全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 4 期 2012 年 4 月

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长春花毛状根再生植株的获得及抗癌生物碱的产生
龚一富 1，王何瑜 1，卢 鹏 1，袁 泉 1，王桂林 2，刘建军 3
1. 宁波大学生命科学与生物工程学院，浙江 宁波 315211
2. 宁波市合一农业科技开发有限公司，浙江 宁波 315000
3. 宁波市沁香园农业开发有限公司，浙江 宁波 315800
摘 要：目的 建立长春花转基因毛状根再生植株快速繁育体系，获得生物碱量提高的长春花再生植株。方法 研究外源植
物生长调节剂对长春花毛状根愈伤组织诱导、不定芽分化、不定根分化和再生植株移栽的影响，采用 HPLC 法测定长春花
再生植株生物碱量，并采用定量 PCR 技术分析目的基因的表达情况。结果 转基因长春花毛状根愈伤组织诱导和不定芽诱
导的最佳培养基均是 MS＋6-BA 2.0 mg/L＋NAA 0.3 mg/L，不定根分化的最适培养基是 1/2 MS＋NAA 0.3 mg/L。采用炼苗
的改进方法可使长春花再生植株的移栽成活率达 90%。HPLC 分析结果表明，长春花再生植株中长春碱、长春新碱和阿吗碱
量分别比对照提高 4.0、5.8、1.8 倍，其中，优良单株 OG30-3 的长春新碱和长春碱量比对照提高 7 倍和 10 倍。定量 PCR 分
析结果表明，转基因植株 orca3 基因和 g10h 基因的表达量比非转基因植株的高。结论 转基因长春花毛状根再生植株可促
进抗癌生物碱的产生。
关键词：长春花；生物碱；毛状根；再生植株；HPLC
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2012)04 - 0788 - 07
Obtainment of regeneration plantlet of Catharanthus roseus hairy roots
and production of anticancer alkaloids
GONG Yi-fu1, WANG He-yu1, LU Peng1, YUAN Quan1, WANG Gui-lin2, LIU Jian-jun3
1. Faculty of Life Science and Biotechnology, Ningbo University, Ningbo 315211, China
2. Ningbo Heyi Agriculture Science and Technology Development Co., Ltd., Ningbo 315000, China
3. Ningbo Qinxiangyuan Agriculture Development Co., Ltd., Ningbo 315800, China
Abstract: Objective To establish an efficient in vitro plant regeneration system in the transgenic Catharanthus roseus hairy roots and
to obtain the high production of anticancer terpenoid indole alkaloids (TIAs) in C. roseus regeneration plantlets. Methods The effects
of plant growth regulators on callus induction, adventitious shoot induction, and adventitious root induction were investigated. HPLC
was used to determine the alkaloids in C. roseus and quantitative PCR (QPCR) to analyze the expression of target genes. Results
The results showed that the best medium for callus and shoot induction was MS + 6-BA 2.0 mg/L + NAA 0.3 mg/L and the best
medium for root induction was 1/2 MS + NAA 0.3 mg/L. The improved transplant method could increase the survival rate of C. roseus
plantlets to 90%. TIA profiling by HPLC revealed that the simultaneous introduction and overexpression of orca3 and g10h in
transgenic plant significantly enhanced vinblastine, vincristine, and ajmalicine accumulation. The concentrations of vinblastine,
vincristine, and ajmalicine were 4.0-, 5.8-, and 1.8-fold respectively more than those in non-transformed plants. QPCR results showed
that the expressions of orca3 and g10h genes were greater than these of non-transformed root. Conclusion The regeneration plantlets
from C. roseus transgenic hairy roots could significantly promote the antitumor alkaloid accumulation.
Key words: Catharanthus roseus L.; alkaloid; hairy roots; regenerated plants; HPLC

癌症已成为严重威胁人类健康且难以治愈的世
界性重大疾病。据世界卫生组织统计，全世界每年
新增癌症患者约有 1 000 万。其中，因得不到有效
治疗而死亡的人数达 600 万。这在很大程度上是由

收稿日期：2011-09-06
基金项目：中国博士后科学基金项目（20060390733）；宁波市农业创新创业资金项目（2010C91050）；宁波市农业科技攻关项目（2010C10051，
2010C10057）；宁波大学学科项目（XKL121，XKL11D2099）
作者简介：龚一富（1973—），男，重庆开县人，宁波大学生物系主任，副教授，硕士生导师，从事药用植物分子生物学、次生代谢调控和代
谢工程方面的教学和科研工作，在该领域发表学术论文 50 余篇，其中 SCI 收录论文 27 篇。
Tel: (0574)87600878 E-mail: gongyifu@163.com
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于特效抗癌药物种类极少，且产量很低，价格昂贵，
不能满足广大患者的需求所造成的。
长春花 Catharanthus roseus L. 是夹竹桃科一
年生草本植物[1]，可产生 100 多种具有很高药用
价 值 的 萜 类 吲 哚 生 物 碱 （ terpenoid indole
alkaloids，TIAs）。其中，长春碱（vinblastine）和
长春新碱（vincristine）是重要的抗肿瘤药用成分。
此外，还有抗过敏药用成分利血平（reserpine）和
降压药用成分阿玛碱（ajmalicine）等。因此，长春
花被认为是一种具有很高开发应用价值的药用植物
[2]。然而，由于这些药物在长春花中的量微少，所
以从天然植物中提取 TIAs 不能满足市场需求，导
致长春花药用成分的供需矛盾严重，使其价格昂贵，
而用化学合成和半合成因成本高而不具有商业价
值。目前，我国市场上的长春花生物碱纯品主要依
靠进口，生物技术的发展为定向提高长春花中有效
药用成分量及实现长春花生物碱的规模化生产提供
了新的有效手段，从而引起国内外的广泛重视。
长春花作为 TIAs 生物合成研究的模式植物，
其 TIAs 生物合成途径中多个重要限速酶基因以及
转录调控因子已从长春花中成功克隆并进行了功能
鉴定，使得用基因工程手段改良长春花以提高 TIAs
量成为可能[3]。将 TIAs 生物合成途径上的关键酶基
因 g10h 导入长春花毛状根，使 TIAs 量比对照提高
了 3 倍[4]。将全局性转录调控因子 orca3[5-6]和 TIAs
生物合成关键酶基因 g10h 共转化长春花毛状根，使
TIAs 量比对照提高了 27 倍，这是目前国内外获得
的 TIAs 及长春碱量最高的长春花毛状根[7]。但是，
毛状根在离体培养生产抗癌生物碱的过程中易出现
老化现象，且用生物反应器繁育毛状根的生产成本
高，因此，不能通过毛状根的大规模培养来生产生
物碱。传统的长春花生物碱生产是从天然长春花植
株的叶片中提取的，因此获得生物碱高产量的长春
花植株或种子将为实现生物碱商业化生产提供优良
药源。采用组织培养的方法，从生物碱高产的转基
因长春花毛状根再生出完整植株，将获得生物碱高
产的长春花新品系，从而实现高产生物碱长春花转
基因的规模化种植，无疑是使长春花生物技术走向
产业化，解决 TIAs 药源匮乏的有效途径。
因此，本研究针对抗癌药用模式植物长春花在
医药领域应用上的潜力，以可高产生物碱的转基因
长春花毛状根为研究对象，通过研究外源植物生长
调节剂对毛状根的愈伤组织诱导、不定芽分化、试
管苗生根和再生植株移栽的影响及条件优化，建立
长春花转基因毛状根植株再生体系。通过对转基因
植株生物碱量的测定以及优良株系的筛选，为转基
因长春花优良品系的快速繁殖和规模化栽培提供理
论和技术基础，同时也为利用转基因植物生产生物
碱提供一条新的途径。
1 材料与方法
1.1 材料
长春花种子从荷兰 BD-Vereniging 公司购买。发
根农杆菌菌株 C58C1＋pCAMBIA1304+＋orca3＋
g10h 由复旦-交大-诺丁汉植物生物技术研发中心保
存。采用发根农杆菌菌株遗传转化长春花无菌苗，
获得经 PCR 鉴定的长春花转基因毛状根，HPLC 检
测结果表明共转 orca3和 g10h基因长春花毛状根生
物碱量比非转基因长春花对照提高了 27 倍[6]，转基
因长春花毛状根无性系 OG28 和 OG30 由复旦-交
大-诺丁汉植物生物技术研发中心提供。
Waters Alliance 2695 高效液相色谱仪，Waters
2996 PDA紫外检测器，德国Corbett公司Rotor Gene
2000 荧光定量 PCR 仪，Hybaid 梯度 PCR 仪。
长春碱、长春新碱和阿吗碱对照品均购自
Sigma 公司，质量分数为 99.9%。甲醇、乙腈为色
谱纯，其余试剂为分析纯。
1.2 方法
1.2.1 愈伤组织的诱导 取长春花毛状根系 OG28
和 OG30，用解剖刀分别切取外植体 1～2 cm，接种
于长春花愈伤组织诱导培养基（MS＋6-BA 2.0
mg/L＋NAA 0.3 mg/L，3%蔗糖，0.7%琼脂，pH 调
至 5.8）中，光照强度 1 600～12 000 lx，16 h/d，温
度为 25 ℃条件下培养。20 d 后统计诱导率，并记
录愈伤组织的颜色、质地及生长状况。
1.2.2 不定芽的分化 将长春花愈伤组织转接到不
定芽分化培养基（MS＋6-BA 2.0 mg/L＋NAA 0.3
mg/L、3%蔗糖、0.7%琼脂、pH 调至 5.8）。光照强
度 1 600～12 000 lx，16 h/d，温度为 25 ℃条件下
培养。观察长春花愈伤组织上不定芽的分化情况。
1.2.3 不定根的诱导 切取 2～3 cm 的不定芽，接
种到生根培养基（1/2 MS＋NAA 0.3 mg/L、2%蔗糖，
0.7%琼脂，pH 5.8）上。光照强度 1 600～12 000 lx，
16 h/d，温度为 25 ℃条件下培养，观察不定芽的生
根情况。
1.2.4 炼苗移栽 由于传统的炼苗方法存在移栽成
活率低、根部易腐烂等问题，本研究对炼苗方法进
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行了改进。炼苗前，将培养瓶瓶盖稍稍打开，在光
照培养箱中培养炼苗；3～4 d 后，将培养瓶瓶盖彻
底打开，并加入适量蒸馏水，以恰能浸没根部为宜，
放在光照培养箱中培养；在光照培养箱中放置 10 d，
用镊子将植株从培养瓶中取出，用流水将根系上的
培养基冲洗干净，放入盛有蒸馏水的试管中，置光
照培养箱中继续炼苗。蒸馏水以浸没根为宜，注意
隔天换水，一经发现根部长霉应及时用蒸馏水冲洗，
观察根部变化并做好记录，统计成活率。
将炼苗成活的植株移栽到由泥土和珍珠岩混
合的花盆中。将种有植株的花盆继续放于光照培养
箱中培养，并注意给植株适量浇水；大约在光照培
养箱中培养 1 周后，给移栽的长春花适度的自然光
照，第 1 天光照 1 h，以后每天自然光照的时间适
当延长；约 10 d 后，将移栽的长春花移出培养箱
而放于自然环境下生长，观察植株生长情况并统计
成活率。
1.2.5 长春花再生植株的 PCR 检测 以 SDS
法小量提取长春花再生植株叶片基因组 DNA。
根据 Furner 等 [8]所述的 rolB、rolC 基因的 DNA
序列，分别设计并合成扩增诱发并维持毛状根
形态的 rolB 和 rolC 基因的引物 frolb、rrolb 和
frolc、 rrolc。根据目的基因和载体序列设计引
物同时对 T-DNA 区的目的基因进行检测。用于
转基因长春花毛状根的检测所使用的引物及其
序列见表 1。
表 1 长春花再生植株 PCR 引物
Table 1 Primers for PCR analysis on C. roseus regenerated plants
目的基因 引物名称 引物序列 5’→3’ 退火温度 / ℃ 扩增片段长度 / bp
frolb 5-GCTCTTGCAGTGCTAGATTT-3 rolB
rrolb 5-GAAGGTGCAAGCTACCTCTC-3
55 423
frolc 5-CTCCTGACATCAAACTCGTC-3 rolC
rrolc 5-TGCTTCGAGTTATGGGTACA-3
55 622
forca3 5-ATGTCCGAAGAA ATCATTTCCG TCTC-3 orca3
rorca3 5-TT AATATCGTCT CTTCTTCCTTCCTCC-3
58 612
fg10h 5-ATGGATTACCTTACCATAATATTAAC-3 g10h
rg10h 5-TTAAAGGGTGCTTGGTACAG-3
55 1 498

以长春花毛状根再生植株和未转化对照植株
DNA 为模板进行 rolB、rolC 基因和目的基因的 PCR
扩增检测，以携带目的基因的相应工程菌株为阳性
对照，未转基因长春花对照根 DNA 为阴性对照。
PCR 扩增反应采用 25 μL 反应体系：2.5 μL
10×Ex-PCR 缓冲液，0.5 μL dNTPs，0.5 μL 上游引
物，0.5 μL 下游引物，1 μL DNA，0.5 μL Ex-Taqase，
19.5 μL dd H2O。PCR 反应条件为：94 ℃预变性 3
min，34 个扩增循环（94 ℃变性 50 s，55 ℃退火
50 s，72 ℃延伸 100 s），72 ℃继续延伸 8 min。反
应完成后用 1%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.6 再生植株叶片生物碱的测定 用 HPLC 法对
转基因长春花再生植株叶片进行长春碱、长春新碱
和阿吗碱的测定[7]。收集再生转基因长春花叶片，
用蒸馏水洗净叶片，用滤纸吸干表面水分，称取鲜
质量，60 ℃，48 h 烘干至恒质量，称其干质量。将
叶片放入研钵中，加入少量石英砂，研磨，加入 95%
乙醇适量（1∶5），50 ℃超声波提取 30 min，冷却
至室温，对提取液 12 000 r/min 离心 10 min，吸取
上清，12 000 r/min 再离心 10 min，吸取上清，备用。
精密称取长春碱、长春新碱和阿吗碱对照品
（Sigma 公司，质量分数 99.9%）10.0、5.0、10.0 mg，
用 1 mL 甲醇完全溶解，分别得到 10 mg/mL 长春
碱、5 mg/mL 长春新碱和 10 mg/mL 阿吗碱对照品
溶液，作为对照品贮备液，−20 ℃保存备用。
色谱条件： C18 反相硅胶柱（ Symmetry
ShieldTM C18，250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相
为乙腈-磷酸水溶液（25︰75），检测波长 220 nm，
柱温 30 ℃，体积流量 1.0 mL/min，进样量 10 μL，
理论塔板数按长春碱、长春新碱和阿吗碱峰计算
不低于 2 000。
分别精密吸取对照品溶液和供试样品溶液各
10 μL，注入高效液相色谱仪，记录各组分峰面积，
以各组峰面积为纵坐标（Y），长春碱、长春新碱和
阿吗碱的量为横坐标（X），得到回归方程分别 Y1＝
586 912.3 X1－1 287.4，r1＝0.999 93；Y2＝308 665.5
X2－1526.5，r2＝0.999 94；Y3＝136 029.4 X3－1 553.2，
r3＝0.999 96，计算即得样品 TIAs 量。
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1.2.7 再生植株基因表达分析 选取转基因长春花
再生植株不同株系和非转基因植株叶片，采用
Trizol 法提取 RNA 并反转录成 cDNA。采用实时荧
光定量 PCR 方法分析转基因植株和非转基因植株
g10h 和 orca3 基因表达变化。根据长春花 g10h
和 orca3 基因序列分别设计特异性引物 fcrg10h、
rcrg10h、fcrorca3 和 rcrorca3（表 2）。看家基因选
用 18S rRNA 基因。荧光定量 PCR 反应条件为：热
启动和变性 94 ℃、15 min，50 个循环（94 ℃变性
15 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s 并检测荧光，
80 ℃、20 s 并检测荧光）。对 PCR 产物进行溶解曲
线分析，样品中目的基因表达量以 18S rRNA 基因
表达量进行校正，并计算样品对非转化植株的相对
表达量。
表 2 长春花植株荧光定量 PCR 检测所用的引物
Table 2 Primers for RT-QPCR analysis on C. roseus plantlets
目的基因 引物 引物序列 5’→3’ 退火温度 / ℃ 扩增片段长度/ bp
f18s 5-GTGACAATGGAACTGGAATGG-3 18S rRNA
r18s 5-AGACGGAGGATAGCGTGAGG-3
55 108
forca3 5-ATGTCCGAAGAA ATCATTTCCG TCTC-3 orca3
rorca3 5-TT AATATCGTCT CTTCTTCCTTCCTCC-3
58 612
fg10h 5-ATGGATTACCTTACCATAATATTAAC-3 g10h
rg10h 5-TTAAAGGGTGCTTGGTACAG-3
55 207

2 结果与分析
2.1 愈伤组织的诱导
将 OG28 和 OG30 的毛状根接种于诱导长春花愈
伤组织的培养基 MS＋6-BA 2.0 mg/L＋NAA 0.3 mg/L
中，7 d 左右，外植体均在伤口边缘出现白色小颗粒
状突起（图 1-A）。30 d 后从毛状根诱导出淡黄色、表
面鲜亮、质地居中、不均匀的疏松愈伤组织块（图
1-B），长春花毛状根愈伤组织诱导率可达 96.7%。
2.2 不定芽的分化
将长春花愈伤组织转接到生芽培养基中，培养
约 30 d 后，愈伤组织表面出现多个浅绿色小体（图
1-C），其诱导率为 78.6%。继续培养 20 d 后，浅绿
色小体渐渐长大出现绿色芽点，最终形成不定芽的
分化。再经过 20 d 的培养，浅绿色芽点可生长分化
成约 2 cm 左右的不定芽（图 1-D）。
2.3 不定根的诱导
切下诱导的不定芽，转接到生根诱导培养基
（1/2 MS＋NAA 0.3 mg/L）中，培养 15 d，不定芽
基部开始分化出根毛及其分支（图 1-E），根多而粗
壮，多分支，具有典型毛状根的特性。长春花不定
根的诱导率可达 100%。
2.4 炼苗和移栽
用镊子将再生植株从培养瓶中取出，用流水将
根系上的培养基冲洗干净，再放入盛有蒸馏水的试

A-长春花转基因毛状根 B-转基因长春花毛状根愈伤组织的诱导 C-从长春花毛状根愈伤组织块上长出的浅绿色生长点 D-芽点分化成约
2 cm 高的芽体 E-转基因长春花毛状根不定芽的生根及完整植株再生 F-转基因长春花再生植株的移栽
A-transgenic hairy roots of C. roseus B-induction of callus from transgenic hairy roots of C. roseus C-green apical points induced from callus
of transgenic hairy roots D-2 cm buds differented from bud points E-plant regeneration and adventious roots induced from transgenic hairy
roots of C. roseus F-transplantation of rengeneration plantlets of transgenic C. roseus
图 1 长春花毛状根植株再生及其移栽
Fig. 1 Plant regeneration from transgenic hairy roots of C. roseus and plantlets transplantation

A B C
D E F
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管中，置于光照培养箱中继续培养。再生植株放于
蒸馏水中炼苗，可防止培养基中的营养物质导致细
菌或真菌繁殖生长而使试管苗污染死亡的发生，而
对长春花的生长无大的影响，因此，改进的炼苗方
法可大大提高再生植株的移栽成活率（83.33%）（图
1-F）。分析移栽过程中长春花再生植株的死因，原
因主要有两个。其一，如果是已经被感染的根系，
当植株被直接移栽到花盆中后，虽然经过清洗，但
它的根系上或多或少还带有细菌或真菌，当生长着
的细菌或真菌遇到土壤时，便有了一定的营养以及
环境让其生长繁殖，最终导致植株的根系出现问题，
不能充分吸收营养，而使植株死亡。其二，即使是
完全健康的根系，但由于清洗不能彻底除去吸附在
根系上的培养基，而所移栽的土壤并未经过消毒，
里面肯定含有大量的细菌和真菌，一旦细菌和真菌
接触到了植物根系上的培养基，培养基中的营养物
质就导致了细菌和真菌的大量繁殖与生长。
2.5 长春花再生植株的 PCR 检测
再生的长春花完整植株由于是从转基因长春花
毛状根分化而来的，因此，长春花再生植株应该具
有毛状根所特有的基因和目的基因。由于 Ri 质粒的
T-DNA 上带有 rolB、rolC 基因，且再生的完整植株
不定根具有毛状根的显著特征，因此本实验检测了
长春花毛状根再生植株中 rolB 和 rolC 基因的整合
情况。以 SDS 法小量提取的长春花再生植株叶片基
因组 DNA 为模板，利用 rolB 和 rolC 基因的 PCR
特异引物，能分别扩增出 423 bp 和 622 bp 的特异
DNA 片段。而以非转化长春花普通根总 DNA 为模
板时，没有扩增出任何片段（图 2）。用目的基因
orca3和 g10h基因的PCR引物扩增长春花毛状根再
生植株 DNA，能分别扩增出与预期结果一致的 612
bp 和 1 498 bp 的特异目的片段。这表明转基因长春
花毛状根再生植株基因组中整合有毛状根形成的
rolB、rolC 基因、T-DNA 区的 orca3 和 g10h 基因。
2.6 再生植株叶片中生物碱的测定
从再生的长春花毛状根再生植株中随机挑选长
势良好的长春花株系，剪取叶片经干燥后称质量，
用乙醇提取并用 HPLC 法测定其生物碱量，用各转
基因样品生物碱量与非转基因对照样品生物碱量的
比值表示生物碱相对量（图 3，4）。结果表明，转
基因再生植株中长春新碱、长春碱、阿吗碱和总生
物碱平均量分别为 1.09、4.11、0.007、5.21 mg/g，
分别是非转基因长春花植株叶片生物碱量的 4.0、

M-Marker PC-相应工程菌阳性对照 NC-非转基因长春花
1～7 分别代表不同的转基因再生植株株系
M-Marker PC-positive control, the correspondant engineered
bacteria were used as templates NC-negative control, native C.
roseus which was not genetically transformed 1—7 represent
independent transgenic C. roseus regeneration plantlet lines
图 2 长春花转基因毛状根再生植株中 rolB、rolC (A)、orca3
(B)、g10h (C) 基因的 PCR 检测
Fig. 2 PCR detection of rolB, rolC (A), orca3 (B), and g10h
(C) genes in regeneration plantlets from trangenic
hairy roots of C. rosues

1、2 分别代表长春新碱和长春碱
1 and 2 represent the vincristine and vinblastine samples
图 3 混合对照品 (A) 和长春花样品 (B) HPLC 色谱图
Fig. 3 HPLC chromatograms of mixed reference
substances (A) and C. rosues sample (B)
5.8、1.8、5.3 倍（非转基因长春花植株叶片生物碱
量分别为 0.274、0.710、0.004、0.988 mg/g）。其中，
转基因长春花株系 OG30-3 总长春新碱、长春碱量
最高，分别为 2.054、7.797 mg/g，分别比对照（0.274、
0.710 mg/g）提高 7 倍和 10 倍。
本研究表明，共转化转录调控因子 orca3 和关

A
C
B



0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
A
B
1
2
1 2
M PC NC 1 2 3 4 5 6 7
t / min
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图 4 转基因长春花毛状根再生植株生物碱测定
Fig. 4 Determination of alkaloids in regeneration plantlets
from transgenic hairy roots of C. rosues
键酶基因 g10h 可使转基因长春花再生植株抗癌生
物碱量显著提高，可能是因为 orca3 的全局调控和
g10h 基因打破类萜途径合成瓶颈的双重作用的结
果，使代谢流不断地向生物碱合成方向流动，从而
显著促进了生物碱的积累。
2.7 再生植株目的基因表达
采用荧光定量 PCR 技术对长春花转化植株和非
转化植株目的基因表达进行检测，结果表明（图 5），
转基因株系OG28和OG30再生植株中orca3和g10h
基因表达量显著高于非转基因植株。说明关键酶基
因超量表达将促进长春花生物碱的合成和积累。

图 5 长春花转基因植株和非转基因植株基因表达情况
Fig. 5 Expression of target genes in transgenic
and non-transgenic C. roseus plantlets
3 讨论
用野生型的发根农杆菌转化植物获得毛状根可
以提高次生代谢产物的量，迄今为止，用发根农杆
菌诱导形成的植株毛状根至少涉及到31科100余种
双子叶植株。长春花中因含有重要的抗癌生物碱已
引起人们极大的兴趣，目前，用野生型发根农杆菌
感染长春花已获得了生物碱量提高的长春花毛状
根，但生物碱量提高的幅度不大，不具有工厂化生
产价值[9]。通过基因工程手段将关键酶基因或转录
调控因子转入长春花毛状根中将提高长春花毛状根
生物碱的量[4,7,10]。本研究所使用的植物材料正是共
转化转录调控因子 orca3和关键酶基因 g10h的生物
碱高产的长春花毛状根无性系。虽然长春花毛状根
容易获得，但毛状根在培养过程中容易出现退化现
象，生长速度变慢，甚至有些毛状根出现愈伤化，
因此，不能采用生物反应器大规模培养长春花毛状
根。对生物碱高产的长春花毛状根进行组织培养研
究以获得长春花完整植株具有重要的意义。长春花
外植体容易诱导愈伤组织的产生，但离体培养分化
出不定芽十分困难，目前还未见长春花通过组织培
养获得不定芽或再生完整植株的报道。本研究首次
报道了由转基因毛状根再生完整植株，再生植株具
有矮化、不定根数目多等特点，与菘蓝、曼陀罗、
新疆雪莲等植物中得到的结果相似[11-13]。
通过测定长春花移栽植株中生物碱量，结果表
明，转基因长春花叶片的长春新碱量比普通非转化
长春花提高了 3 倍，长春碱的量提高了 4 倍之多。
目前长春花转基因毛状根再生完整植株的研究尚未
见到报道，而本实验不仅避免了毛状根在离体培养
生产抗癌生物碱的过程中易出现老化现象和用生物
反应器繁育毛状根的生产成本高的缺点，并使生物
碱的量在再生体系的植株的叶片中得到了极大幅度
的提高。本实验研究表明，长春花转基因毛状根再
生的完整植株可以用于大规模生产和提取长春花生
物碱并降低其生产成本。
参考文献
[1] 向蓓蓓, 朱晔荣, 王文娟, 等. 盐胁迫对长春花愈伤组
织生长及阿玛碱积累的影响 [J]. 中草药, 2011, 42(1):
167-170.
[2] 高 贤, 单 淇, 辛 宁, 等. 长春花化学成分和药理
作用研究进展 [J]. 现代药物与临床 , 2011, 26(4):
274-277.
[3] El-Sayed M, Verpoorte R. Catharanthus terpenoid indole
alkaloids: biosynthesis and regulation [J]. Phytochem Rev,
2007, 6: 277-305.
[4] Gong Y F, Liao Z H, Pi Y, et al. Engineering terpenoid
indole alkaloids biosynthetic pathway in Catharanthus
roseus hairy root cultures by overexpressing the geraniol
10-hydroxylase gene [J]. J Shanghai Jiaotong Univ, 2005,
E-10(S1): 8-13.
[5] van der Fits L, Memelink J. ORCA3, a jasmonate-
responsive transcriptional regulator of plant primary and
secondary metabolism [J]. Science, 2000, 289: 295-297.
[6] Memelink J, Gantet P. Transcription factors involved in
CK OG28-1 OG28-2 OG28-3 OG30-1 OG30-2 OG30-3
12
10
8
6
4
2
0
生
物
碱
相
对
量

转基因长春花株系
长春新碱
长春碱
阿吗碱

CK OG28 OG30
长春花株系
100
80
60
40
20
0
基
因
相
对
表
达
量
/
%
orca3
g10h
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 4 期 2012 年 4 月

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terpenoid indole alkaloid biosynthesis in Catharanthus
roseus [J]. Phytochem Rev, 2007, 6: 353-362.
[7] 龚一富. 长春花萜类吲哚生物碱代谢工程 [D]. 上海:
上海交通大学, 2005.
[8] Furner I J, Huffman G A, Amasino R M, et al. An
Agrobacterium transformation in the evolution of the
genus Nicotiana [J]. Nature, 1986, 319: 422-427.
[9] 周立刚, 王君健, 杨崇仁. 植物毛状根的培养及其化学
进展 [J]. 1997, 10(3): 87-95.
[10] Peebles C A M, Sander G W, Hughes E H, et al. The
expression of 1-deoxy-D-xylulosesynthase and geraniol-
10-hydroxylase or anthranilate synthase increase
sterpenoid indole alkaloid accumulation in Catharanthus
roseus hairy roots [J]. Metab Eng, 2011, 13: 234-240.
[11] 汪 洪, 王晓慧, 王艳红, 等. 四倍体菘蓝毛状根的诱
导及其植株再生 [J]. 作物杂志, 2008, 5: 31-35.
[12] 张继栋, 杨雪清, 乔爱民, 等. 木本曼陀罗毛状根植株
再生体系的建立 [J]. 热带亚热带植物学报 , 2008,
16(5): 480-485.
[13] 付春祥, 金治平, 杨 睿, 等. 新疆雪莲毛状根的诱导
及其植株再生体系的建立 [J]. 生物工程学报, 2004,
20(3): 366-371.


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