相同

2 结果与分析
2.1 刺五加 GAPDH 基因 DNA 序列的克隆
以刺五加基因组 DNA 为模板，利用引物对
GAPDHQS-GAPDHQX 和 GAP11S-GAPBY3 进行
PCR 扩增，分别获得长为 2 680、664 bp 的条带（图
1），与预期长度相符。利用 DNAMAN 6.0 软件将 2
条片段序列进行拼接，获得长为 2 859 bp 的序列，
经 NCBI 的 BLAST 比对，确定该序列为刺五加
GAPDH 基因 DNA 序列，且其中包含起始密码子
ATG 和终止密码子 TAA，说明成功克隆得到了
GAPDH 基因的 DNA 全长序列。


M-Marker 1-引物 GAP11S 和 GAPBY3 的 PCR 扩增产物 2-引
物 GAPDHQS 和 GAPDHQX 的 PCR 扩增产物 3-第 1 轮
TAIL-PCR 扩增产物 4-第 2 轮 TAIL-PCR 扩增产物 5-第 3 轮
TAIL-PCR 扩增产物
M-Marker 1-PCR products amplified by GAP11S and GAPBY3
2-PCR products amplified by GAPDHQS and GAPDHQX
3-products of the primary TAIL-PCR 4-products of the secondary
TAIL-PCR 5-products of the tertiary TAIL-PCR
图 1 刺五加 GAPDH 基因及启动子的克隆
Fig. 1 Cloning of GAPDH gene and promoter from E.
senticosus
2.2 刺五加 GAPDH 基因 DNA 序列的分析
获得的刺五加 GAPDH 基因全长 DNA 序列中共
含有 12 个外显子和 11 个内含子，其中外显子的长度
变化幅度为 33～277 bp，内含子的长度变化幅度为
81～216 bp（图 2）。该基因在表达为成熟 mRNA 的
过程中，外显子与内含子的剪切都符合 GT-AG 原则，
即内含子的5’端剪切位点为GT，3’端剪切位点为AG。
内含子中（A＋T）的量为 60.78%～73.64%，（G＋C）
的量为26.36%～39.22%，（A＋T）的量显著高于（G＋
C）的量，与非编码区中具有较高的 AT 量相符。


-外显子 -内含子 ATG 为起始密码子，TAA 为终止密码子
- exons - introns ATG initiation codon, TAA termination codon
图 2 刺五加 GAPDH 基因的结构
Fig. 2 Genomic structure of GAPDH gene in E. senticosus
2.3 刺五加 GAPDH 基因启动子的克隆与生物信
息学分析
利用 3 条嵌套式引物，经过连续 3 轮 TAIL-PCR
扩增获得长 1 344 bp 的片段（图 1）。比对发现，该
片段的 3’端序列与“2.2”项中 GAPDH 基因的 5’
端序列完全重合，与预期相符，因此确定成功克隆
得到刺五加 GAPDH 基因的启动子序列。
刺五加 GAPDH 基因的转录起始位点为 A（标记
为+1），位于起始密码子 ATG 上游 61 bp 处，与多数
基因的转录起始位点多为 A 的特点相符（图 3）。利
5 000 bp
3 000 bp
2 000 bp
1 500 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
M 1 2 M 3 4 5 5’
ATG
3’
TAA
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 15 期 2016 年 8 月

• 2724 •


-TATA-box -CAAT-box ATG-起始密码子 +1-转录起始位点 A
-TATA-box -CAAT-box ATG -the initiation codon +1- the transcription start site A
图 3 刺五加 GAPDH 基因启动子序列
Fig. 3 Promoter sequence of GAPDH gene from E. senticosus
用 PlantCARE 分析的结果表明，GAPDH 的启动子
中存在典型核心启动元件 TATA-box 11 个、
CAAT-box 25 个。其中 TATA-box 位于−349、−943、
−1 013 bp 等处，CAAT-box 位于+14、−5、−150、
−385、−847、−1 045 bp 等处。另外，其中还含有多
种与激素应答、逆境胁迫和光响应等元件相关（表
3），如脱落酸响应顺式作用元件（ABRE）、水杨酸
响应顺式作用元件（TCA-element）、赤霉素响应元
件（ GARE-motif 、 P-box ）、生长素响应元件
（AuxRR-core，TGA-element）、应答光响应顺式作
用元件（AE-box、ATCT-motif、Box II、G-Box、
GAG-motif、I-box、Sp1、TCCC-motif 等）、厌氧诱
导必要的顺式作用元件（ARE）、涉及缺氧诱导的增
强子功能元件（GC-motif）、干旱诱导相关的 MYB
结 合 位 点 （ MBS ）、 MYBHv1 结 合 位 点
（CCAAT-box）、茉莉酸甲酯响应顺式作用元件
（CGTCA-motif，TGACG-motif）、真菌诱导子响应
元件（Box-W1）、胚乳表达相关元件（GCN4_motif，
Skn-1_motif）、醇溶蛋白代谢有关的顺式作用元件
（O2-site）、防卫和胁迫响应顺式作用元件（TC-rich
repeats）、昼夜节律顺式作用调控元件（circadian）
等。以上诸多顺式作用元件存在于 GAPDH 基因启
动子中，说明刺五加 GAPDH 基因的转录表达调控
与多种因素有关。
3 讨论
本研究通过 PCR和TAIL-PCR技术成功克隆得
到了长为 4 103 bp 的刺五加 GAPDH 基因 DNA 及
启动子序列，其中启动子序列长 1 304 bp。编码区
中存在 12 个外显子，11 个内含子，内含子的长度
变化幅度在 81～216 bp，与已报道的其他物种
GAPDH 基因相比，刺五加的 GAPDH 中内含子数
量偏多、长度偏长，而外显子与内含子的剪切均符
合 GT-AG 原则，这与其他物种内含子剪切的特征
相符[10]。刺五加 GAPDH 基因内含子中（A＋T）量
为 60.78%～73.64%，推测刺五加 GAPDH 基因内含
子可能在转录表达方面起重要作用[11]。
刺五加GAPDH基因的启动子除存在基本的调控
元件外，还含有多种与激素应答、逆境胁迫和光响应
等元件等，推测刺五加 GAPDH 基因的转录表达受到
多种环境因素和生理条件的调控。研究表明，GAPDH
基因在逆境胁迫下转录表达水平会出现明显变化[12]，
如水稻在水分胁迫下 GAPDH 基因转录表达会增
强[13]，推测刺五加的 GAPDH 基因可能参与逆境胁迫
应答，在抵抗逆境胁迫方面或许存在着重要的作用。
−1 242
−1 172
−1 102
−1 032
−962
−892
−822
−752
−682
−612
−542
−472
−402
−332
−262
−192
−122
−52
+19
+1
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 15 期 2016 年 8 月

• 2725 •
表 3 刺五加 GAPDH 基因启动子顺式作用元件分析
Table 3 Cis-acting regulatory element analysis of GAPDH gene promoter from E. senticosus
调控元件 拷贝数 序列 元件功能
5UTR Py-rich stretch 1 TTTCTTCTCT 提高转录水平
ABRE 2 ACGTGGC 脱落酸响应顺式作用元件
AE-box 1 AGAAACAT 部分光响应组件
ARE 4 TGGTTT 厌氧诱导必要的顺式作用元件
ATCT-motif 1 AATCTAATCC 光响应保守 DNA 的部分元件
AuxRR-core 1 GGTCCAT 生长素响应顺式作用调控元件
Box II 1 CCACGTGGC 部分光响应元件
Box-W1 2 TTGACC 真菌诱导子响应元件
CAAT-box 25 CAATT 启动子和增强子区的一般顺式作用元件
CCAAT-box 1 CAACGG MYBHv1 结合位点
CGTCA-motif 2 CGTCA 茉莉酸甲酯响应顺式作用元件
G-box 10 CACGTT 光响应顺式作用调控元件
GAG-motif 1 GGAGATG 部分光响应元件
GARE-motif 5 TCTGTTG 赤霉素响应元件
GC-motif 2 CCCCCG 涉及缺氧诱导的增强子功能元件
GCN4_motif 1 TGAGTCA 胚乳表达相关顺式调控元件
I-box 1 CTCTTATGCT 部分光响应元件
LAMP-element 1 CTTTATCA 部分光响应元件
MBS 2 CAACTG 干旱诱导相关的 MYB 结合位点
MRE 1 AACCTAA 光响应 MYB 结合位点
O2-site 1 GATGACATGA 醇溶蛋白代谢有关的顺式作用调控元件
P-box 2 CAACAAACCCCTT 赤霉素响应元件
Skn-1_motif 3 GTCAT 胚乳表达相关元件
Sp1 3 CC(G/A)CCC 光响应元件
TATA-box 11 TTTTA 据转录起始位点 30 个碱基的启动子中心元件
TC-rich repeats 2 ATTTTCTTCA 防卫和胁迫响应顺式作用元件
TCA-element 1 CAGAAAAGGA 水杨酸响应顺式作用元件
TCCC-motif 1 TCTCCCT 部分光响应元件
TCT-motif 1 TCTTAC 部分光响应元件
TGA-element 1 AACGAC 生长素响应元件
TGACG-motif 2 TGACG 茉莉酸甲酯响应顺式作用元件
box II 1 TCCACGTGGC 部分光响应元件
circadian 1 CAANNNNATC 昼夜节律顺式作用调控元件
TATCCAT/C-motif 1 TATCCAT 协同 G-box 作用参加糖抑制应答的顺式作用元件
W-box 2 TTGACC 补充诱导子，受伤及病原体应答

目前有关刺五加 GAPDH 基因内含子结构
和启动子的研究尚未见报道。本研究首次克隆
并分析了刺五加 GAPDH 基因的 DNA 及启动子
序列，为进一步研究该基因的表达调控和功能
奠定基础。
参考文献
[1] 邢朝斌, 吴 鹏, 陈 龙, 等. 刺五加 GAPDH 基因的
克隆及序列分析 [J]. 中草药, 2012, 43(1): 155-158.
[2] 中国药典 [S]. 一部. 2015.
[3] Morgante C V, Guimaraes P M, Martins A C, et al.
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 15 期 2016 年 8 月

• 2726 •
Reference genes for quantitative reverse
transcription-polymerase chain reaction expression
studies in wild and cultivated peanut [J]. BMC Res Notes,
2011, doi: 10.1186/1756-0500-4-339.
[4] Jungerius B J, van Laere A S, Te Pas M F, et al. The
IGF2-intron3-G3072A substitution explains a major
imprinted QTL effect on back fat thickness in a Meishan ×
European white pig intercross [J]. Genet Res, 2004, 84(2):
95-101.
[5] Lev-Maor G, Sorek R, Shomron N, et al. The birth of an
alternatively spliced exon: 3’ splice-site selection in Alu
exons [J]. Science, 2003, 300(5623): 1288-1291.
[6] Salgueiro S, Piguocchi C, Parry M A. Intron-mediated gusA
expression in tritordeum and wheat resulting from particle
bombardment [J]. Plant Mol Biol, 2000, 42(4): 615-622.
[7] 张 伟, 刘勋成, 赵金会, 等. 水稻组蛋白脱乙酰化酶
基因HDA705启动子的克隆与表达特性分析 [J]. 热带
亚热带植物学报, 2014, 22(1): 77-82.
[8] 陈迪新, 李艳梅, 郭国宁, 等. 桃 PG 基因启动子克隆
及序列分析 [J]. 华北农学报, 2014, 29(6): 52-57.
[9] 邢朝斌, 吴 鹏, 修乐山, 等. 刺五加功能基因密码子
偏好性的分析 [J]. 中草药, 2013, 44(5): 598-603.
[10] 张津京, 陈 辉, 冯志勇, 等. 斑玉蕈甘油醛-3-磷酸脱
氢酶基因克隆与序列分析 [J]. 食用菌学报 , 2011,
18(2): 5-9.
[11] 杨寅桂, 娄群峰, 陈劲枫, 等. 黄瓜CSHSP70基因内含
子结构分析 [J]. 中国农业科学 , 2007, 40(12):
2915-2919.
[12] Park S J, Huh J W, Kim Y H, et al. Selection of internal
reference genes for normalization of quantitative reverse
transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR)
analysis in the canine brain and other organs [J]. Mol
Biotechnol, 2013, 54(1): 47-57.
[13] Arumugam P M, Lihuang Z, Akiyama T. Molecular
cloning, characterization, expression and chromosomal
location of OsGAPDH, a submergence responsive gene in
rice (Oryza sativa L.) [J]. Theor Appl Genet, 2002,
105(1): 34-42.