全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 23 期 2013 年 12 月

·3289·
• 药剂与工艺 •
有机相脂肪酶催化合成脂质体修饰物胆固醇癸二酸单烯酯
聂 华，郑品劲，罗利华，程 怡*
广州中医药大学中药学院，广东 广州 510006
摘 要：目的 在非水相中利用酶法合成胆固醇癸二酸单烯酯，并对其最优合成工艺条件进行研究。方法 利用 TLC、MS
和 NMR 法对合成产物进行结构鉴定；通过正交试验对合成处方工艺进行优化。结果 最佳反应条件为胆固醇与癸二酸二乙
烯酯物质的量之比为 1∶6，Candida rugosa Lipase 10 mg/mL，异辛烷 5 mL，温度 35 ℃，反应时间 24 h。结论 该条件下
酯化率可达 95%以上。
关键词：胆固醇；去唾液酸糖蛋白受体；酶催化；Candida rugosa Lipase；胆固醇癸二酸单烯酯
中图分类号：R283.6 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2013)23 - 3289 - 07
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2013.23.007
Lipase-catalyzed synthesis of cholesteryl vinyl hemi-sebacate for selective
targeting of liposomes in organic media
NIE Hua, ZHENG Pin-jin, LUO Li-hua, CHENG Yi
College of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China
Abstract: Objective To synthesize cholesteryl vinyl hemi-sebacate from cholesterol and divinyl sebacate in non aqueous phase.
Methods TLC, MS, and NMR were used to identify the structure of production; the technological conditions of enzymatic
esterification were determined through orthogonal test. Results The best condition: isooctane 5 mL, reaction temperature 35 ℃,
reaction time 24 h, Candida rugosa Lipase 10 mg/mL, molar ratio of cholesterol to divinyl sebacate 1∶6. Conclusion The highest
esterification rate is above 95%.
Key words: cholesterol; asialoglycoprotein receptor; lipase-catalyzed; Candida rugosa Lipase; cholesteryl vinyl hemi-sebacate

去 唾 液 酸 糖 蛋 白 受 体 （ asialoglycoprotein
receptor，ASGPR）是肝细胞膜上表达丰富的一种内
吞性受体，存在于肝脏实质细胞朝向窦状隙一侧的
细胞膜上[1]。ASGPR 是一种高效的内吞受体，对末
端含有半乳糖残基或 N-乙酰半乳糖胺基的化合物，
可特异性识别，通过细胞内吞作用，转运至细胞内[2]。
已有研究者将半乳糖与药物偶联，或者将半乳糖与
药物载体偶联，通过 ASGPR 内吞作用，将药物转
运到肝细胞内，达到治疗肝病的目的。相对于传统
药物，带有半乳糖配体的药物，肝靶向性更好，利
用效率更高，全身副作用更小。
脂质体是良好的药物载体[3]，如果将脂质体连
接半乳糖配基，能极大提高脂质体在肝脏的聚集，
同时减少在血液中的滞留时间，以及在其他脏器的
分布。将半乳糖与脂质体偶联的方法已有诸多报道：
Guo 等[4]将半乳糖与长链碳烃偶联，使之具有双亲
性，然后亲油端与脂质体表层镶嵌，半乳糖基伸向
外部，使脂质体具有靶向性，通过对小鼠的体内代
谢研究，相对摄取率比普通脂质体提高了 1.5 倍。另
有研究者通过化学合成的方法将胆固醇与半乳糖偶
联，得到 1 个胆甾半乳糖苷衍生物，然后与卵磷脂
一起制备脂质体。这种胆甾半乳糖苷衍生物可以取
代胆固醇，并且发挥与胆固醇相同的稳膜作用，而
且与脂质体的接合率大大提高。通过肝细胞摄取实

收稿日期：2013-07-24
基金项目：国家自然科学基金资助项目（30772790）
作者简介：聂 华（1979—），男，湖北人，博士研究生，研究方向为药物载体及其新型给药系统。Tel: 13422158212 E-mail: niehua007@163.com
*通信作者 程 怡，教授，博士生导师。E-mail: vip.chengyi@gzhtcm.edu.cn
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 23 期 2013 年 12 月

·3290·
验，带有这种胆甾半乳糖配体的脂质体与普通脂质
体相比，相对摄取率提高 200 倍[5]。
一般认为 ASGPR 对半乳糖配体脂质体的识别
能力受 3 方面影响：一是半乳糖基在脂质体表面的
分布密度[6]；二是半乳糖基与脂质体的空间距离[7]；
三是半乳糖基与脂质体结合的稳定性。根据以上 3
个特点，本实验设计合成一种新的胆固醇-癸二酸-
半乳糖苷（CHS-SE-LA）配体分子，其结构由“靶
头”、“桥”、“锚”3 部分构成。乳糖醇（lactitol，
LA）是一种常见的双糖，一端含有半乳糖基，可以
作为 ASGPR 受体的“靶头”，另一端是开链的多元
醇结构，可以提供连接“桥”的活性醇羟基。胆固醇
（cholesterol，CHS）被认为是脂质体的膜稳定剂[8]，
因为其立体空间构象可以使胆固醇与磷脂亲油端相
互紧密嵌合而发挥稳膜作用，这种立体的嵌合结构
可以使 CHS 作为“锚”牢固镶嵌于脂质体膜表层。
本实验选取癸二酸二乙烯酯（divinyl sebacate，DS）
作为中间连接“桥”，其碳链长度可以满足半乳糖基
与脂质体的空间距离；两端的乙烯酯是一种具有活
性的酰基供体[9]，与醇羟基发生酯交换反应时，副
产物乙烯醇会互变异构成乙醛，使反应易于向生成
产物的方向进行。
生物酶如脂肪酶、蛋白酶等，是一种高效的生
物催化剂，特别在糖酯的选择性合成方面极具优
势[10-11]。酶催化具有高效、高选择性，而且绿色环
保，被称之为绿色化学。本实验利用脂肪酶催化合
成了胆固醇-半乳糖苷配体分子前半部分——胆固
醇癸二酸单烯酯（CHS-SE），探讨了酶促合成的最
优条件，为进一步合成配体分子（CHS-SE-LA）奠
定实验基础。
1 仪器与材料
Thermo TSQ Quantum ACESS 三重四极杆液质
联用仪（赛默飞世尔科技有限公司）；Bruker 400M
核磁共振波谱仪（瑞士布鲁克公司）；Nieolet 5DX
傅里叶变换红外光谱仪（美国 Nieozet 公司）；高效
液相色谱仪（P680 型四元泵，PDA—100 型检测器，
ASI—100 自动进样器，美国戴安公司）；BS110s 型
电子分析天平（德国 Sartorius 公司）；DKZ—1 电热
恒温空气浴振荡槽（上海精宏实验设备有限公司）。
DS（实验室自制，质量分数＞95%）；CHS
（Sigma-Aldrich公司）；Novozym 435固定化脂肪酶、
Lipozyme TLIM 脂肪酶（均购自诺维信生物技术有
限公司）；Candida rugosa Lipase RCL 酶（Sigma 公
司），Penicillium expansum PEL 酶（深圳绿微康生
物工程有限公司），分子筛 4Å 型（天津市福晨化学
试剂厂）。
甲醇为色谱纯，水为重蒸水，丙酮、正已烷、
异辛烷等试剂均为分析纯（已脱水处理）。
2 方法与结果
2.1 CHS-SE 酶催化反应
取 10 mL 带塞锥形瓶，加入 DS、CHS 和溶剂
适量，置于恒温振荡器振摇 30 min，加入酶适量启
动反应，反应结束后，滤过除去酶，回收溶剂，即
得产物。
2.2 产物纯化处理
葡聚糖凝胶 LH-20 装填色谱柱，将酶促反应后
的溶液用洗脱液溶解上样，利用氯仿-甲醇（1∶1）
洗脱，洗脱液以 TLC 分析，收集合并产物部分，挥
干，得白色固体产物。
2.3 酯化率的测定
2.3.1 液相色谱条件 Diamonsil C18 色谱柱（250
mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-正已烷（9∶
1），等度洗脱；进样量 10 μL；柱温 35 ℃；体积流
量 1.0 mL/min。
2.3.2 CHS 标准曲线制备 精密称取 CHS，甲醇溶
解，分别制得质量浓度分别为 0.5、1、3、5、7、9、
10、15 mg/mL 的溶液，进液相分析。以 CHS 峰面
积为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X），得回归
方程为 Y＝29.044 X＋14.658，r2＝0.994 8，结果表明
CHS 在 0.5～15 mg/mL 与峰面积呈良好线性关系。
2.3.3 酯化率的计算 根据底物的减少量与反应前
底物量的比值来计算酯化率。酯化率＝(ρ0－ρt) / ρ0，
其中 ρ0、ρt 分别表示反应前后 CHS 的质量浓度
（mg/mL）[12]。
2.4 酶活力测定
脂肪酶酯化活性的测定参照Petkar等[13]的方法
并稍作改进。在 50 mL 带塞三角瓶中加入 3 mL 水
饱和的异辛烷、1 mmol 月桂酸、2 mmol 十八醇混
合均匀，置于恒温振荡器内（37 ℃，250 r/min），
预热 20 min，加入一定量的酶振荡，计时 20 min 后，
加入 10 mL 乙醇淬灭反应，立即用 0.05 mol/L NaOH
醇溶液进行滴定，以酚酞试剂作指示剂。1 U 定义
为在 37 ℃下，1 min 内合成 1 μmol 月桂酸十八酯
所需要的酶量。Novozym 435、Lipozyme TLIM、
P. expansum PEL、C. rugosa RCL酶活性分别为 798、
330、69、628 U/g。
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 23 期 2013 年 12 月

·3291·
2.5 癸二酸二乙烯酯的制备
癸二酸二乙烯酯的制备参照王利娟等[14]的方
法并稍作改进。取 72.8 g（0.36 mol）癸二酸、150 mL
醋酸乙烯酯（1.62 mol）、2.1 g 醋酸汞及微量醋酸铜，
加入 250 mL 三口颈烧瓶中。将盛有上述物质的三
口颈烧瓶在 50 ℃的恒温水浴中加热并搅拌，几分
钟后滴加 0.25 mL 浓硫酸，反应 8 h。反应完毕后，
加入约 2 g 醋酸钠充分振荡以中和硫酸。水泵减压
蒸馏除去过量醋酸乙烯酯后，将剩余蓝色溶液上柱
分离。以硅胶为固定相，流动相为石油醚-醋酸乙酯
（9∶1），分离得到纯品。结构经 MS、NMR 鉴定，
质量分数＞95%。MS: [M＋Na]＋ 277；1H-NMR (500
MHz, CDCl3) δ: 7.32～7.25 (m, 2H), 4.87 (dd, J =
14.0, 1.2 Hz, 2H), 4.56 (dd, J = 6.3, 1.2 Hz, 2H), 2.37
(t, J = 7.5 Hz, 4H), 1.81～1.47 (m, 4H), 1.33 (d, J =
15.9 Hz, 8H)；13C-NMR (126 MHz, CDCl3) δ: 171.21,
141.58, 97.85, 34.29, 29.37, 29.32, 24.93。
2.6 单因素试验考察酶促反应条件
2.6.1 酶和反应溶剂的影响 根据文献报道[15-19]，
本研究考察了 4 种常见脂肪酶（表 1），这些脂肪酶
已商品化，廉价易得，均有相关文献报道用于胆固
醇酯的合成。反应条件：酶 30 U，底物 CHS 与 DS
物质的量之比为 1∶2，溶剂 5 mL，反应温度 45 ℃，
搅拌转速 250 r/min，反应时间 3 h。一般来说，溶
剂的疏水性对酶促反应至关重要，因为极性溶剂容
易夺去酶表面的必需水，造成酶失活；而在非极性
溶剂中，酶能保持较高的稳定性，不易失活。溶剂
的疏水性能通常用 logP 值表示，logP 值越大，疏
水性越强，但是并非选择溶剂极性越小越好，还要
考虑反应底物在溶剂中的溶解度。实验中，以 logP
值来表示所用溶剂极性大小，分别考察了 3 种不同
极性的溶剂，结果见表 1。

表 1 酶的种类和溶剂极性对酯化反应的影响
Table 1 Effect of lipase types and organic solvents on esterification
酯化率 / % 溶剂 logP
Novozym 435 Lipozyme TLIM P. expansum PEL C. rugosa RCL
正已烷 3.5 1.24 8.82 4.53 69.34
丙酮 −0.23 1.05 4.46 1.76 6.11
异辛烷 4.7 1.38 8.90 3.98 77.01

实验结果显示，不同的酶酯化率差异很大，而
且溶剂的极性对酯化率影响也很显著。众所周知，
酶的各种催化特性取决于酶的结构，特别是活性中
心的结构。X 射线衍射研究结果表明，Novozym 435
活性中心呈窄长的烟囱状[20]，其活性中心的有效底
物键合空间非常有限，因此对短链的脂肪酸酯催化
活性较高，当碳链长大于 4 时，催化活性急剧下降，
DS 碳链长为 10，由于空间位阻，不易进入 Novozym
435 活性中心，因此反应 3 h，仅检测到微量产物。
Lipozyme TLIM 活性中心位于蛋白质表面的疏水性
裂缝中，包括 1 个疏水性的酰基键合区域和 1 个亲
水性的醇基键合区域[21]，相对于 Novozym 435，其
活性中心区域比较宽广，对于催化长链的酰基供体
比较有利，因此酯化率高于 Novozym 435；但是醇
羟基位于胆固醇核的碳环上，胆固醇核的立体空间
结构带来较大位阻，使底物不易进入醇基键合区，
导致 Lipozyme TLIM 催化酯化率仍然偏低。P.
expansum PEL 为碱性脂肪酶，最适宜 pH 值为 9.3，
本反应体系为中性略偏酸性，使其反应活性较低；
而且 P. expansum PEL 为酶粉，稳定性差，较易失
活，因此 3 h 最高酯化率仅有 4%。C. rugosa RCL
在反应中表现出最高的催化活性，在异辛烷中 3 h
达到 77%的转化率。X 射线衍射研究表明，C. rugosa
RCL 活性中心非常宽广，可以容纳体积较大的底物
分子，而且活性中心结构能与 CHS 分子较精确嵌
合[22]，因此对胆固醇酯有特别高的催化活性；但在
丙酮等中等极性的溶剂中却表现出很低的催化活
性，这可能与丙酮容易夺去酶表面必需水，导致酶
失活有关；C. rugosa RCL 的活性中心被 α-螺旋型盖
子所覆盖，盖子面向活性位点的一面是疏水的，而
背向一面是亲水的[23]，当在异辛烷这类疏水性介质
中时，盖子打开，暴露出活性中心，发挥催化作用；
而在丙酮这类亲水性溶剂中，盖子是闭合的，底物
不易进入活性中心而不能发挥催化作用。因此，最
适合的反应溶剂与酶是异辛烷与 C. rugosa RCL。
2.6.2 酶量及反应时间的影响 为了考察酶的用量
对酯化率的影响，选取酶的用量为 2～10 mg/mL，
考察酯化率变化情况。反应条件：C. rugosa RCL 酶，
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 23 期 2013 年 12 月

·3292·
底物 CHS-DS 物质的量之比 1∶2，异辛烷 5 mL，
反应时间 36 h，搅拌转速 250 r/min，反应温度
45 ℃。结果见图 1。很明显，在没有加酶的情况下，
几乎没有酯化产物生成。随着酶量的增加，酯化反
应速率和酯化率都在不断增加。当酶量增加到 4
mg/mL 时候，酯化率已达到 90%以上，当增加到 6
mg/mL 以后，酯化率没有明显提升，继续增加酶用
量，酯化率趋于平缓，不再增加。虽然更高酶量 10
mg/mL 能稍微提高酯化率，4 mg/mL 已经达到 93%
以上酯化率，与 10 mg/mL 酯化率（95%）相比，
没有显著性差异。因此从经济实用来说 4 mg/mL 的
酶量是最佳选择。从时间-酯化率曲线图上看，前
1.5 h，酯化率随时间呈线性增长关系，其斜率为反
应初速度，酶浓度越大，初速度越大；到 6 h 左右，
酯化率趋于平缓，到 24 h 后，酯化率基本不再增加，
达到平衡。进一步增加反应时间，观测到少量二元
酯化产物生成，因此，24 h 为最佳反应时间。




图 1 酶量及反应时间对酯化反应的影响
Fig. 1 Effect of lipase types and reaction time
on esterification

2.6.3 酰基供体的影响 本实验考察了癸二酸和
DS 作为酰基供体时对酯化率的影响。反应条件：4
mg/mL C. rugosa RCL，底物 CHS-DS 物质的量之比
为 1∶2，异辛烷 5 mL，反应时间 36 h，搅拌转速
250 r/min，反应温度 45 ℃。结果见图 2。很明显，
DS 的酯化率和反应速率远远高于癸二酸。因为癸
二酸的酯化副产物是水，当反应体系中水达到一定
量，反应达到平衡，酯化率不再增加。曾考虑加入
分子筛以除去反应生成的水，但是酯化率急剧下降，
推测可能是分子筛夺去酶 C. rugosa RCL 表层必需
水而导致酶迅速失活；反应中监测到大量二元酯化
产物生成，可能因为癸二酸为二元酸，在异辛烷中
溶解性较差，癸二酸与胆固醇单酯化产物因为易溶
于异辛烷而进一步酯化生成二元酯副产物，导致目



图 2 酰基供体对酯化反应的影响
Fig. 2 Effect of acyldonors on esterification

标产物得率下降。DS 在常温下为液体，在异辛烷
中有良好的溶解度，并且其副产物乙烯醇会迅速转
变成乙醛而挥发掉，导致反应不可逆转，有利于反
应向生成产物的方向移动。因此 DS 是合适的酰基
供体。
2.6.4 温度的影响 酶促反应同其他化学反应一样，
受温度影响较大，在一定温度范围内，温度升高，
底物分子的能量增加，单位时间内有效碰撞次数相
应增加，因而酶促反应速度加快；但酶蛋白属于生
物大分子，当温度超出一定范围后，随着温度的升
高，部分酶蛋白开始失活变性，酶促反应速度下降。
文献报道 C. rugosa RCL 在温度 55 ℃以内具有活
性[24]，因此本实验考察了反应温度分别为 30、35、
40、45、50 ℃对酯化率的影响。反应条件：4 mg/mL
C. rugosa RCL 酶，底物 CHS-DS 物质的量之比为
1∶2，异辛烷 5 mL，反应时间 36 h，搅拌转速 250
r/min。结果酯化率分别为 48.13%、59.40%、66.75%、
74.93%、52.40%。很显然，酶 C. rugosa RCL 的最
佳反应温度为 45 ℃。
2.6.5 底物物质的量之比的影响 酶催化胆固醇酯
化反应属于双底物反应，DS 作为酰基供体，其浓
度必然对反应有一定的影响。同时，在此反应中还
存在 2 个副反应，酶促酰基供体水解反应和单酯的
进一步酯化反应。因此 DS 过量是必须的。为研究
底物物质的量之比对酯化率的影响，将胆固醇物质
的量固定为 26 mmol，加入 CHS 物质的量的 1、2、
3、4 倍量的酰基供体，反应条件：4 mg/mL C. rugosa
RCL 酶，异辛烷 5 mL，反应时间 36 h，搅拌速度
250 r/min，反应结果酯化率分别为 79.01%、93.14%、
94.23%、94.85%。物质的量之比为 1∶1 时，酯化
酯
化
率
/
%

100

80

60

40

20

0
0 mg·mL−1
2 mg·mL−1
4 mg·mL−1
6 mg·mL−1
8 mg·mL−1
10 mg·mL−1
0 10 20 30
t / h
100
80
60
40
20
0
酯
化
率
/
%

0 10 20 30 40
t / h
癸二酸
DS
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 23 期 2013 年 12 月

·3293·
率只有 80%左右，这可能与部分酰基供体被水解有
关，当增加到 1∶2 时，酯化率急剧增加到 93%，
继续增加比例，酯化率变化趋于平缓。物质的量之
比为 1∶3 和 1∶4 时酯化率基本稳定在 95%左右，
达到最大值。
2.7 正交试验设计
2.7.1 试验设计 前期实验中以 CHS 的酯化率为
指标，对酶促反应条件进行了单因素考察，发现时
间、酶量和底物 CHS-DS 物质的量之比 3 个因素对
酯化率影响较大，而温度的影响不显著。因此固定
反应温度为 35 ℃，以酶量（A）、反应时间（B）和
底物 CHS-DS 物质的量之比（C）为主因素，以 CHS-
SE 的产率为评价指标，对酶促反应条件进行优化，
因素与水平安排见表 2，所有实验均重复 3 次。

表 2 正交试验设计及结果
Table 2 Design and results of orthogonal test
试验号
A /
(mg·mL−1)
B / h C
D
(空白)
CHS-SE
产率 / %
1 6 (2) 14 (2) 1∶3 (1) 2 (2) 38.04
2 2 (1) 14 (2) 1∶9 (3) 3 (3) 85.11
3 2 (1) 4 (1) 1∶3 (1) 1 (1) 33.89
4 10 (3) 24 (3) 1∶3 (1) 3 (3) 49.94
5 6 (2) 24 (3) 1∶9 (3) 1 (1) 92.08
6 10 (3) 14 (2) 1∶6 (2) 1 (1) 95.21
7 10 (3) 4 (1) 1∶9 (3) 2 (2) 88.39
8 2 (1) 24 (3) 1∶6 (2) 2 (2) 89.43
9 6 (2) 4 (1) 1∶6 (2) 3 (3) 84.22
K1 208.43 206.50 121.87 221.18
K2 214.34 218.36 268.86 215.86
K3 233.54 231.45 265.58 219.27
R 25.11 24.95 146.99 5.32

2.7.2 CHS-SE 产率的测定 产率测定方法：吸取
100 μL 反应体系上清液，用 400 μL 乙醇稀释后，
通过 0.45 μm 滤膜后注入液相色谱测定。液相色谱
条件同“2.3.1”项。
产率计算方法：精确称量不同质量的 CHS-SE
纯品，通过液相色谱分析，得到 CHS-SE 质量与液
相色谱峰面积的标准曲线和归一化方程，采用归一
化方程计算 CHS-SE 的生成量，换算为 CHS 的消耗
量，以 CHS 消耗量与 CHS 初始量的比值来表示
CHS-SE 产率[25]。
2.7.3 正交试验结果分析 试验结果利用 SPSS 软
件进行方差分析，结果见表 3。3 个因素对酶促反应
结果均有显著性影响，作用显著性的顺序依次为底
物物质的量之比＞酶量＞反应时间。最优反应条件
是酶量为 10 mg/mL，底物 CHS-DS 物质的量之比
为 1∶6，反应时间为 24 h。根据正交优化结果，对
最优条件进行实验验证，3 批 CHS-SE 产率分别为
95.4%、96.8%、96.1%。

表 3 方差分析
Table 3 Analysis of variance
误差来源 III 型平方和 自由度 F 值 显著性
校正模型 4 915.330 6 338.377 P＜0.01
截距 47 860.313 1 19 768.548 P＜0.01
酶量 114.898 2 23.729 P＜0.05
反应时间 103.834 2 21.444 P＜0.05
底物物质的
量之比
4 696.598 2 969.957 P＜0.01
空白列 4.842 2
总计 52 780.485 9
校正的总计 4 920.172 8
R2＝0.999（调整 R2＝0.996）
F0.05(2, 2)＝19.00 F0.01(2, 2)＝99.00

2.8 产物结构表征
取反应液 100 μL，用乙醇稀释 5 倍，供 TLC
分析。展开剂为环已烷-醋酸乙酯（95∶5），显色剂
为 5%硫酸乙醇，喷板后置于 110 ℃烘箱 5 min 显
色。CHS、DS 和 CHS-SE Rf 值分别为 0.2～0.4、0.6～
0.7、0.7～0.8。
MS：ESI（＋）源模式；喷雾电压 3 kV；毛细
管温度为 350 ℃。MS 谱图显示 [M＋Na] 峰：
619.5，揭示产物相对分子质量为 596.5，与目标物
相对分子质量 596.2 相吻合。
13C-NMR (126 MHz, CDCl3) δ: 173.57 (C-28),
171.15 (C-37), 141.50 (C-38), 140.02 (C-6), 122.90
(C-9), 97.76 (C-39), 74.01 (C-2), 56.99 (C-14), 56.43
(C-15), 50.32 (C-7), 42.61 (C-13), 40.03 (C-12), 39.82
(C-22), 38.46 (C-4), 37.30 (C-3), 36.90 (C-5), 36.48
(C-20), 36.09 (C-18), 34.97 (C-29), 34.22 (C-36),
32.21 (C-10), 32.16 (C-8), 29.34 (C-31), 29.32 (C-32,
C-33), 29.26 (C-34), 28.53 (C-16), 28.32 (C-23),
28.12 (C-1), 25.30 (C-30), 24.85 (C-35), 24.58 (C-17),
24.13 (C-21), 23.12 (C-25), 22.86 (C-24), 21.33
(C-11), 19.63 (C-27), 19.01 (C-19), 12.16 (C-26)。
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 23 期 2013 年 12 月

·3294·
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ: 7.28 (m, 1H),
5.37 (d, J = 4.5 Hz, 1H), 4.87 (dd, J = 14.0, 1.5 Hz,
1H), 4.65～4.53 (m, 2H), 2.38 (t, J = 7.5 Hz, 2H),
2.35～2.22 (m, 4H), 2.06～1.93 (m, 2H), 1.93～1.81
(m, 3H), 1.81～1.58 (m, 5H), 1.58～1.22 (m, 20H),
1.22～0.83 (m, 22H)。δ 173.57 与 171.15 为 DS 羰基
碳（C＝O）特征峰，δ 141.50 与 97.76 归属为乙烯
酯双键碳对应峰，说明 DS 只有一端与 CHS 发生的
酯交换反应；δ 140.02 与 122.90 分别为 CHS 环内
C＝C 所对应的峰，δ 71.81（来源 AIST）原为 CHS
OH-C 峰位移值，酯化后，位移值偏移至 δ 74.01。
1H-NMR 中 δ 7.28 为末端乙烯酯双键碳上的氢，δ
5.37 归属为产物 CHS 部分环内双键碳上氢，与 CHS
双键碳上氢 δ 5.349（来源 AIST）相吻合。δ 4.65
为产物羟基碳上氢，较 CHS 羟基碳上氢 δ 3.524（来
源 AIST）向低场偏移约 1 个 10−6，符合酯化反应位
移特征。综上所述，确定合成产物为目标产物。
3 讨论
通过对酶促反应条件的研究，得出最优条件为
C. rugosa RCL 10 mg/mL，异辛烷 5 mL，CHS-DS
物质的量之比为 1∶6，搅拌速度 250 r/min，35 ℃
下反应 24 h，最高酯化率为 96.8%。本实验利用酶
催化合成了 CHS-SE，收率高，质量分数可达 95%
以上，几乎无副反应，纯化简单，而且反应条件温
和，绿色环保。
CHS 作为脂质体的组成部分之一，因其具有
“锚”的作用而能固定于脂质体表层[4,26-27]，经常用
于与各种配基偶联。本实验室合成的 CHS-SE，因
其末端仍保留有活性的烯醇酯结构，能方便与其他
带有亲核基团的底物偶联，为制备带不同配基的脂
质体提供了有益的思路。在后续实验中，将以 CHS-
SE 和 LA 为反应底物，进一步探讨非水相中利用酶
法催化合成 CHS-SE-LA 分子的反应条件。
参考文献
[1] Fallon R J, Schwartz A L. Receptor-mediated delivery of
drugs to hepatocytes [J]. Adv Drug Deliv Rev, 1989, 4(1):
49-63.
[2] Wu J, Nantz M H, Zern M A. Targeting hepatocytes for
drug and gene delivery: Emerging novel approaches and
applications [J]. Front Biosci, 2002, 7: 717-725.
[3] 程 怡, 吴 琼, 余秋强, 等. Box-Behnken 效应面法
优化多西他赛长循环脂质体处方 [J]. 中草药, 2012,
43(10): 1946-1950.
[4] Guo B H, Cheng Y, Lin L P, et al. Preparation and
characterization of galactose-modified liposomes by a
nonaqueous enzymatic reaction [J]. J Liposome Res,
2011, 21(3): 255-260.
[5] Sliedregt L A J M, Rensen P C N, Rump E T, et al. Design
and synthesis of novel amphiphilic dendritic galactosides
for selective targeting of liposomes to the hepatic
asialoglycoprotein receptor [J]. J Med Chem, 1999, 42(4):
609-618.
[6] Nishikawa M, Miyazaki C, Yamashita F, et al.
Galactosylated proteins are recognized by the liver
according to the surface density of galactose moieties [J].
Am J Physiol, 1995, 268(5 Pt 1): G849-G856.
[7] Biessen E A L, Beuting D M, Roelen H C P F, et al.
Synthesis of cluster galactosides with high affinity for the
hepatic asialoglycoprotein receptor [J]. J Med Chem,
1995, 38(9): 1538-1546.
[8] Grit M, Crommelin D J. Chemical stability of liposomes:
Implications for their physical stability [J]. Chem Phys
Lipids, 1993, 64(1/3): 3-18.
[9] Kita Y, Takebe Y, Murata K, et al. Convenient enzymatic
resolution of alcohols using highly reactive, nonharmful
acyl donors, 1-ethoxyvinyl esters [J]. J Org Chem, 2000,
65(1): 83-88.
[10] Gross R A, Kumar A, Kalra B. Polymer synthesis by in
vitro enzyme catalysis [J]. Chem Rev, 2001, 101(7):
2097-2124.
[11] Kobayashi S, Uyama H, Kimura S. Enzymatic
polymerization [J]. Chem Rev, 2001, 101(12): 3793-3818.
[12] 毛 勇, 徐 达, 杨 博, 等. 有机相脂肪酶催化合
成棕榈酸植物甾醇酯 [J]. 中国油脂 , 2011, 36(12):
25-27.
[13] Petkar M, Lali A, Caimi P, et al. Immobilization of lipases
for non-aqueous synthesis [J]. J Mol Catal B: Enzymatic,
2006, 39(1/4): 83-90.
[14] 王利娟, 刘 准, 郭登峰, 等. 乙烯基交换合成壬酸乙
烯酯工艺研究 [J]. 热固性树脂, 2012, 27(4): 29-32.
[15] Villeneuve P, Turon F, Caro Y, et al. Lipase-catalyzed
synthesis of canola phytosterols oleate esters as
cholesterol lowering agents [J]. Enzyme Microbial
Technol, 2005, 37(1): 150-155.
[16] Kim B H, Akoh C C. Modeling and optimization of
lipase-catalyzed synthesis of phytosteryl esters of oleic
acid by response surface methodology [J]. Food Chem,
2007, 102(1): 336-342.
[17] Weber N, Weitkamp P, Mukherjee K D. Fatty acid steryl,
stanyl, and steroid esters by esterification and
transesterification in vacuo using Candida rugosa lipase
as catalyst [J]. J Agric Food Chem, 2001, 49(1): 67-71.
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 23 期 2013 年 12 月

·3295·
[18] He W S, Jia C S, Ma Y, et al. Lipase-catalyzed synthesis
of phytostanyl esters in non-aqueous media [J]. J Mol
Catal B: Enzymatic, 2010, 67(1/2): 60-65.
[19] Weber N, Weitkamp P, Mukherjee K D. Fatty acid steryl,
stanyl, and steroid esters by esterification and
transesterification in vacuo using Candida rugosa lipase
as catalyst [J]. J Agric Food Chem, 2001, 49(1): 67-71.
[20] Uppenberg J, Oehrner N, Norin M, et al. Crystallographic
and molecular-modeling studies of lipase B from Candida
antarctica reveal a stereospecificity pocket for secondary
alcohols [J]. Biochemistry, 1995, 34(51): 16838-16851.
[21] Lawson D M, Brzozowski A M, Rety S, et al. Probing the
nature of substrate binding in Humicola lanuginosa lipase
through X-ray crystallography and intuitive modelling [J].
Protein Eng, 1994, 7(4): 543-550.
[22] Ghosh D, Wawrzak Z, Pletnev V Z, et al. Structure of
uncomplexed and linoleate-bound Candida cylindracea
cholesterol esterase [J]. Structure, 1995, 3(3): 279-288.
[23] Lee G C, Lee L C, Sava V, et al. Multiple mutagenesis of
non-universal serine codons of the Candida rugosa LIP2
gene and biochemical characterization of purified
recombinant LIP2 lipase overexpressed in Pichia pastoris
[J]. Biochem J, 2002, 366(Pt 2): 603-611.
[24] Tenkanen M, Kontkanen H, Isoniemi R, et al. Hydrolysis
of steryl esters by a lipase (Lip 3) from Candida rugosa
[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2002, 60(1/2): 120-127.
[25] 赵 江, 胡松青. 响应曲面法优化非水相酶催化合成
乳酸乙酯 [J]. 现代食品科技, 2009, 25(11): 1320-1322.
[26] Kawakami S, Wong J, Sato A, et al. Biodistribution
characteristics of mannosylated, fucosylated, and
galactosylated liposomes in mice [J]. Biochim Biophys
Acta, 2000, 1524(2/3): 258-265.
[27] Wang S N, Deng Y H, Xu H, et al. Synthesis of a novel
galactosylated lipid and its application to the hepatocyte-
selective targeting of liposomal doxorubicin [J]. Eur J
Pharm Biopharm, 2006, 62(1): 32-38.