全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 8 期 2016 年 4 月

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• 药理与临床 •
三七总皂苷抑制大鼠全脑缺血后海马 CA1 区神经元凋亡及其机制研究
贺 旭 1, 2，葛金文 3，邓长青 3，郭太平 4，潘爱华 1，李志远 1*
1. 中南大学基础医学院 人体解剖与神经生物学系，湖南 长沙 410013
2. 益阳医学高等专科学校 解剖教研室，湖南 益阳 413000
3. 湖南中医药大学中西医结合学院，湖南 长沙 410208
4. 云南中医学院针灸推拿康复学院，云南 昆明 650500
摘 要：目的 探讨三七总皂苷（TSPN）抑制大鼠全脑缺血后海马 CA1 区神经元的凋亡作用及其相关机制。方法 采用四
血管阻断法制备大鼠全脑缺血模型，缺血后 30 min 再灌注；大鼠分成假手术组、模型组和 TSPN 组。TSPN 组 ip 不同剂量
（25、50、75、100 mg/kg）TSPN。再灌注第 14 天，通过海马 CA1 区尼氏染色和大鼠的生存率确定 TSPN 发挥神经保护作
用的最佳剂量。对模型组和最佳剂量 TSPN 组大鼠在不同再灌注时间点（1、3、7、14 d）进行神经功能评分，采用免疫组
化法观察 CA1 区 Caspase-3、Bcl-2、Bax 的阳性细胞密度，并采用免疫印迹技术检测 Caspase-3、Bcl-2、Bax 蛋白在海马的
表达水平。结果 75 mg/kg TSPN 组大鼠生存率为 100%，CA1 区神经元密度显著高于模型组和其他剂量 TSPN 组（P＜0.05）；
TSPN（75 mg/kg）组神经功能评分显著少于模型组（P＜0.01）；TSPN（75 mg/kg）组 CA1 区 Caspase-3 阳性细胞密度在全
脑缺血第 7、14 天显著低于模型组（P＜0.001）；20 000 的 Caspase-3 第 3、7、14 天的蛋白水平及 17 000 的 Caspase-3 在第
7、14 天蛋白水平均显著低于模型组（P＜0.001）；TSPN（75 mg/kg）组 CA1 区 Bcl-2 阳性细胞密度及蛋白水平在第 7、14
天高于模型组（P＜0.001），而 Bax 阳性细胞密度第 7、14 天低于模型组（P＜0.001），TSPN 组第 3、7、14 天海马 Bax 蛋
白水平显著低于模型组（P＜0.001）；TSPN 组 Bcl-2 和 Bax 阳性细胞及蛋白水平的比值在第 7、14 天显著高于模型组（P＜
0.001）。结论 TSPN 可通过上调 Bcl-2 和 Bax 阳性细胞和蛋白水平的比值，减少 Caspase-3 的活化而抑制全脑缺血后大鼠海
马 CA1 区神经元的凋亡。
关键词：三七总皂苷；Bcl-2/Bax；凋亡；Caspase-3；海马 CA1 区；全脑缺血
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2016)08 - 1337 - 08
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.08.015
Inhibition and machanisms of total saponins from Panax notoginseng on apoptosis
of hippocampal CA1 subfield neurons of rats following global cerebral ischemia
HE Xu1, 2, GE Jin-wen3, DENG Chang-qing3, GUO Tai-ping4, PAN Ai-hua1, LI Zhi-yuan1
1. Department of Anatomy and Neurobiology, School of Basic Medical Science, Central South University, Changsha 410013, China
2. Department of Anatomy, Yiyang Medical College, Yiyang 413000, China
3. Department of Integrated Traditional and Western Medicine, Hunan University of Traditional Chinese Medicine, Changsha, 410208, China
4. Acupuncture-moxibustion-Tuina and Rehabilitation School, Yunnan University of Traditional Chinese Medicine, Kunming 650500, China
Abstract: Objective To explore whether total saponins of Panax notoginseng (TSPN) can protect hippocampal CA1 subfield neurons
against apoptosis following global cerebral ischemia via up-regulating the Bcl-2/Bax ratio and preventing Caspase-3 activation.
Methods Using four-vessel occlusion method to build the global cerebral ischemia model and the ischemia time was 30 min. All
rats were divided into Sham group, vehicle group, and different doses (25, 50, 75, and 100 mg/kg) of TSPN groups. The rats in

收稿日期：2015-11-21
基金项目：国家自然科学基金资助项目（81171037/H0903）；湖南省科技厅创新平台与人才计划项目（2015JC3129）；湖南省博士创新科研课
题（CX2014B099）；湖南省教育厅课题（13C958）；益阳市科技局课题（2015JZ42）
作者简介：贺 旭（1984—），男，在读博士，讲师，主要研究方向为中药在心脑血管疾病神经发生与神经再生中的作用。
Tel: 13787196994 E-mail: Hexu0628@163.com
*通信作者 李志远（1965—），男，博士，博士生导师，教授，主要研究方向为神经干细胞与电生理。
Tel: (0731)82650356 E-mail: li_zhiyuan@gibh.ac.cn
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TSPN groups were ip administered with TSPN. The dose of TSPN was suspended in 0.9% saline (10 g/L), while rats in vehicle group
were treated with equal volume of 0.9% saline, one injection per day. Compared the survival rate and hippocampal CA1 subfield
neuronal density by Nissl staining after reperfusion of 14 d to make sure the best dose of TSPN for neuroprotection. Then to evaluate
the neurological score and investigate the expression level of the Caspase-3, Bcl-2, and Bax in the hippocampus CA1 region at days 1,
3, 7, and 14 post-ischemia by immunohistochemistry; In addition, the Western-blotting was adopted to test the protein level of these
three proteins. Results The survival rate of the rats in 75 mg/kg TSPN groups was 100%, and its neuronal density was significantly
higher than that in vehicle group and other doses of TSPN groups (P < 0.05); The neurological score in TSPN group was significantly
less than that in vehicle group (P < 0.01); The Caspase-3 neuronal density in the CA1 subfield of TSPN group on days 7 and 14 was
significantly less than that in vehicle group (P < 0.001); The statistical meaning existed about the protein level of Caspase-3 with
molecular weight of 20 000 on days 3, 7, and 14 and 17 000 on days 7 and 14 in two groups (P < 0.001). The neuronal density of Bcl-2
cells in the CA1 subfield and Bcl-2 protein level in the hippocampus of TSPN group at days 7 and 14 was significantly higher than that
in vehicle group (P < 0.001); Besides, the Bax neuronal density at days 7 and 14 was significantly lower than that in vehicle group (P <
0.001); And its protein level of the hippocampus was less than that in vehicle group at days 3, 7 and 14 (P < 0.001). The results of ratio
of Bcl-2/Bax from not only the neuronal density but also the protein expression demonstrated that the Bcl-2/Bax ratio in TSPN group
was significantly higher than that in vehicle groups on days 7 and 14 (P < 0.001). Conclusion TSPN can protect the hippocampal
CA1 subfield neurons against apoptosis following global cerebral ischemia in adult rats via up-regulating the Bcl-2/Bax ratio and
preventing Caspase-3 activation.
Key words: total saponins of Panax notoginseng; Bcl-2/Bax; apoptosis; Caspase-3; CA1; global cerebral ischemia

缺血性脑卒中是全球最常见的死亡率和致残
率均较高的脑血管疾病之一。细胞凋亡是涉及一系
列基因的激活、表达以及调控等因素作用的一种主
动死亡过程，其目的是为维持内环境稳定。海马
CA1 区的锥体神经元对全脑缺血引起的损伤非常
敏感，再灌注 2～4 d 后该部位出现锥体神经元迟发
性死亡，而海马其他区域包括齿状回和 CA3 区以及
大部分皮质神经元、侧脑室的室管膜区所产生的细
胞基本上未受损伤[1-2]。临床研究也表明心脏骤停或
心肺搭桥手术之后再灌注数天后海马 CA1 区神经
元出现迟发性神经元坏死（细胞凋亡）[3]。
三 七 总 皂 苷 （ total saponins of Panax
notoginseng，TSPN）是从三七中提取的多种皂苷活
性物质，具有活血祛瘀、通脉活络的功效。体外实
验表明 TSPN 能促进抑凋亡基因的表达，抑制促凋
亡蛋白的表达而抑制缺氧后复氧诱导的神经元凋
亡[4-5]，Li 等[6]研究发现 TSPN 可明显减少脑缺血部
位 TUNEL 标记的阳性细胞，降低凋亡基因
Caspase-1 和 Caspase-3 的表达。本实验通过四血管
阻断法建立全脑缺血模型[7-8]，通过尼氏染色和大鼠
的生存率确定 TSPN 的最佳剂量，然后进行神经功
能评分，采用免疫组织化学方法观察全脑缺血后 ip
给予 TSPN 不同时间后大鼠海马 CA1 区 Bcl-2、Bax
以及 Caspase-3 的阳性细胞数变化，采用免疫印迹
技术验证这3个凋亡相关蛋白在全脑缺血后第1、3、
7、14 天 4 个时间点海马的表达变化。与此同时，
比较 TSPN 组和模型组 Bcl-2/Bax 值（细胞数目和
蛋白水平）的变化，探讨 TSPN 在全脑缺血中发挥
神经保护作用是否通过上调 Bcl-2/Bax 值抑制
Caspase-3 的活化而减少神经元的凋亡。
1 材料与方法
1.1 实验动物
SPF 级雄性 SD 大鼠，8 周龄，体质量 250～290
g，由中南大学湘雅医学院实验动物中心提供，许
可证号 SCXK（湘）2009-0012。所有动物适应环境
5 d 后开始实验。模型制作过程中最大程度减少动
物的痛苦和动物使用的数量，整个实验程序都通过
中南大学伦理委员会的批准。
1.2 主要仪器、药品和试剂
珊顿冰冻切片机（Shan Don 公司）；Kopf 脑立
体定位仪（ David KOPF Instruments 公司）；
GX.SS.22-3 手术显微镜（上海医疗器械股份有限公
司）；Olympus BX67 荧光显微镜（奥林巴斯）；Western
仪器（Bio-Rad 公司）；TSPN（HPLC 测得总皂苷质
量分数≥98%，四川成都麦卡希化工有限公司，批号
12052901）；兔抗 Bcl-2 抗体（Santa Cruz Biotech 公
司）；兔抗 Bax 抗体、兔抗 Caspase-3 抗体（Abcam
公司）；鼠抗 β-actin 抗体（GenScript 公司）。
1.3 大鼠全脑缺血模型制备
采用四动脉血管阻断法制备全脑缺血模型[8]。大
鼠 ip 1%戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉，仰卧固定在
Kopf 脑立体定位仪台面；颈前正中切口，分离双侧
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颈总动脉；俯卧位电凝双侧椎动脉造成永久性闭塞；
第 2 天乙醚吸入麻醉大鼠，拉出颈总动脉，微动脉
夹阻塞血管 30 min，松开微动脉夹后实行再灌注。
1.4 分组及给药
大鼠随机分为假手术组、模型组、TSPN 组，
假手术组只分离两侧颈总动脉，不夹闭，其余大鼠
均按“1.3”项方法制备模型。假手术组不给任何药
物干预；模型组大鼠脑缺血30 min后 ip等体积0.9%
NaCl，每天 1 次；TSPN 组大鼠脑缺血 30 min 后 ip
不同剂量（25、50、75、100 mg/kg）的 TSPN（以
0.9% NaCl 溶解至质量浓度 10 g/L），每天 1 次，连
续 14 d。模型制备 14 d 后，通过尼氏染色和大鼠的
生存率确定 TSPN 发挥神经保护作用的最佳剂量。
再灌注后 1、3、7、14 d 对假手术组、模型组以及
最佳剂量的 TSPN 组大鼠进行神经功能评分，观察
各组大鼠海马 Bcl-2、Bax 以及 Caspase-3 的阳性细
胞及蛋白水平（假手术组在再灌注后 14 d 处死大鼠
作为参照）。
1.5 神经功能评分
当大鼠恢复意识能进行活动后在再灌注第 1、
3、7 和 14 天分别进行神经功能评分，主要检测运
动、感觉、反射和平衡能力。参考 Shi 等[9]及 Lemay
等[10]制定的 25 分制进行行为评分：评分＜10 分为
轻度缺血损害，＞10 分为重度缺血损害。
1.6 组织样本处理和指标检测
深度麻醉大鼠，灌注取出脑组织，4 ℃后固定
过夜，梯度沉糖。冰冻切片机进行海马冠状位切片，
采用邻切法，切片厚度 30 μm，放入组织培养板中，
待测。
尼氏染色：漂洗脑片；贴片、晾干组织；二甲
苯脱脂；梯度复水；移液枪点滴 1%的焦油紫，75%
酒精定色，酒精脱水；二甲苯脱脂；中性树脂封片。
免疫组织化学染色：采用 ABC-DAB 法进行染
色。脑片以 3% H2O2 处理 30 min 以消除内源性过氧
化物酶；5%山羊血清＋0.1% tritonX-100 磷酸缓冲
液孵育 2 h；分别加入一抗 Bcl-2（1∶1 000）、Bax
（1∶500）、Caspase-3（1∶1 000），4 ℃孵育过夜；
经山羊抗兔二抗（1∶400）处理，反应 1 h 后在提
前 30 min 配好的抗生物素-卵白素-辣根过氧化物酶
复合物（ABC）溶液孵育 2 h；DAB 显色。Bax 的
实验步骤需进行抗原修复：脑片经过 3% H2O2 处理
30 min 后抗原修复，将盛有柠檬酸钠（pH＝6.0）
的 1 mL EP 管中放入 92 ℃水浴锅中，待 EP 管里的
温度达到 92 ℃时，放入组织，时间为 3 min；组织
恢复到室温（22±2）℃，漂洗；然后血清孵育，
其他实验步骤相同。所有的免疫组织化学片子都经
过苏木素复染。阴性对照：用正常马血清或者磷酸
盐缓冲液代替一抗，以排除二抗的非特异性染色，
结果为阴性。所有组织切片均在奥林巴斯（BX67）
显微镜下完成，拍照时同一倍数下组织的曝光度和
像素保持一致。在目镜×20 视野下计数阳性细胞密
度（计数每毫米的阳性细胞数），每个时间点取 5
个脑组织，每个脑组织挑选 3 个视野，计算平均值。
1.7 Western blotting 法检测相关蛋白表达
麻醉大鼠，冰上操作迅速分离海马，按照组织
与蛋白提取剂 1∶10（g/mL）的比例稀释，用电动
匀浆器碎解组织。4 ℃低温离心，12 000 r/min 离心
20 min，收集上清液，测定蛋白浓度。用 SDS-PAGE
凝胶电泳，每个泳道上载 50 μg 总蛋白。电泳分离
蛋白转移至 PVDF 膜（Bio-rad 公司实验室）上，
Caspase-3 转膜约 40 min，Bax、Bcl-2 转膜约 30 min。
将含有目的蛋白的一抗（Bcl-2，1∶200；Bax，1∶
200；Caspase-3，1∶1 000）孵育，4 ℃过夜。1×
TBST 溶液漂洗，然后和偶联 HRP 标记的羊抗兔
IgG（1∶5 000，由 Bio-rad 公司提供）室温下作用
2 h。1×TBST 溶液漂洗，采用 ECL 化学发光法显
影，以 β-actin 作为内参，使用 NIH Image J 分析目
的条带，蛋白相对量表示为目的蛋白条带的平均吸
光度值与内参 β-actin 的平均吸光度值的比值。
1.8 统计学方法
数据以 ±x s 表示，采用统计学软件 Prism
GraphPad5.0 进行统计分析，通过双因素方差分析
或者配对 t 检验比较组间差异。
2 结果
2.1 TSPN 最佳剂量的确定
造模后 14 d 统计各组大鼠生存率及尼氏染色
检测各组大鼠脑组织海马 CA1 区锥体神经元密度。
造模后 14 d，假手术组以及 50、75 mg/kg TSPN 组
大鼠生存率均为 100%，高于模型组，见图 1。与假
手术组相比，模型组大鼠海马 CA1 区锥体神经元密
度显著下降，50、75 mg/kg TSPN 组大鼠锥体神经
元的密度均显著升高，其中 75 mg/kg TSPN 的作用
较其他剂量 TSPN 最为显著（P＜0.05），见图 2。
海马 CA1 区尼氏染色典型图片见图 3。综合以上实
验结果，在后续实验中选择 TSPN 剂量为 75 mg/kg，
继续观察其他各项指标变化。
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图 1 各组大鼠生存率 (n = 10)
Fig. 1 Survival rate of rats in each group (n = 10)


与模型组比较：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001；与 TSPN (75
mg·kg−1) 组比较：ΔP＜0.05，下同
*P < 0.05 **P < 0.01 ***P < 0.001 vs model group; ΔP < 0.05 vs
TSPN (75 mg·kg−1) group, same as below
图2 TSPN对全脑缺血大鼠海马CA1区锥体神经元密度的
影响 ( x ±s, n = 5)
Fig. 2 Effect of TSPN on neurons density in hippocampal CA1
of rats with global cerebral ischemia injury ( x ±s, n = 5)





图 3 全脑缺血再灌注 14 d 大鼠海马 CA1 区尼氏染色
Fig. 3 Nissl staining of hippocampal CA1 subfield from 30
min post-ischemia of rats followed 14 days’ reperfusion
2.2 造模大鼠神经功能评分
在全脑缺血 30 min 再灌注第 1、3、7、14 天分
别对假手术组、模型组和 TSPN 75 mg/kg 组大鼠进
行神经功能评分，结果见图 4。假手术组各时间点大
鼠神经功能评分为 0 分；再灌注第 7、14 天，TSPN
组神经功能评分显著低于模型组（P＜0.001），TSPN
组大鼠四肢肌肉的收缩力明显提高、眼睛的闭合恢
复正常、无转圈现象以及毛发恢复正常的光泽。



图 4 TSPN 对大鼠神经功能评分的影响 ( x ±s, n = 9)
Fig. 4 Effect of TSPN on neurological scores in rats ( x ±s, n = 9)
2.3 TSPN对大鼠海马CA1区Caspase-3表达的影响
免疫组化结果表明，与假手术组相比，模型组
大鼠海马 CA1 区 Caspase-3 阳性的细胞密度显著增
加，给予 TSPN 治疗后，Caspase-3 阳性的细胞密度
显著下降（P＜0.05）；再灌注第 7、14 天，TSPN
组与模型组比较，Caspase-3 阳性的细胞密度差异显
著（P＜0.001）。见图 5。
Western blotting 法检测结果表明，与假手术组
相比，模型组和 TSPN 组 Caspase-3（32 000）蛋白
水平显著上升（P＜0.001），全脑缺血后激活的 2
个亚基（20 000、17 000）的统计结果显示：在再
灌注第 3、7、14 天，与模型组比较，TSPN 组 20 000
的亚基蛋白水平显著降低（P＜0.001）；在再灌注第
7、14 天，与模型组比较，TSPN 组 17 000 的亚基
蛋白水平显著降低（P＜0.001）。见图 6。
2.4 TSPN对大鼠海马CA1区Bcl-2蛋白表达的影响
免疫组化结果表明，与假手术组比较，模型组
大鼠海马 CA1 区 Bcl-2 阳性的细胞密度均显著上升
（P＜0.05），再灌注第 7、14 天，TSPN 组与模型组
比较，Bcl-2 阳性的细胞密度显著升高（P＜0.001）。
见图 7。
Western blotting 法检测结果表明，与假手术组
比较，模型组大鼠海马 CA1 区 Bcl-2 蛋白水平均显
著增加（P＜0.05）；再灌注第 3、7、14 天，TSPN
假手术
模型
TSPN 75 mg·kg−1
200 μm
200 μm
200 μm
50 μm
50 μm
50 μm
100
80
60
40
20
0
生
存
率
/%

假手术 模型 25 50 75 100
TSPN/(mg·kg−1)
神
经
元
密
度
/m
m
−1

400
300
200
100
0

假手术 模型 25 50 75 100
TSPN/(mg·kg−1)
***
***
**△

**△

模型
TSPN
20
15
10
5
0

神
经
功
能
评
分

第1天 第3天 第7天 第14天
***
***
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图 5 各组大鼠海马 CA1 区 Caspase-3 免疫组化染色结果 ( x ±s, n = 5)
Fig. 5 Immunohistochemical staining results of Caspase-3 in hippocampal CA1 of rats in each group ( x ±s, n = 5)






图 6 TSPN 对全脑缺血大鼠海马 CA1 区 Caspase-3 蛋白表达的影响 (Western blotting, x ±s, n = 4 )
Fig. 6 Effect of TSPN on Caspase-3 protein expression in hippocampus CA1 of rats with global cerebral ischemia
(Western blotting, x ±s, n = 4 )
组大鼠海马 CA1 区 Bcl-2 蛋白水平均显著高于模型
组（P＜0.001）。见图 8。
2.5 TSPN 对大鼠海马 CA1 区 Bax 蛋白表达的
影响
免疫组化结果表明，海马 CA1 区 Bax 阳性细胞
主要表达在细胞的胞浆，并且发现细胞发出一些突
起和微丝。与假手术组相比，模型组大鼠海马 CA1
区的 Bax 阳性细胞密度显著上升（P＜0.05），而给
予 TSPN 干预后，Bax 阳性细胞密度较模型组显著下
降；再灌注第 7、14 天，TSPN 组与模型组比较，
Bax 阳性细胞密度显著下降（P＜0.001）。见图 9。
Western blotting 法检测结果表明，与假手术组
比较，模型组大鼠海马 CA1 区 Bax 蛋白水平显著
增加（P＜0.05）；再灌注第 3、7、14 天，TSPN 组
大鼠海马 CA1 区 Bax 蛋白水平均显著低于模型组
（P＜0.001）。见图 8。
2.6 TSPN 对 Bcl-2 和 Bax 阳性细胞密度及蛋白水
平比值的影响
TSPN 组 Bcl-2/Bax 值（阳性细胞）在第 7、14
d 均显著高于模型组（P＜0.001）；Bcl-2/Bax 值（蛋
白水平）在第 3、7、14 天高于模型组（P＜0.001）。
见图 10。
海马 CA1 区示意图 假手术
模型

TSPN 75 mg·kg−1
100 μm 50 μm
50 μm 50 μm Ca
sp
as
e-
3
阳
性
细
胞
密
度
/m
m
−1
200
150
100
50
0

第1天 第3天 第7天 第14天
模型
TSPN
假手术
*** ***
*
假手术 1 d 3 d 7 d 14 d 1 d 3 d 7 d 14 d
模型 TSPN
32 000

20 000
17 000
β-actin
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0

C
as
pa
se
-3
(3
2
00
0)
/β-
ac
tin

***
0.30
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00

第 1 天 第 3 天 第 7 天 第 14 天 第 1 天 第 3 天 第 7 天 第 14 天
模型
TSPN
模型
TSPN
***
***
***
***
***
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00

C
as
pa
se
-3
(2
0
00
0)
/β-
ac
tin

C
as
pa
se
-3
(1
7
00
0)
/β-
ac
tin

模型 TSPN 假手术
Caspase-3
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图 7 各组大鼠海马 CA1 区 Bcl-2 免疫组化染色结果 ( x ±s, n = 5)
Fig. 7 Immunohistochemical staining results of Bcl-2 in hippocampal CA1 of rats in each group ( x ±s, n = 5)





图 8 TSPN 对全脑缺血大鼠海马 CA1 区 Bcl-2 和 Bax 蛋白表达的影响 (Western blotting, x ±s, n = 5 )
Fig. 8 Effect of TSPN on Bcl-2 and Bax protein expression in hippocampus CA1 of rats with global cerebral ischemia
(Western blotting, x ±s, n = 5)



图 9 各组大鼠海马 CA1 区 Bax 免疫组化染色结果 ( x ±s, n = 5)
Fig. 9 Immunohistochemical staining results of Bax in hippocampal CA1 of rats in each group ( x ±s, n = 5)
海马 CA1 区示意图 假手术
模型

TSPN 75 mg·kg−1
200 μm
100 μm
海马 CA1 区示意图 假手术
模型 TSPN 75 mg·kg−1
模型
TSPN
假手术 *** ***
*
第 1 天 第 3 天 第 7 天 第 14 天
300
250
200
150
100
50
0

B
cl
-2
阳
性
细
胞
的
密
度
/m
m
−1

模型
TSPN
假手术
Bcl-2
Bax
β-actin
***
***
***
*
***
*
***
***
0.40
0.35
0.30
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00

B
cl
-2
/β-
ac
tin

B
ax
/β-
ac
tin

0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0

第 1 天 第 3 天 第 7 天 第 14 天 第 1 天 第 3 天 第 7 天 第 14 天
第 1 天 第 3 天 第 7 天 第 14 天
模型
TSPN
假手术
***
***
*
100
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40
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0

Ba
x
阳
性
细
胞
的
密
度
/m
m
−1

假手术 1 d 3 d 7 d 14 d 1 d 3 d 7 d 14 d
模型 TSPN
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 8 期 2016 年 4 月

·1343·


图 10 TSPN 对全脑缺血大鼠海马 CA1 区 Bcl-2/Bax 值的影响 ( x ±s, n = 5)
Fig. 10 Effect of TSPN on Bcl-2/Bax ratio in hippocampal CA1 region of rats following global cerebral ischemia ( x ±s, n = 5)
3 讨论
Caspase-3 是 Bcl-2 家族下游的凋亡执行者，
Caspase-3 激活后可通过线粒体（主要涉及到 Bcl-2
和 Bax）等途径介导细胞凋亡[11]。本实验免疫组织
化学染色结果表明全脑缺血后大鼠海马 CA1 区活
化的 Caspase-3 神经元增多，Western-blotting 结果
显示缺血后海马 Caspase-3 总蛋白激活，然后被分
解成 2 个亚单位（20 000 和 17 000），并且随着缺
血时间的延长这 2 个亚单位的蛋白水平明显增高。
而给予 TSPN 治疗后，活化的 Caspase-3 细胞减少，
其蛋白水平的表达也明显下降，实验结果与先前报
道一致[12]。这表明 TSPN 可通过抑制 Caspase-3 的
过度激活和表达而修复全脑缺血后受损的神经元
和保护脑细胞。
Bcl-2 和 Bax 蛋白是 Bcl-2 家族的重要成员，是
Caspase 通路的上游信号，二者在凋亡中起着重要作
用，Bcl-2 是一个生存因子，定位于线粒体外膜、内
质网膜和核周膜[13]，能阻碍细胞凋亡和坏死，Bcl-2
的过度表达在脑缺血中发挥神经保护作用[14]。本实
验结果显示全脑缺血后海马 CA1 区 Bcl-2 阳性细胞
密度明显下降，而给予 TSPN 治疗之后 Bcl-2 阳性
细胞密度明显增高；免疫印迹结果显示 TSPN 能显
著增加全脑缺血大鼠海马 Bcl-2 蛋白水平，这表明
TSPN 可通过增加 Bcl-2 的表达而发挥抗凋亡作用。
Bax 蛋白位于胞质，在凋亡信号诱导后很快迁移到
线粒体从而促进细胞凋亡[15]。实验结果显示全脑缺
血后 Bax 阳性细胞密度增高，Bax 蛋白水平表达增
加，表达趋势与文献报道一致[16]，而给予 TSPN 干
预后，无论是 Bax 阳性细胞密度还是其蛋白水平都
显著下降。这表明 TSPN 可以抑制 Bax 基因的表达，
其作用机制可能是通过Bcl-2的过表达而阻止Bcl-2
其他家族成员如Bax促凋亡蛋白的启动。一般来说，
神经元能否抵抗凋亡与通过上调 Bcl-2 蛋白表达和
下调 Bax、Caspase-3 蛋白表达有关[17-18]，确切地说
Bcl-2/Bax 值决定着细胞是否凋亡[19]。本实验结果
显示，全脑缺血后海马 CA1 区 Bcl-2 阳性细胞数目
与海马 CA1 区 Bax 阳性细胞数目的比值随着再灌
注时间的延长而降低，而给予 TSPN 治疗之后，
Bcl-2/Bax 值明显升高，在第 7、14 天显著高于模型
组，这表明 TSPN 可提高海马 CA1 区 Bcl-2/Bax 值
而发挥抗凋亡的作用。免疫印迹技术检测大鼠海马
Bcl-2/Bax 值的蛋白水平进一步验证了上述结果。实
验结果显示 TSPN 组在第 3、7、14 天 Bcl-2/Bax 值
的蛋白水平均显著高于模型组，说明 TSPN 可能通
过上调Bcl-2/Bax的比值而抑制Caspase-3的过度激
活，从而避免更多的神经元凋亡。其机制可能是
Bcl-2 的过度表达形成异源二聚体而发挥抗凋亡作
用，而 Bax 蛋白的减少，维护了神经元 Ca2+体内平
衡[20]；或者是通过抑制 JNK 信号的激活和线粒体
的凋亡途径 [21]。在实验过程中，发现 2 组大鼠
Bcl-2/Bax 值阳性细胞在第 7、14 天有统计学差异，
而 Bcl-2/Bax 蛋白水平的比值在第 3、7、14 天均有
统计学意义，结果不具有一致性，这可能是由于阳
性细胞的比值代表的是海马 CA1 区的某一个部位
的某一个层面，而 Bcl-2/Bax 蛋白水平则代表的是
整个海马部位的总蛋白量。
本研究从行为学角度观察了 TSPN 对全脑缺血
后大鼠的神经功能评分的影响，从形态学观察了
TSPN 对全脑缺血后大鼠的生存率，海马 CA1 区神
经元密度，Bcl-2、Bax 和 Caspase-3 阳性细胞密度
的影响，同时采用分子生物学技术探讨了 TSPN 对
全脑缺血后海马 Bcl-2、Bax 和 Caspase-3 蛋白表达
模型
TSPN
***
***
***
***
***
8
7
6
5
4
3
2
1
0

6
5
4
3
2
1
0

B
cl
-2
/B
ax
(细
胞
水
平
)
B
cl
-2
/B
ax
(蛋
白
水
平
)
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中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 8 期 2016 年 4 月

·1344·
的影响。结果显示 75 mg/kg 的 TSPN 的神经保护作
用最强，TSPN 可逐渐上升 Bcl-2 阳性细胞密度，抑
制 Bax 和活化的 Caspase-3 阳性细胞的表达。免疫
印迹技术结果进一步佐证了免疫组化的结果，同时
通过对 Bcl-2 和 Bax 细胞数目以及二者蛋白水平之
间的比值阐述了 TSPN 组 Bcl-2/Bax 值的上调作用。
实验结果表明全脑缺血后 TSPN 可通过上调
Bcl-2/Bax 值而调控神经元凋亡的下游 Caspase 家
族，从而发挥神经保护作用。但 TSPN 神经保护作
用的确切机制需要进一步深入研究。
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