全 文 :中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 7 期 2012 年 7 月
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• 药材与资源 •
刺五加环阿屯醇合酶基因的克隆及其表达分析
邢朝斌,龙月红,吴 鹏,何 闪,朱金丽,李宝财
河北联合大学生命科学学院,河北 唐山 063000
摘 要:目的 克隆刺五加的环阿屯醇合酶(cycloartenol synthase,CAS)基因,并对其进行生物信息学和表达分析。方法
采用 cDNA 末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆刺五加 CAS 基因的全长 cDNA 序列。运用生
物信息学方法对该基因进行分析,预测其编码蛋白的结构与功能,并通过 RT-PCR 法检测 CAS 在不同生长发育时期和不同
器官中的表达情况。结果 刺五加 CAS 基因的 cDNA 全长为 2 758 bp,开放阅读框长 2 277 bp,编码 758 个氨基酸的蛋白,
包含三萜合成酶的标志性序列。CAS 蛋白无跨膜区域,定位于细胞质中。RT-PCR 的结果显示,刺五加 CAS 基因在各时期
和器官中均有表达,但表达量具有显著差异(P<0.05)。其中果实基本成熟期的表达量最高,是最低量萌芽期的 1.56 倍,
各器官中,叶片的表达量最高,是最低量叶柄的 1.37 倍。结论 首次分离并报道了刺五加的 CAS cDNA 克隆,并证实其在
不同生长发育时期和不同器官中的表达量不同,为进一步研究 CAS 对刺五加皂苷量的影响和表达调控奠定基础。
关键词:刺五加;环阿屯醇合酶;克隆;表达分析;cDNA 末端快速扩增
中图分类号:R282.12 文献标志码:A 文章编号:0253 - 2670(2012)07 - 1387 - 06
Cloning of cycloartenol synthase gene from Eleutherococcus senticosus
and its expression analysis
XING Zhao-bin, LONG Yue-hong, WU Peng, HE Shan, ZHU Jin-li, LI Bao-cai
College of Life Science, Hebei United University, Tangshan 063000, China
Abstract: Objective To clone cycloartenol synthase (CAS) gene from Eleutherococcus senticosus and analyze its bioinformatics and
expression. Methods CAS gene full length cDNA was cloned by rapid amplification of cDNA ends (RACE). CAS gene was analyzed by
bioinformatics method, and the structure and function of CAS gene were deduced. The expression of CAS in different organs of E. senticosus
at various growing periods was detected by RT-PCR. Results The full length of CAS gene cDNA was 2 758 bp containing a 2 277 bp open
reading frame (ORF) that encoded a protein of 758 amino acids includinng triterpene synthase signature sequence. Without transmembrane
domain, CAS gene was located in cytoplasm. RT-PCR result showed that CAS gene expressed in different organs of E. senticosus at various
growing periods showed significant difference (P < 0.05). The highest content of the expression showed up when the fruit almost maturated,
which was 1.56 times as much as that in the lowest as plant sprouts. The highest content of the expression was in the leaves which was 1.37
times as much as that of the lowest in petiole. Conclusion The CAS gene of E. senticosus is successfully cloned and reported for the first
time which proves that the expression in different organs of E. senticosus at various growing periods is different. The cloning of CAS gene
provides a stable foundation for its effect on saponins amount of E. senticosus and expression regulation.
Key words: Eleutherococcus senticosus Harms; cycloartenol synthase (CAS); clone; expression analysis; rapid amplification of cDNA
ends (RACE)
刺五加 Eleutherococcus senticosus Harms 根、
茎、叶均可入药,是我国传统的珍贵药用植物[1],
具有多种生理活性及药理作用,三萜皂苷是其主要
活性成分之一[2]。在植物体内,三萜类化合物均需
通过依赖甲羟戊酸的类异戊二烯途径合成,该途径
中,2, 3-氧化鲨烯可在 β-香树酯醇合成酶(β-amyrin
收稿日期:2012-02-29
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30701086);河北省自然科学基金资助项目(C2009001252);河北省自然科学基金-石药集团医药联合
研究基金(H2012401006)
作者简介:邢朝斌(1975—),男,副教授,研究方向为分子生药学、药用植物细胞工程。
Tel: (0315)3726238 Fax: (0315)3726341 E-mail: xingzhaobin@yahoo.com.cn
网络出版时间:2012-06-04 网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/12.1108.R.20120604.1104.006.html
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synthase,bAS)催化下合成各种以齐墩果烷为基本
单位的三萜皂苷类化合物[3],从而进入三萜皂苷代
谢支流;但也可在环阿屯醇合酶( cycloartenol
synthase,CAS)催化下环化生产环阿屯醇,而进入
植物甾醇合成支流[4]。因此,尽管 CAS 不是三萜皂苷
生物合成途径中的关键酶,但它可与 bAS 竞争共同前
体 2, 3-氧化鲨烯,间接影响三萜皂苷代谢支流。抑制
CAS 基因表达后,则可在减少植物甾醇合成的同时,
使 2, 3-氧化鲨烯进入三萜皂苷代谢支流,从而显著提
高三萜皂苷的量[5]。这表明 CAS 既是植物甾醇合成的
关键酶,也是调控三萜皂苷合成的重要调控点。
目前已经从 20 多种植物中克隆出编码 CAS 的
cDNA 序列[6],但未见关于刺五加 CAS 的相关报道。
本课题组在已克隆出刺五加法呢二磷酸合成酶、鲨
烯合酶、鲨烯环氧酶、bAS 4 个皂苷合成关键酶基
因和可作为内参照基因的甘油醛-3-磷酸脱氢酶
(GAPDH)基因[1]基础上,利用 cDNA 末端快速扩
增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术
首次克隆到刺五加 CAS 基因的 cDNA 全长序列,并
对其在不同生长发育时期、不同器官中的表达进行
了半定量 RT-PCR 分析,为研究该基因在刺五加皂
苷合成中的作用机制和反义表达调控奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
刺五加采自河北省兴隆县雾灵山国家级自然保
护区,经河北联合大学生命科学学院邢朝斌副教授
鉴 定 为 五 加 科 植 物 刺 五 加 Eleutherococcus
senticosus Harms。以清水冲洗杂质,滤纸吸干水分
后的 4~9 月份采收的根和 8 月采收的幼茎、叶片、
叶柄(编号为 1~10)为刺五加总 RNA 提取材料。
TC—512 PCR 仪(英国 Technec 公司);3K15
台式高速冷冻离心机(德国 Sigma 公司);电子天
平(上海亚荣仪器厂);IS2200 凝胶成像系统(美
国 Alpha 公司);JY1000C 通用型电泳仪(北京市六
一仪器厂);CHA—S 型气浴摇床(金坛市精达仪器
制造厂)。
植物 RNA 提取试剂盒,琼脂糖凝胶 DNA 回收
试剂盒,PGM-T 克隆试剂盒,dCTP,dNTP,TOP-10
感受态细胞购自天根生化科技(北京)有限公司;
RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit 购自
Fermentas 公司;3’-Full RACE Core Set Ver. 2.0,
PrimeScript 逆转录酶,TdT,RNase H,LA Taq DNA
聚合酶购自 Takara 公司;IPTG,X-gal,质粒提取
试剂盒购自北京拜尔迪生物技术有限公司;PCR 产
物纯化试剂盒,Taq DNA 聚合酶购自 Biomiga 公司;
其他试剂均为国产分析纯。引物委托上海生工生物
工程有限公司合成,PAGE 纯化。
1.2 刺五加总RNA的提取和CAS基因保守区的获得
按照植物 RNA 提取试剂盒说明书的要求,称
取 0.1 g 刺五加根、幼茎、叶片和叶柄提取总 RNA。
利用 Dnaman 6.0 软件分析人参(AB009029)、
三七(EU342419)和积雪草(AY520819)CAS 基
因的核苷酸序列,在保守区域设计一对寡核苷酸简
并引物。上游引物 CASS-1:5’-GG(G/A/T)GATTA-
TGG(A/T/C)GGTCCTATG-3’,下游引物 CASX-1:
5’-TGACA(G/T) GA(A/G)AG(A/G)TAACTCTCTC-
C-3’。取总RNA 3 μL,以Oligo(dT)18为引物,根据
RevertAidTM First strand cDNA synthesis Kit 的说明
进行逆转录反应。以逆转录获得的 cDNA 为模板,
使用 CASS-1 和 CASX-1 引物,PCR 扩增刺五加
CAS 基因的保守片段。反应体系 50 μL,其中上下
游引物各 2 μL,10×LA Taq 缓冲液(含 15 mmol/L
MgCl2)5 μL,2.5 mmol/L dNTP 4 μL,模板 cDNA
1 μL,LA Taq 酶 0.5 μL,补 dd H2O 至 50 μL。反应
条件为:预变性 94 ℃、3 min;变性 94 ℃、30 s;
退火 56 ℃、30 s;延伸 72 ℃、90 s。35 个循环
后 72 ℃延伸 10 min。PCR 产物经 1.2%琼脂糖凝胶
电泳后,切胶回收纯化,克隆至 PGM-T vector 载体,
转化大肠杆菌 TOP10 后提取重组质粒并送
Invitrogen 公司测序。
1.3 5’RACE 技术获取刺五加 CAS 基因 cDNA 5’
末端序列
根据“1.2”项中所获得的刺五加 CAS cDNA 的
保守片段,应用 Primer Premier 5.0 设计 5’RACE 特
异性引物 CAS52:5’-TCTATTTCGTGATAAGGGAC
AG-3’和 CAS51:5’-GCTCCTTCGCCAAGCAACC-
TCA-3’。参照罗聪等[7]的方法进行 5’RACE 扩增。
取总 RNA 3 μL,以 AUP1 为引物,逆转录合成 cDNA
第 1 链。逆转录产物用 RNase H 处理 1 h 后,纯化。
纯化产物以 50 μL 体系进行 TdT 末端加尾,加尾 2 h
后,纯化获得加尾的 cDNA。应用巢式 PCR 和降落
PCR 技术进行 RACE 扩增。第 1 轮 PCR 的引物为 AP
长和 CAS52,第 2 轮 PCR 的引物为 AP 短和 CAS51,
利用 LA Taq DNA 聚合酶 PCR 扩增 CAS 基因 5’末端
cDNA 序列。其他反应体系和反应条件与文献的方法
相同。按“1.2”项中的方法进行回收、克隆,并测序。
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1.4 3’RACE 技术获取刺五加 CAS 基因 cDNA 3’
末端序列
根据“1.2”项所获得的刺五加 CAS cDNA 的部
分序列,应用 Primer Premier 5.0 设计 3’RACE 特异
性外侧引物 CAS32:5’-ATGCCAAGCGGCTGTAT-
GAT-3’和内侧引物 CAS31:5’-TTTGGTAGCTGC-
TGGGAGGA-3’。取 3 μL 总 RNA,以 3’RACE
Adaptor 为引物,参照 3’-Full RACE Core Set Ver.2.0
逆转录部分的说明进行逆转录反应。并利用引物
CAS32 和 CAS31 进行 2 轮巢式 PCR 反应,反应体
系中模板量为 3 μL,第 2 轮 PCR 的退火温度均为
56 ℃,延伸均为 90 s,其他按照说明书进行。参照
“1.2”项中的方法进行回收、克隆,并测序。
1.5 刺五加 CAS 基因全长的拼接与 PCR 验证
利用 Dnaman 6.0 软件将“1.2”项中获得的保
守序列和“1.3”项中获得的 5’末端序列、“1.4”项
中获得 3’末端序列进行拼接,获得刺五加 CAS 基因
的全长 cDNA 序列。根据拼接的序列设计扩增刺五
加 CAS 基因 cDNA 全长序列的上游引物 ECASAS:
5’-AGTCCAACGAGCAAAATACA-3’ 和下游引物
ECASAX:5’-GCAATAGTGCCGATAAGGT-3’。以
1.2 中逆转录的 cDNA 为模板,PCR 扩增 CAS cDNA
的全长序列。PCR 反应体系为 25 μL,其中引物
ECASAS 和 ECASAX 各 1 μL,10×LA Taq Buffer
(含 15 mmol/L MgCl2)2.5 μL,2.5 mmol/L dNTP 2
μL,模板 cDNA 1 μL,LA Taq 酶 0.3 μL,补 dd H2O
至 25 μL。反应条件为 94 ℃、5 min;94 ℃、1 min;
53 ℃、30 s;72 ℃、3 min 20 s,35 个循环后 72 ℃
延伸 10 min。PCR 产物经 1.2%的琼脂糖凝胶后,
参照“1.2”项中的方法回收、克隆,并测序。
1.6 刺五加 CAS 基因的生物信息学分析
通过Dnaman 6.0软件将刺五加CAS基因 cDNA
全长序列翻译成氨基酸序列;应用 Dnastar 5.0 软件
确定开放阅读框(ORF);利用 ExPASy 的 Protparam
预测蛋白质的基本理化性质;通过 PROSITE 进行
蛋白质功能结构域分析;利用 PSORT 进行蛋白的
亚细胞定位进行蛋白质二级结构分析;使用 MEGA
5.05 软件中的邻位相连法(Neighbor-Joining,NJ)
法构建系统发育树。
1.7 刺五加 CAS 基因在不同生长发育时期及不同
器官中的表达分析
利用 Primer Premier 5.0 软件,设计半定量
RT-PCR 扩 增 刺 五 加 CAS 基 因 的 上 游 引 物
RCASAS:5’-TGTATGGGAAGAGGTTTGT-3’和下
游 引 物 RCASAX : 5’-TCTATTTCGTGATAAG-
GGAC-3’,预计扩增长度 88 bp;扩增刺五加GAPDH
基因的上游引物 RGS:5’-GCAAGGACTGGAGAG-
GTGGA-3’和下游引物 RGX:5’-AGTGGGAACTC-
GGAAGGACA-3’,预计扩增长度 134 bp。参照文
献的方法[8],以“1.2”项中逆转录的 1~10 号刺五
加 cDNA 为模板进行 PCR 扩增,反应体系为 25 μL:
上下游引物(10 mmol/L)各 1 μL,10×缓冲液(含
15 mmol/L MgCl2)2.5 μL,2.5 mmol/L dNTP 2 μL,
模板 cDNA 1 μL,Taq 酶 1 μL,补 dd H2O 至 25 μL。
PCR 条件为:预变性 94 ℃、5 min;变性 95 ℃、30
s;退火 30 s,温度分别为 55 ℃(GAPDH)和 52 ℃
(CAS);延伸 72 ℃、10 s。35 个循环后 72 ℃延伸 2
min,4 ℃终止反应。将 5 μL PCR 产物加样至 1.2%
琼脂糖凝胶样品孔中,在 1×TAE 电泳缓冲液中电
泳鉴定 PCR 产物,紫外灯下照相,并进行光密度值
和统计学分析。
2 结果与分析
2.1 刺五加 CAS 基因的克隆
利用简并引物 CASS-1 和 CASX-1 对刺五加的
cDNA 进行 PCR 扩增,获得一条约为 1 650 bp 的条
带(图 1),测序得到 1 643 bp 的片段,经 NCBI 的
BLAST1 比对,确定该片段为刺五加 CAS 基因
cDNA 的部分片段。以 cDNA 的加尾产物为模板,
利用引物对 AP 长-CAS52 和 AP 短-CAS51 进行巢
式 PCR 和降落 PCR 技术相结合的 5’RACE 扩增,
获得长 702 bp 的片段(图 1)。以 3’RACE Adaptor
引物逆转录的 cDNA 为模板,利用 3’RACE Outer
1-CAS 基因保守区的 PCR 扩增 2-CAS 基因的 5’RACE 3-CAS
基因的3’RACE 4-CAS基因 cDNA全长的PCR扩增 M-DL2000
DNA Marker
1-PCR amplification of CAS gene conserved sequence 2-5’RACE
of CAS gene 3-3’RACE of CAS gene 4-PCR amplification of full
sequence of CAS gene cDNA M-DL2000 DNA Marker
图 1 刺五加 CAS 基因的克隆
Fig. 1 Clone of CAS gene from E. senticosus
M 1 M 2 M 3 M 4
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
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Primer-CAS32 和 3’RACE Inner Primer-CAS31 引物
对,应用 3’RACE 获得 758 bp 的片段(图 1)。
应用 Dnaman 6.0 软件将所获得的 5’端、3’端
cDNA 序列和保守区段进行拼接,应用 Dnastar 5.0
软件对该 cDNA 序列进行 ORF 分析,发现该序列包
含刺五加 CAS 基因的完整 ORF。以刺五加的 cDNA
为模板,利用引物 ECASAS 和 ECASAX 扩增获得 2
709 bp 的一条带,与预期大小相符。将该片段回收、
克隆和测序后,与 5’端、3’端 cDNA 序列和保守区
段拼接获得的序列比对,两者序列完全相同。
2.2 刺五加 CAS 基因的生物信息学分析
刺五加CAS基因全长 2 758 bp(GenBank登录号:
JQ400139),其中 5’端非翻译区(5’UTR)长 130 bp,
3’端非翻译区(3’UTR)长351 bp,终止密码子为TGA,
ORF 长 2 277 bp,编码 758 个氨基酸,3’端具有 poly A
尾。预测的蛋白质相对分子质量为 85.991,理论等电
点(pI)为 6.61。氨基酸序列与三七 Panax notoginseng
(Burkill) Hoo et Tseng、人参 P. ginseng C. A. Meyer、
积雪草 Centella asiatica (L.) Urban 和高氏柴胡
Bupleurum kaoi Liu, Chaos et Chuang 的同源性分别达
到 93.8%、91.1%、90.0%和 85.1%。
通过 NCBI 的 BLAST 比对发现,刺五加 CAS 蛋
白与已知的蛋白质结构功能数据库中其他物种的
CAS 具有相似的结构功能域。刺五加 CAS 的 603~
617 (DGSWYGSWGVCFTYG) 氨基酸残基处为三萜
合成酶的标志性序列。通过 Tmhmm 软件分析得知,
刺五加 CAS 蛋白无跨膜区域,全部存在于膜外,Psort
服务器的亚细胞定位分析表明,刺五加的 CAS 定位
于细胞质中。运用 Sopma 软件预测刺五加 CAS 蛋白
的二级结构的结果表明,该蛋白含有 320 个 α螺旋,
占 42.22%;87 个延伸链,占 11.48%;45 个 β折叠,
占 5.94%;306 个无规则蜷曲,占 40.37%(图 2)。
蓝色-α螺旋 红色-延伸链 绿色-β折叠 紫色-无规则蜷曲
blue - alpha helix red - extended strand green - beta folding purple - random coil
图 2 刺五加 CAS 蛋白二级结构的预测
Fig. 2 Predicted secondary structure for CAS protein from E. senticosus
2.3 CAS 蛋白的分子系统进化分析
将刺五加 CAS 的编码蛋白与 GenBank 中登载的
14 种植物的 CAS 蛋白进行聚类分析,构建 CAS 系统
进化树,结果如图 3 所示。刺五加与同为五加科的三
分支上的数字为可信度(%)
Numbers at branches are credibility (%)
图 3 CAS 蛋白的系统进化树
Fig. 3 Phylogenetic tree of CAS protein
七亲缘关系最近,首先聚为 1 支,可信度 99%,之后
与五加科的人参和伞形科的积雪草聚在一起,随后
和其他双子叶植物聚为 1 个大的分支,单子叶植物、
裸子植物分别聚为 1 个分支,这与传统的分类结果
相一致。
2.4 不同生长发育时期 CAS 基因的表达分析
不同时间刺五加 CAS 基因的表达量变化如图
4 所示。自萌芽开始的整个生长期中,CAS 基因
均有表达。在整个生长期中,CAS 的表达呈现低-
高-低-高-低的变化趋势。其中萌芽期(4 月)的
表达量最低,至盛花期(6 月)时,CAS 的表达
量显著提高(P<0.05),进入第 1 个表达高峰,达
萌芽期的 1.45 倍。之后随着果实体积的增长(7
月 26 日),表达量降至盛花期的 85.01%。至果实
基本成熟(8 月)时表达量又显著提高(P<0.05),
达到最大值,为萌芽期的 1.56 倍。叶片大部分衰
老时(9 月),CAS 的表达量小幅回落,但仍显著
高于萌芽期的表达量,而与叶片完全展开和盛花
期的表达量相当。
三七
刺五加
人参
积雪草
高氏柴胡
百脉根
大豆
葡萄
白桦
蓖麻
毛果杨
拟南芥
燕麦
二穗短柄草
红果冷杉
99
67
90
100
48
51
80
96
100
100
99
0 100 200 300 400 500 600 700
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2.5 不同器官 CAS 基因的表达分析
刺五加 CAS 基因在叶片、叶柄、幼茎和根中的
表达量具有显著差异(P<0.05),见图 5。最大表
达量出现在叶中,为最低表达量(叶柄)的 1.37 倍,
根次之,两者的表达量显著高于叶柄和幼茎中的表
达量(P<0.05)。
不同小写字母代表差异显著(P<0.05),下同
Different lowercase letters mean significant difference (P < 0.05),
same as below
图 4 不同刺五加发育时期 CAS 基因表达量的变化
Fig. 4 Expression variations of CAS gene from E. senticosus
during different growing periods
图 5 刺五加不同器官中 CAS 基因表达量的变化
Fig. 5 Expression variations of CAS gene in different
organs from E. senticosus
3 讨论
本实验所克隆的刺五加 CAS 基因与三七、人参
等五加科植物的 CAS 基因序列一致性在 90%以上,
他们均属于鲨烯环化酶基因家族。序列和结构上的
较高一致性说明植物 CAS 基因是一个比较保守的
基因,这可能是因为植物甾醇是生物膜的重要组分,
而CAS是植物甾醇生物合成途径中关键酶的缘故[9]。
目前已经从不同植物中分离得到了 5 种类型的鲨烯
环化酶,即达玛烷二醇合成酶(dammarenediol
synthase,DS)、bAS、羽扇豆醇合成酶( lupeol
synthase,LUS)、羊毛甾醇合成酶( lanosterol
synthase,LS)和 CAS,其中 CAS 主要催化甾醇和
类甾醇的合成[10]。氨基酸序列同源性比较发现,
CAS 类氨基酸序列的相似性达到 80%以上,所有
CAS 的氨基酸序列中都存在高度保守的 DCTAE 和
QW 区域[11-12],其中 DCTAE 与底物的结合有关,
将鲨烯合酶的 DDTAV 定点突变成 DCTAE 后,导
致该酶的底物由鲨烯变成 2, 3-氧化鲨烯[11];QW 为
芳香族氨基酸区域,在 CAS 中重复出现 4~8 次,
QW 区域是负电性的,在环化过程中与中间正离子
相互作用,这些重复序列可能与蛋白质结构的稳定
性和功能相关[12]。这些区域同样也存在于刺五加的
CAS 中。
CAS 被认为是引导类异戊二烯代谢途径流向甾
醇和三萜化合物的关键所在[4],那么分析其表达量
的变化就可探明甾醇合成对三萜类化合物的影响。
相对定量的 RT-PCR 的分析结果表明,刺五加的
CAS 在不同生长发育时期、叶、叶柄、幼茎和根等
器官中均有表达,这与盾叶薯蓣 CAS 的表达特点相
似[13],具有组成型表达的特点。CAS 和 bAS 共同竞
争底物 2, 3-氧化鲨烯,使其进入不同的合成途径,
刺五加 CAS 在整个生长期中表达量增减幅度相对
较小,最大值仅为最小值的 1.56 倍,而 bAS 表达量
增减幅度较大,最大值可达最小值的 7.51 倍[8]。
目前刺五加 CAS 基因的研究尚未见报道。本实
验首次克隆了刺五加的 CAS 基因 cDNA 全长序列,
生物信息学分析结果表明该基因具有鲨烯环化酶基
因家族的典型特征,并证实 CAS 基因在不同生长发
育时期和不同器官中均有表达,但表达量间存在显
著差异。研究结果为分析 CAS 基因表达对刺五加皂
苷含量的影响,及对刺五加的 CAS 基因进行表达调
控,提高皂苷量奠定了基础。
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04-26 05-26 06-26 07-26 08-26 09-26
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
相
对
表
达
量
日期
a
d
b b
c
b
叶 叶柄 幼茎 根
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
相
对
表
达
量
a
c c
b
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