全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45卷 第 8期 2014年 4月

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山药种质资源核糖体 rDNA-ITS 区序列分析
吴志刚 1*，范传颍 1, 2，包晓青 1, 2，陶正明 1*，姜 武 1
1. 浙江省亚热带作物研究所，浙江 温州 325005
2. 温州医科大学，浙江 温州 325035
摘 要：目的 分析 14种山药 Dioscoreae Rhizoma种质 ITS序列，为山药种质资源分子鉴别和进化关系研究提供依据。方
法 PCR 克隆扩增 ITS 序列并进行双向测序，Clustal X（v1.83）软件进行序列比对，Mega(V4.1)计算序列核苷酸比例及遗
传距离，并构建邻接树（Neighbor-joining，NJ）和最大简约树（Maximum parsimony，MP）。结果 14种山药种质 ITS序列
全长为 558～594 bp，其中 ITS1长度为 141～165 bp，ITS2长度为 146～158 bp；ITS序列存在大量的转换、颠换，转化/颠
换比率为 5.347，ITS1 和 ITS2 序列均显示 102 个变异位点；14 种山药种质 K2-P 遗传距离为 0～0.517 2；薯蓣 Dioscorea
opposita、褐苞薯蓣 Dioscorea persimilis、日本薯蓣 Dioscore japonica关系亲密，组成单一支系；参薯 Dioscorea alata与山薯
Dioscorea fordii关系亲密，聚为另一分支，并位于发育树基部。结论 ITS序列系统树为澄清山药类资源进化关系奠定了基
础，序列中丰富的变异位点为多基原山药鉴别提供了科学依据。
关键词：山药；ITS；亲缘关系；系统进化；分子鉴定
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)08 - 1136 - 07
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.08.018
Sequence analysis on rDNA-ITS region of germplasm resources from Dioscoreae
Rhizoma
WU Zhi-gang1, FAN Chuan-ying1, 2, BAO Xiao-qing1, 2, TAO Zheng-ming1, JIANG Wu1
1. Zhejiang Institute of Subtropical Crops, Wenzhou 325005, China
2. Wenzhou Medical University, Wenzhou 325035, China
Abstract: Objective To provide the scientific evidence for molecular identification and phylogenetic evolution by analyzing
internal transcribed spacer (ITS) sequences in 14 different germplasms from Dioscoreae Rhizoma. Methods The ITS regions
were cloned by PCR amplification and sequenced bi-directionally. The ITS sequences were aligned using Clustal X software
(version 1.83), the genetic distances were calculated using Mega software (version 4.1), and the phylogenetic trees were
constructed through the Neighbor-joining (NJ) and maximum parsimony (MP) methods. Results The length of ITS sequences
obtained ranged from 558 to 594 bp, of which ITS1 was from 141 to 165 bp and ITS2 was from 146 to 158 bp. There were a lot
of transitions and transversions in ITS sequences, and the transition/transversion ratio among 14 different germplasms was
5.347. Both in ITS1 and ITS2, 102 variable sites were further observed. The kimura 2-parameter (K2-P)genetic distance among
14 different germplasms ranged form 0 to 0.517 2. The phylogenetic trees suggested that there were close genetic relationship
among Dioscorea opposita, D. persimilis, and D. japonica, they grouped closely into Clade I; Furthermore, D. alata and D. fordii
also shared a closer genetic relationship comprised another clade (Clade II). Conclusion The phylogenetic analyses based on
ITS sequences can present a foundation for clearing the evolution of germplasm resources in Dioscoreae Rhizoma; The variable
bases can also provide reliable molecular evidences for identifying different genotypic germplasms of Dioscoreae Rhizoma.
Key words: Dioscoreae Rhizoma; ITS sequence; genetic relationship; phylogenetic evolution; molecular identification

收稿日期：2013-12-06
基金项目：浙江省重点实验室项目（2011E10015）；温州市科技项目（N20100003）
作者简介：吴志刚（1979—），男，博士，助理研究员，从事中药资源与药材质量研究。
*通信作者 吴志刚，助理研究员。E-mail: wuzhigang177@126.com
陶正明，副研究员。E-mail: zmtao2002@yahoo.com.cn
网络出版时间：2014-03-17 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.7501/j.issn.0253-2670.2014.08..html
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山药Dioscoreae Rhizoma为薯蓣属Dioscorea L.
周生翅组（Enantiophyllum Uline）植物，在热带与
亚热带地区广泛作为一年生作物生产，供人们食用
与药用[1]。我国是山药重要的驯化中心之一[2]，始
载于《山海经》，唐代《四时纂要》则有山药用种薯
节段栽培及制粉的记载[3]，宋代《图经本草》与《求
薯蓣苗》，明代《本草纲目》、清代《植物名实图考》
等书籍中均有山药生产利用的记载[4]。迄今，薯蓣
（怀山药）Dioscorea opposita Thunb.、参薯（淮山）
Dioscorea alata L.、褐苞薯蓣（广西山药）Dioscorea
persimilis Prain et Burkill、山薯（广东山药）Dioscorea
fordii Prain et Burkill 4种山药资源在我国大面积栽
培生产 [5]。关于山药类群的进化关系，有学者认
为普通山药 Dioscorea batatas Decne. 原产中国亚
热带地区，是由日本薯蓣 Dioscorea japonica
Thunb. 演化而来[6]；而参薯则可能原产孟加拉湾，
后经流通分布至东南亚，被认为国外亲缘野生种
Dioscorea Hamiltonii Hook. f. 与褐苞薯蓣杂交形
成[7]；山薯可能是野生种长期家化栽培形成[8]；褐
苞薯蓣被认为是薯蓣的一个种内变异类型[9]。可
见，我国山药的资源进化关系仍存在很多疑点，
需更多植物系统发育理论支撑。
植物核糖体 DNA（rDNA）是由串联重复排列
的单位组成，每个单位包括编码区和非编码的内
转录间隔区。其中，内转录间隔区（ internal
transcribed spacer，ITS）由于所受的选择压力小、
进化速率较快、稳定性好、测序方便，是研究植
物属间、种间、甚至种内等较低分类阶元系统发
育的重要基因片段[10]。目前，ITS序列在中药资源
近缘物种鉴定、种内不同品种遗传差异分析、种内
系统发育等方面广泛应用[11-12]。在薯蓣属种间系统
发育关系上，前人曾利用 trnL-F、matK、rbcL序列
评价[13-14]，认为中国台湾与内地分布的薯蓣属植物符
合 Ding 等[15]经典分类方法处理，该研究为薯蓣属植
物系统发育提供了一定依据。但对于我国众多山药资
源种间、种内的分子发育与鉴别，仍缺乏相应研究。
本实验通过收集国内不同种、及种下山药种质资源，
运用 ITS序列揭示分子系统发育关系，以期为我国山
药资源系统进化及鉴别提供科学依据。
1 材料与试剂
1.1 材料
以薯蓣 Dioscorea opposita Thunb. 及 3个近缘
种参薯 D. alata L.、山薯 D. fordii Prain et Burkill、
褐苞薯蓣 D. persimilis Prain et Burkill种内的 14种
山药种质为材料，野外采集新鲜嫩叶，立即用变色
硅胶快速干燥密封，室内置于−20 ℃下低温保存。
所有材料均由浙江省亚热带作物研究所李林研究
员鉴定，见表 1。
表 1 材料信息
Table 1 Information of materials
种质 编码 物种 采集地 种质 编码 物种 采集地
铁棍山药 TIS 薯蓣 D. opposita 河南温县 长仃小薯 CTS 薯蓣 福建南平
太谷山药 TGS 薯蓣 河南温县 乐南小薯 LNS 薯蓣 福建南平
花籽山药 HZS 薯蓣 河南温县 南平山药 NPS 薯蓣 福建南平
白玉山药 BYS 薯蓣 河南温县 白圆参薯 BSY 参薯 D. alata 浙江乐清
清源山药 QYS 薯蓣 河南温县 紫参薯 ZSY 参薯 浙江瑞安
水晶山药 SJS 薯蓣 河南温县 广东山药 GDS 山薯 D. fordii 浙江瑞安
海南山药 HNS 薯蓣 福建南平 广西山药 GXS 褐苞薯蓣 D. persimilis 浙江瑞安

1.2 试剂
Tris 碱，EDTA，DNTP mix Taq DNA pol缓冲
液（ 10×PCR 缓冲液，含 Mg2+），Taq DNA
polymerase（上海 SANGON 公司），ITS 扩增引物
（深圳华大基因），琼脂糖（上海 SANGON公司），
其他试剂均为分析纯。PCR 扩增产物纯化试剂盒
（BIO BASIC INC）。
2 方法
2.1 总 DNA 提取、PCR 扩增
DNA采用优化的 CTAB法提取[16]。DNA样品
经稀释后−20 ℃保存备用。0.8%琼脂糖凝胶电泳检
测 DNA提取效果。ITS扩增引物由杭州华大基因公
司合成， ITS-F：5’-TCCTCCGCTTATTGATAT CG-
3’，ITS-R：5’-GGAAGTAAAAGTCGTAAC AAGG-3’。
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PCR 扩增反应体系 20 μL：其中 10×缓冲液（含
Mg2+）2.0 μL，dNTP mix（dATP、dCTP、dGTP、
dTTP 各 2.5 nmol/L）1.6 μL，上下游引物（10
mmol/L）各 1 μL，5 U Taq酶 0.2 μL，模板（20 ng/L）
2.0 μL，ddH2O补齐至 20 μL。置于 PCR热循环仪
上（德国 EPPENDOLF公司），经 94 ℃预变性 2 min
后；94 ℃变性 30 s，53 ℃复性 30 s，72 ℃延伸
60 s，完成 35个循环后；72 ℃下延伸 5 min。
2.2 目的片段的回收及测序
取 PCR产物 20 μL于 1.5%琼脂糖凝胶电泳仪
检测，选取明亮目的条带，消毒刀片切取并用
DNA 凝胶提取试剂盒纯化回收，连接到 PMD-18
载体（Takara公司），连接产物转化大肠杆菌 DH5α
感受态细胞，经 X-gal/IPTG 平板筛选，从蓝/白
菌落中挑选白色菌落提取质粒按“2.1”项方法进
行 PCR扩增验证，确定含有效插入的克隆。选取
具有阳性效果的菌液，送至杭州华大基因公司进
行测序，为确保序列的正确，每个样品至少送样
3份。
2.3 序列数据分析
Clustal X（version 1.83）对 14种山药种质序列
进行比对，Mega version 4.1 修剪整齐并去除缺隙
（gap），统计各序列核苷酸组成比例及遗传距离，遗
传距离采用 Kimura two-parameter（K2-P）模型评价。
以根状茎组（Stenophora Uline）的粉背薯蓣 Dioscorea
collettii HK. f. var. hypoglauca (Palibin) Pei et C. T.
Ting（DQ267931）为外类群，Mega（version 4.1）
软件中采用邻接法（Neighbor joining，NJ）和最大
简约法（Maximum parsimony，MP）构建山药资源
分子系统发育树，树状图中每一分支进行靴带分析
（bootstrap），自展重复数设定为 1 000次，以评价树
状图的可行度。
3 结果与分析
3.1 PCR 扩增
PCR 扩增产物直接测序易受引物无法验证的
影响，降低测序准确度。实验采用克隆方法获取 14
种山药种质的 ITS序列（包含 18 S rDNA、ITS1、
5.8 S rDNA、ITS2和 26 S rDNA），PCR检测 600 bp
左右清晰条带（图 1），与预期片段大小相符合，即
为目的条带，可作测序使用。
3.2 ITS 序列长度
14种山药种质序列经过校正后，在 NCBI上进
行 Blast相似性搜索，确定序列为目标序列。结果

图 1 14 种山药种质 ITS 序列的 PCR 扩增图谱
Fig. 1 PCR amplification of ITS sequence from
14 germplasms of Dioscoreae Rhizoma
表明，14种山药种质 ITS序列具有较高同源性，长
度以乐南山药最短（558 bp），铁棍山药、太谷山药、
花籽山药等 7种山药种质最长（594 bp）（表 2）。根
据 NCBI中近缘种日本薯蓣 D. japonica（FJ860085）
序列范围，界定出 ITS1、ITS2及其他部分序列的区
域（表 2）。其中，ITS1长度为 141～165 bp；ITS2
长度为 146～158 bp；5.8 S具有高度保守性，长度
均为 156 bp。通常，G＋C 量是反映亲缘关系的重
要依据，亲缘关系越亲近其 G＋C量相差越小[17]。
从表 2中可发现，14种山药种质 ITS1区 G＋C量
为 43.0%～51.9%，ITS2 区 G＋C 量为 47.3%～
59.9%，可见 ITS1及 ITS2区G＋C量均有明显差异，
暗示各山药种质遗传差异较大。
3.3 ITS 序列差异及遗传距离
遗传距离显示，铁棍山药、太谷山药、花籽山
药、白玉山药、水晶山药、清源山药、海南山药之
间遗传距离为 0，紫参薯与它们之间遗传距离最大，
为 0.517 2，提示紫参薯与这些山药种质遗传关系疏
远；广西山药与乐南山药遗传距离较小，为 0.012 7，
表明两者亲缘关系十分相近（表 3）。
14 种山药种质 ITS 序列存在丰富的碱基变
异，当空位始终作缺失处理时，对位排列后 ITS1
共有 102个变异位点，其中 90个简约信息位点，
12个单一变异位点（图 2）；ITS2也存在 102个
变异位点，其中 86 个简约信息位点，16 个单一
变异位点（图 3）。铁棍山药、太谷山药、花籽山
药、白玉山药、水晶山药、清源山药及海南山药
的 ITS序列完全一致，不存在任何碱基转化或颠
换。14种山药种质 ITS序列转换/颠换比率为 5.347，
以碱基转化置换的形式为多，尤其以 T→C 碱基转
化率为高，转化率达到 39.95%，这与 T、C碱基的
结构易发生错配有关。一般亲缘关系接近的物种具
有更高的转换差异比例，这种差异在亲缘关系接近
2 000 bp
1 000 bp
500 bp
100 bp

Marker TIS TGS HZS BYS QYS SJS HNS CTS LNS NPS BSY ZSY GDS GXS
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表 2 14 种山药种质 ITS 序列长度及碱基频率分布
Table 2 Length and base frequency in ITS sequences from 14 germplasms of Dioscoreae Rhizoma
种质
ITS1 ITS2 全长 ITS
长度 / bp (G＋C) / % 长度 / bp (G＋C) / % 长度 / bp (G＋C) / %
TIE 165 43.0 158 49.4 594 46.1
TGS 165 43.0 158 49.4 594 46.1
HZS 165 43.0 158 49.4 594 46.1
BYS 165 43.0 158 49.4 594 46.1
QYS 165 43.0 158 49.4 594 46.1
SJS 165 43.0 158 49.4 594 46.1
HNS 165 43.0 158 49.4 594 46.1
CTS 156 51.9 149 56.4 575 51.1
LNS 141 43.2 146 47.2 558 45.9
NPS 156 52.0 149 55.7 575 51.0
BSY 153 51.7 154 51.3 577 48.7
ZSY 151 47.7 151 60.3 574 51.6
GDS 148 50.0 151 54.3 569 49.6
GXS 141 44.7 155 48.4 567 46.5
平均 157 45.8 154 51.3 582 47.7

表 3 14 种山药种质 ITS (ITS1＋ITS2) 序列的 K2-P 模型遗传距离
Table 3 K2-P model genetic distances of ITS (ITS1 + ITS2) sequences among 14 germplasms from Dioscoreae Rhizoma
种质 TIE TGS HZS BYS QYS SJS HNS CTS LNS NPS BSY ZSY GDS
TIE
TGS 0
HZS 0 0
BYS 0 0 0
QYS 0 0 0 0
SJS 0 0 0 0 0
HNS 0 0 0 0 0 0
CTS 0.406 9 0.406 9 0.406 9 0.406 9 0.406 9 0.406 9 0.406 9
LNS 0.182 8 0.182 8 0.182 8 0.182 8 0.182 8 0.182 8 0.182 8 0.442 7
NPS 0.406 9 0.406 9 0.406 9 0.406 9 0.406 9 0.406 9 0.406 9 0.002 5 0.442 7
BSY 0.465 3 0.465 3 0.465 3 0.465 3 0.465 3 0.465 3 0.465 3 0.418 8 0.464 1 0.414 3
ZSY 0.517 2 0.517 2 0.517 2 0.517 2 0.517 2 0.517 2 0.517 2 0.460 8 0.515 6 0.465 6 0.304 4
GDS 0.468 2 0.468 2 0.468 2 0.468 2 0.468 2 0.468 2 0.468 2 0.373 4 0.433 7 0.377 7 0.257 9 0.283 9
GXS 0.179 7 0.179 7 0.179 7 0.179 7 0.179 7 0.179 7 0.179 7 0.433 4 0.012 7 0.433 4 0.459 6 0.505 4 0.428 8
转换/颠换 R = 5.347
transition/transversion R = 5.347
的类群中更为显著。广西山药与乐南山药亲缘关系
近，转换/颠换比率为 2.021，而亲缘关系疏远的紫
参薯和铁棍山药转换/颠换比率则为 0.874，表明碱
基变异中以颠换多于转换。
3.4 ITS 序列的山药资源系统发育树的构建
根据 14种山药种质测序结果，外加 NCBI的日
本薯蓣（JAP）序列（FJ860085），将 ITS1、5.8 S、
ITS2序列区作为一个共同数据矩阵运算，以粉背薯
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TIE CACAAATATG AAGGCCTCGT TGCTATTATT CACCCTGTCT TACTTCTGTT TCCTTGGTGG GTCGCCCCCA CAGGACAAAA ACCTTTTGTT TGCAATCACG TCAGTAACAA ATTAAAATTA C [121]
TGS .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... . [121]
HZS .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... . [121]
BYS .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... . [121]
QYS .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... . [121]
SJS .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... . [121]
HNS .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... . [121]
CTS ..AGTGGTCT ..CCAG.TC. ..T.CCG.C. .TGTTGC..C GGGGCGCCC. G....C.G.C .GG..T..GG GT.....CT. .A..C...CG .AACT.TGA. ..T.AGTA.. C......... A [121]
LNS .CT.G.GT.. T....T.T.C ......CTC. T....A.... ...C.TC... ....C..... .........G AT........ ...C....C. ..A....... ..T.A..A.. C.....G... . [121]
NPS ..AGTGGTCT ..CCAG.TC. ..T.CCG.C. .TGTTGC..C GGGGCGCCC. G....C.G.C .GG..T..GG GT.....CT. .A..C...CG .AACT.TGA. ..T.AGTA.. C......... A [121]
BSY ..G.GTATCC ..CT..AT.. CT..G..GCC TCGG.GAAGC ...CCGGACC ..GCGCCCC. .GG......G GC........ .A..C.GT.C .T.GT.G.TA ..T.AGTGTC T.ATT.G.C. A [121]
ZSY ..G..C.T.T TGCAT.CT.C .CT.G..GC. TCGG.G.GTC .G.C....GG GGAGGC.CCC AAG......G G...TTTTT. .A..C....C .TAGTGGT.T ..T.AGCA.. CCA.....C. A [121]
GDS .CG.GT.TAC ..CT..CT.C CTA.G..GCC TCGG.G.ATC AG.CCGGCCC .GTAAAAC.. .AG......C G.....CCT. .A..C.GT.. .TAGTGG..T ..T.AGTA.. .CA.....C. A [121]
GXS .CT.G.GT.. T....T.T.C ......CTC. T....A.... ...C.TC... ....C..... .........G AT........ ...C...... .......... ..T.A..A.. C.....G... . [121]
图 2 14 种山药种质 ITS1 序列的比对结果
Fig. 2 Comparison on ITS1 sequences from 14 germplasms of Dioscoreae Rhizoma
TIE TGTACCCTCA AGCTTTGCTT GGTGTTGGGC GTGTCTCTGA GACTCCCTTA AAGTATTGGC AGCCGGCCTA GGTTTCGGCG CAGCACAAGT CGCACTCTCT ATCAGCAAAG GTAGCACCAT TAGCCTTTTT TTCA [134]
TGS .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .... [134]
HZS .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .... [134]
BYS .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .... [134]
QYS .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .... [134]
SJS .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .... [134]
HNS .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .... [134]
CTS .CAC.A.... ...C.C.... ...A...... AA.CGGTCCG CGTG..TCA. .TCG.CC... T.GGTCTTCT .CCCC.T... TT.TGG..AC TT.G..AAAG GGTGTTCGG. AGTA.G..G. A.A..CA... C.A. [134]
LNS ......T... ....C..... .........T .......CT. ........C. ..AC...... .......G.. .A........ ...T...TC. ...G..T.GC .CTCAT..C. ACGA.....A A..TACA... ..AC [134]
NPS .CAC.A.... ...C.C.... ...A...... AA.CGGTCCG CGTG..TCA. .TCG.CC... T.GGTCTTCT .TCCC.T... TT.TGG..AC TT.G..AAAG GGTGTTCGG. AGTA.G..G. A.A..CA... C.A. [134]
BSY .CA....CT. ...ACA.... AT.......A C.ACGG..CG T.G.T..CC. ...A...... G.AGT.G.AG .TCC..T... T..T.ATTC. .T.G..T.TG T.AG..GCT. CCCC.G..G. A.A..AA... ..TC [134]
ZSY .CA......G G..CCGT.CC ..C......G C...GATCT. CGGA...CG. ...A.G.... G.AGCCG.CT .C.C..A... T..T.ATTC. .T.G..GGGG GG.GA..GC. ..CTTG..G. ..A...A..C ..A. [134]
GDS .CA....... ....CA.... .........A C..CGGTACG CGT....CA. .TCG...... G.T.ACGTCG .C..C.A... T..T.ATCA. .T.GT.ACTG G.A.T.GTC. CGCA.G..G. ..A..AAC.. C.G. [134]
GXS ......T... ....C..... .........T .......GT. ........C. ..AC...... .......G.. .A........ ...T...TC. ...G..T.GC .CTCAT..C. ACGA.G...A A..TACA... ..AC [134]
图 3 14 种山药种质 ITS2 序列的比对结果
Fig. 3 Comparison on ITS2 sequences from 14 germplasms of Dioscoreae Rhizoma
蓣为外类群，gap作缺失状态分析，MEGA对位排
列后 ITS长度为 571位点，其中可变位点 361个，
系统发育信息位点255个，分别占序列长度的63.2%
和 44.6%。邻接法和最大简约法构建的系统树在拓
扑结构上基本一致，仅在自展支持率上略有差异。
系统树（图 4）表明，15个种质（包含日本薯蓣）
可聚为 2个支系。其中，分支 I（Clade I）中包含山
薯和参薯 2个物种，紫参薯与广东山药在 52%以上
支持率下先聚成小分支，白圆参薯与该分支组成姊
妹群，两者支持率在 98%以上。分支 II（Clade II）
中则包含日本薯蓣、薯蓣和褐苞薯蓣 3个基原山药；
薯蓣种下亲缘关系十分相近，铁棍山药、太谷山药、
花籽山药、水晶山药、清源山药、白玉山药、海南

图 4 邻接法、最大简约法构建的山药资源系统发育树
Fig. 4 Phylogenetic trees of Dioscoreae Rhizoma resource
constructed using NJ and MP methods

HNS
QYS
BYS
HZS
TGS
TIE
SJS
LNS
GXS
CTS
NPS
JAP
BSY
ZSY
GDS
薯蓣




褐苞薯蓣
薯蓣
日本薯蓣
参薯
山薯
粉背薯蓣


周生翅组




根状茎组

CladeII
CladeI
0.05
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山药等 7个种质，以及长仃小薯、南平山药 2个种
质均在 99%以上支持率下相聚。值得注意的是，薯
蓣种下的乐南山药与褐苞薯蓣紧密相聚，两者相聚
得到 94%以上的支持。日本薯蓣位于分支 II的基部，
在 51%以上支持率下与薯蓣、褐苞薯蓣构成的支系
相聚。
4 讨论
4.1 基于 ITS 序列的山药资源系统进化分析
在薯蓣属中，已有研究从叶片气孔、维管束、
花粉类型、淀粉粒形态、染色体数目等方面解析薯
蓣属原始演化过程，认为根状茎组是最原始的组，
而周生翅组则是最进化的自然类群[18]。但位于周生
翅组中的山药其进化关系如何尚无定论。本实验基
于 ITS序列分析表明，参薯与山薯关系亲密，严格
聚合在一起（Clade II），在系统位置上位于发育树
基部。参薯在我国野生种未见分布，被推断认为是
由亲缘野生种D. hamiltonii和褐苞薯蓣杂交而来[7]，
而本实验 ITS表明，进化关系上参薯要先于褐苞薯
蓣，并不支持这种推断。其次，薯蓣、褐苞薯蓣、
日本薯蓣关系亲密，组成单一支系（Clade I）。原产
我国的薯蓣，有学者推断是由日本薯蓣演化而来[6]。
在支系 I 中日本薯蓣位置孤立位于支系基部，相比
薯蓣的进化更为原始，ITS 进化支持这种推断。山
药类群具有膨大的地下块茎，多为 1年生，染色体
X＝10，均为多倍体等共同特征，而块茎类的原始
类型很可能是从二倍体根茎组祖先分化而来[2]。先
前，本课题组曾利用 rbcL序列研究认为山药是单系
群，起源于共同的祖先[19]。本实验以根状茎组的粉
背薯蓣（2n＝40）作外类群置根分析表明，各山药
种质遗传差异均基于单系群间的变化，进一步支持
块茎类山药属单系群观点，共同的祖先很可能是由
二倍体根茎组演化而来。
4.2 褐苞薯蓣与薯蓣亲缘关系探讨
经典分类学上，褐苞薯蓣与薯蓣主要分类依据
是薯蓣叶缘常 3裂、叶形变异大，褐苞薯蓣茎常 4～
8条棱，叶表面网脉明显，在形态上两者差异较大。
但方玉霖等[20]通过叶脉特征观察，阐明两者均为弧
形脉；杭悦宇等[21]从淀粉形态上获悉两者均为单
粒，且脐点、层纹清晰；秦慧贞等[2]也从染色体上
证实两者均为多倍体；郑玉红[22]综合气孔类型、
叶脉特征、淀粉粒形态、染色体数目等 45个广义
形态学性状，揭示薯蓣和褐苞薯蓣单独聚为一类，
关系亲密。可见，在微观形态学上两者亲缘关系相
近。《广西中药材标准》把广西山药基原植物记载为
褐苞薯蓣[23]。据考证，广西山药从清乾隆年间由野
生引为家种[24]，当时野生种很可能为薯蓣，经过悠
久栽培形态发生了变异，并进一步演化成薯蓣的一
种变异类型，订为褐苞薯蓣。刘玉萍等[9]曾通过 18 S
rRNA 测序研究表明，薯蓣与褐苞薯蓣同源性达到
了 100%，遗传距离为 0，并推测褐苞薯蓣是薯蓣种
的种内变异类型。本实验 ITS的研究显示，褐苞薯
蓣与薯蓣种内的乐南山药紧密聚合一起，得到 94%
以上自展率支持，两者遗传距离仅为 0.012 7，进一
步证实褐苞薯蓣和薯蓣具有十分相近的亲缘关系，
支持刘玉萍的观点。
4.3 ITS 序列差异在多基原山药鉴别中的意义
我国商品山药主要来源于薯蓣、参薯、褐苞薯
蓣、山薯等 4种植物，其中薯蓣为《中国药典》2010
年版收载品种，其它在南方各省作为地方习用山药
药材[5,25]。此外，日本薯蓣在日本也作为药材使用，
我国安徽、江苏、浙江等地常有分布，但在我国并
未进入商品药材使用阶段。山药栽培变异大、来源
众多，且常受环境、栽培措施影响，仅从形态学鉴
别各基原药材较难。DNA作为植物遗传信息载体，
从基因水平鉴别多基原药材更具优势。本实验中，
14 种山药种质存在丰富的碱基差异，ITS1、ITS2
区均具有 102个碱基差异，可为山药准确鉴定提供
可靠的依据。此外，环境变迁也可能导致基因型的
变化，如河南产区的 6个薯蓣种质无碱基变化，而
在福建产区 4个薯蓣种质却存在碱基变异，两个产
区之间碱基差异明显，这种环境与碱基差异的关系
在鉴别地道药材中可发挥积极的作用。
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中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45卷 第 8期 2014年 4月

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