全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 5 期 2012 年 5 月

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褐藻多糖硫酸酯对 H2O2诱导皮层神经元氧化应激损伤保护作用
郭宏举，史 宁，陈 乾，马天翔，潘敏翔，吴久鸿*
解放军第 306 医院药学部，北京 100101
摘 要：目的 研究褐藻多糖硫酸酯对 H2O2 诱导小鼠皮层神经元氧化损伤的保护作用，并探讨其作用机制。方法 以含有
B-27 的 Neurobasal 培养基无血清体外原代培养新生小鼠大脑皮层神经元，H2O2（50 μmol/L）诱导氧化应激损伤模型，MTT
法检测不同质量浓度（0.01、0.1、1 g/L）褐藻多糖硫酸酯对细胞存活的影响，生化法测定乳酸脱氢酶（LDH）释放量和丙
二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）的活性。结果 与 H2O2处理组比较，0.1、1 g/L 褐藻多糖硫酸酯能显著提高 H2O2
诱导损伤皮层神经元的存活率（P＜0.05），并且降低培养液中 LDH 的漏出量，抑制细胞内 MDA 的生成，提高细胞内 SOD
的活性。结论 褐藻多糖硫酸酯对 H2O2损伤皮层神经元具有显著的保护作用，其机制与抗氧化作用有关。
关键词：褐藻多糖硫酸酯；氧化应激；抗氧化；神经保护作用；神经元
中图分类号：R285.51 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2012)05 - 0962 - 03
Neuroprotection of fucoidan against H2O2-induced oxidative stress injury
in primary cortical neurons
GUO Hong-ju, SHI Ning, CHEN Qian, MA Tian-xiang, PAN Min-xiang, WU Jiu-hong
Department of Pharmacy, The 306 Hospital of PLA, Beijing 100101, China
Key words: fucoidan; oxidative stress; anti-oxidation; neuroprotection; neurons

褐藻多糖硫酸酯（fucoidan）是从海带、昆布等
藻类中提取的一类硫酸多糖，主要由岩藻糖和硫酸
基组成。大量研究已证实褐藻多糖硫酸酯具有抗肿
瘤、抗病毒、调节免疫等多种生物活性[1]。在体和
离体实验也表明，褐藻多糖硫酸酯还表现出明显的
抗氧化活性[2]，特别对超氧阴离子具有良好的清除
作用；其在多种模型所致的帕金森病细胞和动物模
型中也有明显的神经保护作用 [3]；对 H2O2 刺激
dPC12 细胞模拟的高氧化损伤导致神经元凋亡的
AD 模型[4]也具有良好的神经保护作用，提示褐藻多
糖硫酸酯可作用于神经系统，并发挥神经保护作用。
但目前关于褐藻多糖硫酸酯对中枢系统皮层神经元
保护作用的研究未见报道。本研究采用 H2O2的氧化
作用建立体外培养小鼠大脑皮层神经元氧化损伤模
型，观察褐藻多糖硫酸酯对 H2O2所致皮层神经元损
伤的保护作用，并探讨其可能的作用机制。
1 材料
1.1 动物
昆明种仔鼠，由第四军医大学实验动物中心提
供，合格证号 XCSK（军）2002-005。
1.2 药品与试剂
褐藻多糖硫酸酯，购于西安慈缘生物技术有限
公司（批号 CY101118，质量分数为 98%）。
NeurobasalTM Medium、DMEM、B-27 supplement
均购于 Gibco 公司。新生牛血清（杭州四季青公司）；
L- 多聚赖氨酸（相对分子质量为 1.5×105 ～
3.0×105，Gibco 公司）；MTT、二甲基亚砜（DMSO）
Amresco 分装；乳酸脱氢酶（LDH）、超氧化物歧化
酶（SOD）、丙二醛（MDA）试剂盒，均为南京建
成生物工程研究所产品。
1.3 仪器
BIO—RAD（Model 680）型酶标仪，SW—CJ—
IF 型超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司），
倒置相差显微镜（Olympus CKX41），CO2 培养箱
（Hera Cell），PHS—3C 精密 pH 计（上海精密科学
仪器有限公司），三蒸水（高压灭菌）。
2 方法
2.1 大脑皮层神经元培养
出生 14～16 d 的昆明仔鼠，无菌条件下分离双
侧大脑，迅速置于预冷的 CMF-HBSS 液中除去大脑

收稿日期：2011-08-08
基金项目：国家自然科学基金资助项目（3077263）
作者简介：郭宏举（1983—），男，药师，研究方向为药理学。Tel: (010)66356172 E-mail: ghj4329502@126.com
*通讯作者 吴久鸿 Tel: (010)66354564 E-mail: jiuhongwu@hotmail.com
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髓质、脑膜和血管，将皮层部分剪碎为 1～2 mm3
的小组织块。转入含 0.125%胰蛋白酶的 5 mL 离心
管中，细口玻璃管轻轻吹打后置 37 ℃消化 15 min
（每 5 min 振荡 1 次）。将组织块转入等体积含 10%
新生牛血清的 DMEM 培养基中，终止消化 5 min。
再吸出组织块置于离心管中，用 3 mL DMEM 的培
养液轻轻吹打 15 次左右，静置 3 min 后取上清。重
复操作两次，收集上清液，500 r/min 离心 5 min。弃
去上清液，200 目金属网滤过，调整细胞数至 8×
105/mL，接种于 0.01% L-多聚赖氨酸包被过的培养板
中，置 37 ℃、5% CO2孵箱中培养，每 3 d 进行 1 次
半量换液。每天观察细胞生长情况。采用神经元特异
性标志物微管相关蛋白 2（microtubule-associated
protein 2, MAP2）与细胞核双标记法对培养皮质神经
细胞进行了纯度鉴定，结果显示采用此法培养神经元
纯度较高，纯度在 90%以上；且杂质细胞极少。
2.2 H2O2 诱导神经元损伤模型制备
取培养 7 d 的皮层神经元，分为对照组、H2O2
处理组（0、10、25、50、100、200 μmol/L）、褐藻
多糖硫酸酯＋H2O2 (50 μmol/L) 处理组进行实验。
H2O2 处理组吸去原培养液，PBS 洗 2 遍，加入含各
种浓度 H2O2的 Neurobasal 培养基，继续培养 6 h 进
行实验。对照组不加 H2O2，其余同 H2O2 处理组。
给药组在 H2O2 处理前 24 h 加入不同浓度的褐藻多
糖硫酸酯，终质量浓度为 0.01、0.1、1 g/L。褐藻多
糖硫酸酯溶媒为高压灭菌的三蒸水。
2.3 MTT 比色法测定细胞存活率
H2O2作用 6 h 后，每孔内加入 20 μL MTT 液（终
质量浓度为 0.5 mg/mL），37 ℃继续培养 4 h，弃上
清液，加入 DMSO 150 μL，室温振荡 10 min。待孔
内颗粒完全溶解后，酶标仪上测定 570 nm 处的吸
光度（A570）值，计算细胞存活率。
细胞存活率＝实验组 A570 / 对照组 A570
2.4 培养液中 LDH 测定
细胞处理后，收集细胞培养上清液，参照试剂
盒说明书测定培养液中 LDH 漏出量。
2.5 细胞内 SOD 活性和 MDA 测定
细胞经损伤处理后去除原培养液，细胞用 PBS
洗 2 遍，每孔加入 0.1 mol/L PBS 和 0.05 mmol/L
EDTA（pH 8.0）1 mL，再加入 1% Triton-X100 50 μL，
将培养板置振荡器振荡 1 min 使之溶解，加入 25%
H3PO4 100 μL 以沉淀蛋白，10 000×g 于 4 ℃离心
1 h，取上清液按说明书测定 SOD活性和MDA水平。
2.6 统计学处理
所有数据均以 sx ± 表示，应用 SPSS13.0 软件
进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析。
3 结果
3.1 褐藻多糖硫酸酯对 H2O2 损伤皮层神经元存活
率的影响
25 μmol/L 以下浓度 H2O2对神经元存活率无影
响，从 50 μmol/L 开始细胞存活率明显下降。与对
照组相比，50、100、200 μmol/L H2O2 诱导神经元
不同程度的损伤（P＜0.01），细胞存活率呈浓度依
赖性的降低。其细胞存活率分别降至 68.96%、
35.02%、8.78%。预先 24 h 给予褐藻多糖硫酸酯
（0.01、0.1、1 g/L），可以预防 H2O2 对细胞的损伤，
明显提高细胞存活率，结果见表 1。
为进一步考察褐藻多糖硫酸酯对 H2O2 损伤皮
层神经元的保护作用，以培养液中 LDH 漏出量作
为观察指标进行实验，神经元经 50 μmol/L H2O2损
伤后，细胞膜通透性增大，LDH 大量漏出。致使培
养液中 LDH 的量显著增加。预先 24 h 给予褐藻多
糖硫酸酯（0.01、0.1、1 g/L）与 H2O2处理组相比，
0.1、1 g/L 褐藻多糖硫酸酯可明显降低细胞培养液
中 LDH 的漏出量。结果见表 1。
表 1 褐藻多糖硫酸酯对 H2O2损伤原代培养皮层神经元的
保护作用 ( ± = 6x s , n )
Table 1 Protection of fucoidan on primary cortical
neurons injured by H2O2 ( 6=± n , sx )
组 别 ρ / (g·L−1) 细胞存活率 / ％ LDH / (kU·L−1)
对 照 － 98.15±1.78 22.33±1.34
H2O2 － 65.44±3.61** 60.95±2.14**
褐藻多糖硫酸酯 0.01 63.26±3.13 61.13±4.23
0.1 75.33±4.57Δ 55.26±3.37Δ
1 80.76±3.65ΔΔ 48.35±5.12ΔΔ
与对照组比较：**P＜0.01；与 H2O2组比较：ΔP＜0.05 ΔΔP＜0.01
**P < 0.01 vs control group; ΔP < 0.05 ΔΔP < 0.01 vs H2O2 group
3.2 褐藻多糖硫酸酯对细胞 MDA 水平和 SOD 活
性的影响
与对照组相比，皮层神经元经 50 μmol/L H2O2
损伤后培养液中 MDA 水平显著增加，SOD 活性显
著降低；预先 24 h 给予褐藻多糖硫酸酯（0.01、0.1、
1 g/L）与 H2O2 处理组相比，0.1、1 g/L 褐藻多糖硫
酸酯可明显降低培养液中 MDA 水平并且升高 SOD
活性，结果见表 2。
4 讨论
传统的细胞培养方法以各种血清提供神经营养
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表 2 褐藻多糖硫酸酯对 H2O2损伤皮层神经元培养液中
MDA 水平和 SOD 活性的影响 ( 6=± n , sx )
Table 2 Effect of fucoidan on MDA level and SOD activity in
medium of neurons injured by H2O2 ( 6=± n , sx )
组 别 ρ / (g·L−1) MDA / (μmol·L−1) SOD / (U·mL−1)
对 照 － 0.42±0.04 17.49±1.21
H2O2 － 1.12±0.11** 7.95±1.14**
褐藻多糖硫酸酯 0.01 1.03±0.08 8.52±1.23
0.1 0.73±0.09ΔΔ 10.26±2.37ΔΔ
1 0.62±0.05ΔΔ 13.41±2.17▲ΔΔ
与对照组比较：**P＜0.01；与 H2O2 处理组比较：ΔΔP＜0.01；与
褐藻多糖硫酸酯 0.1 g·L−1 组比较：▲P＜0.05
**P < 0.01 vs control group; ΔΔP < 0.01 vs H2O2 group; ▲P < 0.05 vs
fucoidan 0.1 g·L−1 group
因子，神经元生长良好，但血清中含有的丰富营养
成分也同时促进了神经胶质细胞生长。这类细胞通
常占神经元的比例很大，并且还具有增殖能力。因
此需要加入阿糖胞苷等有丝分裂抑制剂抑制胶质细
胞的生长[5]。另外，血清培养不宜进行长期研究，
而且血清的成分相对比较复杂，含有一些未知因素
可能影响实验结果。采用无血清培养则可以免除血
清带来的弊端，并且能明显改善神经元的生长状态
和存活时间[6]。本研究则以无血清培养基培养新生
小鼠的大脑皮层神经元，细胞生长良好，皮层神经
元典型清楚，且神经胶质细胞的干扰很少，培养至
第 5 天神经元的纯度即可达 95%以上。
H2O2 是一种较强的氧化剂，极易进入细胞内，
通过 Haber-Weiss 或 Fenton 反应，形成高活性的氧
自由基或羟基自由基。这些自由基几乎可与细胞内
的任何成分发生反应造成细胞损伤[7]。使神经元发
生脂质过氧化反应生成 MDA，SOD 是主要存在于
细胞浆和线粒体里的一种金属蛋白酶，能够清除代
谢产生的超氧阴离子，是体内抗氧化系统的重要组
成部分。因此，测定 MDA、SOD 活性既可以反映
细胞损伤程度又可以判断细胞损伤原因[8-9]。研究表
明大脑皮层是中枢神经系统的重要组成部分，参与
多种功能作用。本实验研究结果显示 H2O2（50
μmol/L）诱导皮层神经元 6 h，与对照组相比细胞内
MDA 水平明显升高而胞内 SOD 活性显著降低，提
示 H2O2（50 μmol/L）所致皮层神经元损伤与脂质
过氧化损伤有关，褐藻多糖硫酸酯可提高皮层神经
元内 SOD 活性并显著降低胞内 MDA 的量，提高皮
层神经元存活率，表明褐藻多糖硫酸酯可明显地减
弱 H2O2 所造成的皮质神经元氧化应激损伤。研究
显示褐藻多糖硫酸酯对 MPP+诱导 MN9D 细胞的损
伤模拟的 PD 模型[10]、H2O2 刺激 dPC12 细胞模拟高
氧化损伤导致神经元凋亡的 AD 模型[11-12]产生良好
保护作用。提示褐藻多糖硫酸酯有可能对帕金森病、
阿尔茨海默病[13]等神经性退行疾病产生治疗作用。
本实验结果初步显示褐藻多糖硫酸酯具有体外神经
保护作用。
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