全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 14 期 2013 年 7 月

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木鳖子对羟基桂皮醛对黑素瘤 B16 细胞分化的影响及其机制
耿艺曼 1，赵连梅 1，朱秀丽 1，任风芝 2，韩丽娜 1，高海祥 3，单保恩 1*
1. 河北医科大学第四医院 科研中心，河北 石家庄 050011
2. 华北制药集团新药研究开发有限责任公司，河北 石家庄 050011
3. 河北省人民医院，河北 石家庄 050011
摘 要：目的 探讨木鳖子 Momrodica cochinchinensis 中单体化合物，尤其是对羟基桂皮醛诱导黑素瘤 B16 细胞分化的作用。
方法 以对羟基桂皮醛、松柏醛、对羟基苯甲醛、3-甲氧基对羟基苯甲醛和 ligballinol 处理 B16 细胞 48 h 后，磺酰罗丹明 B
（SRB）法检测细胞生长抑制率。以对羟基桂皮醛处理 B16 细胞 24、48、72 h 后，倒置相差显微镜和经瑞氏-吉姆萨染色法
观察细胞形态；比色法检测给药后 48 h B16 细胞中黑色素量和酪氨酸酶活性；RT-PCR 法检测酪氨酸酶基因表达。结果 5
个单体化合物对 B16 细胞生长均具有抑制作用，其中对羟基桂皮醛对细胞生长的抑制作用最为明显，且具有浓度和时间相
关性。对羟基桂皮醛处理 B16 细胞 48 h 后，经染色观察到细胞呈树突样生长，表现为典型的细胞分化形态特征，黑色素的
量显著增加，酪氨酸酶活性显著增强，上述作用与对照组相比差异显著（P＜0.05）。以对羟基桂皮醛处理 B16 细胞 6、12、
24 h 后，酪氨酸酶、酪氨酸相关蛋白-1 和酪氨酸相关蛋白-2 的基因表达明显上调（P＜0.01），且呈时间相关性。结论 对羟
基桂皮醛能够抑制黑素瘤 B16 细胞增殖，其机制与诱导 B16 细胞分化相关。
关键词：木鳖子；对羟基桂皮醛；黑素瘤 B16 细胞；细胞分化；机制
中图分类号：R282.710.5；R979.19 文献标志码：A 文章编号：0253 -2670(2013)14 - 1951 - 06
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2013.14.016
Effect of p-hydroxylcinnamaldehyde on differentiation of melanoma cells
and its mechanism
GENG Yi-man1, ZHAO Lian-mei1, ZHU Xiu-li1, REN Feng-zhi2, HAN Li-na1, GAO Hai-xiang3, SHAN Bao-en1
1. Research Center, the Fourth Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050011, China
2. Pharmaceutical Group of New Drug Research and Development Limited Liability Company, Shijiazhuang 050011, China
3. Hebei People’s Hospital, Shijiazhuang 050011, China
Abstract: Objective To explore the monomer compounds in the seeds of Momrodica cochinchinensis and to study the
differentiation of mouse melanoma B16 cells induced by p-hydroxylcinnamaldehyde (PHC). Methods After being treated by five
kinds of compounds [PHC, coniferylaldehyde, p-hydroxylbenzaldehyde (PHB), 3-O-methoxyaniline-p-hydroxylbenzaldehyde, and
ligballinol] for 48 h, the inhibitory rate of B16 cell growth was measured by sulforhadamine B (SRB); Morphological changes of B16
cells induced by PHC for 24, 48, and 72 h were observed by Giemsa staining and phase contrast microscope; Melanin content and the
activity of tyrosinase in B16 cells 48 h after the administration were assessed by colorimeter. The expression of tyrosinase mRNA was
detected by RT-PCR. Results All the five compounds had the inhibitory effect on the B16 cells. Among them, PHC showed the
strongest effect in the dose- and time-dependent manner; PHC could induce B16 cells dendritic growth 48 h after the treatment, and
the morphological changes were typically differentiated; PHC also increased the melanin production and the activity of tyrosinase.
There was a significant difference compared to the control group (P < 0.05). After treated by PHC for 6, 12, and 24 h, the expression
levels of tyrosinase mRNA, tyrosinase 1 mRNA, and tyrosinase 2 mRNA were significantly increased (P < 0.01) in a time-dependent
manner. Conclusion PHC could inhibit the proliferation of B16 cells and the mechanism is related to the differentiation of B16 cells.
Key words: Momrodica cochinchinensis seeds; p-hydroxylcinnamaldehyde; melanoma B16 cells; cell differentiation; mechanism

收稿日期：2012-09-17
基金项目：河北省卫生厅医学科学研究重要课题计划（20120120）
作者简介：耿艺曼（1985—），医学硕士，主要从事中草药抗肿瘤研究。Tel: 13930113908 E-mail: g.ym19851025@163.com
*通信作者 单保恩 E-mail: shanbaoen@163.com
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诱导恶性肿瘤细胞向正常或近正常的细胞方向
分化逆转，是治疗恶性肿瘤的一种新方法[1-2]。因而从
天然药物中寻找肿瘤细胞分化诱导剂是当前的研究
热点之一[3]。前期研究表明，木鳖子醇提物能抑制黑
素瘤 B16 细胞的增殖，诱导 B16 细胞分化[4]。对木鳖
子醇提物进一步提取、分离，得到 5 个单体化合物，
分别是对羟基桂皮醛（p-hydroxylcinnamaldehyde，
PHC）、松柏醛（coniferylaldehyde）、对羟基苯甲醛
（p-hydroxylbenzaldehyde，PHB）、3-甲氧基对羟基苯
甲醛（3-O-methoxyaniline-p-hydroxylbenzaldehyde）和
ligballinol[5]。本实验评价木鳖子中上述 5 个化合物对
小鼠黑素瘤 B16 细胞生长的抑制作用，并探讨对羟基
桂皮醛对 B16 细胞的分化诱导作用及其机制。
1 材料
1.1 药品与试剂
木鳖子购自北京同仁堂药店，经河北医科大学
药学院生药教研室鉴定为葫芦科植物木鳖
Momrodica cochinchinensis (Lour.) Spreng. 干燥成
熟种子正品。对羟基桂皮醛、松柏醛、对羟基苯甲
醛、3-甲氧基对羟基苯甲醛、ligballinol，质量分数
均＞95%，河北省石家庄市华北制药集团新药研究
开发有限责任公司提取；磺酰罗丹明 B（SRB）试
剂盒，美国 Sigma 公司；瑞氏-吉姆萨染液，Baso
公司；胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公
司；RPMI 1640 培养液、胰蛋白酶，美国 GIBCO
公司；经典细胞分化诱导剂福司克林，Santa Cruz
公司。qPCR 染料，Transgene 公司。二甲基亚砜
（DMSO），北京北化精细化学品公司。
1.2 细胞培养
小鼠黑素瘤B16细胞，购自中国科学院上海细胞库。
1.3 仪器
台式离心机，德国 Heraeus 公司；LH50A 型倒
置相差显微镜，日本 Olympus 公司；无菌滤器，日
本 Millipore 公司；JA5003 电子分析天平，上海精
科天平厂；全自动高压蒸汽消毒器，日本三洋公司；
SCR20B 型低温高速离心机，日本日立公司；HT2
型酶标仪，奥地利 Anthos 公司。
2 方法
2.1 细胞培养
B16 细胞用含 10%胎牛血清的 RPMI1640 培养
液（含青霉素 100 U/mL，链霉素 100 μg/mL），于
37 ℃、5% CO2 培养箱中培养，以 0.25%的胰蛋白
酶消化细胞传代，取对数生长期细胞用于实验。
2.2 SRB 法检测 B16 细胞生长
2.2.1 木鳖子 5 个单体化合物对细胞生长的影响
取对数生长期 B16 细胞，调整细胞密度为 1×
105/mL，加入 96 孔培养板中，每孔 90 μL，待细胞
贴壁良好后加入不同质量浓度的对羟基桂皮醛、松
柏醛、对羟基苯甲醛、3-甲氧基对羟基苯甲醛、
ligballinol 10 μL（使终质量浓度分别为 2、4、6、8
μg/mL），每一质量浓度 3 个复孔，以只加培养液作
为对照组，以只有培养液无细胞作为空白对照组，培
养 48 h，弃上清，磷酸盐缓冲液（PBS）洗 1 次，4 ℃
下用 10%三氯乙酸固定 1 h，蒸馏水冲洗 4～5 遍，室
温晾干，4 mg/mL SRB 染液 100 μL 染色 15 min，弃
染液，1%乙酸轻洗 4～5 遍，滴加 10 mmol Trisbase100
μL摇床上摇15 min，酶标仪检测490 nm处吸光度（A）
值，计算细胞生长抑制率（IR）。
IR = (A 对照－A 给药) / (A 对照－A 空白)
2.2.2 对羟基桂皮醛对细胞生长的影响 细胞加药
前处理同“2.2.1”项。待细胞贴壁良好后加入不同
质量浓度（使终质量浓度分别为 2、4、6、8 μg/mL）
对羟基桂皮醛 10 μL 或阳性对照药福司克林（终浓
度为 5 μmol/mL），以只加培养液作为对照组，以只
有培养液无细胞作为空白对照组，培养 72 h 后弃上
清，PBS 洗 1 次，用 10%三氯乙酸于 4 ℃ 固定 1 h，
蒸馏水冲洗 4～5 遍，室温晾干，4 mg/mL SRB 染
液 100 μL 染色 15 min，弃染液，1%乙酸轻洗 4～5
遍，滴加 10 mmol Trisbase 100 μL 于摇床上摇 15
min，酶标仪检测 490 nm 处 A 值，每一质量浓度设
立 3 个复孔。IR 计算同“2.2.1”项。
2.3 显微镜和瑞氏-吉姆萨染色法观察对羟基桂皮醛
对 B16 细胞形态的影响
细胞加药前处理同“2.2.1”项。待细胞贴壁良好
后，加入对羟基桂皮醛 10 μL，使终质量浓度为 6
μg/mL，以只加培养液作为对照组，分别培养 24、48、
72 h 后，倒置相差显微镜下（×200）观察细胞形态。
弃上清，PBS 洗 1 次，晾干，70%乙醇固定 20 min，
晾干，滴加瑞氏-吉姆萨染液染色 1 min，蒸馏水冲洗
2～3 遍，再加入瑞氏-吉姆萨染液（原液与蒸馏水比
例 1∶2）染液，静置 13～15 min，用清水冲洗干净后
立即吹干，普通光学显微镜下（×200）观察结果。
2.4 比色法检测对羟基桂皮醛对B16细胞黑色素的
量和酪氨酸酶活性
2.4.1 B16 细胞黑色素量的检测[6] 将对数生长期
B16 细胞制成单细胞悬液，以每孔 1×105/mL 接种
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于 6 孔培养板，每孔 1.8 mL。待细胞贴壁良好后，
加入不同质量浓度的对羟基桂皮醛（使终质量浓度
分别为 2、4、6 μg/mL）或阳性对照药福司克林（终
浓度为 5 μmol/mL），以只加培养液作为对照组。将
细胞在 37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养 48 h，
倾去培养液，用生理盐水洗 2 次，0.25%胰酶消化，
收集细胞，调整每组细胞密度为 5×105/mL，每个
质量浓度设 3 个平行管，每平行管 1 mL，1 000×g
离心 5 min，倾去上清液，细胞团溶于 1 mol/L NaOH
溶液（含 10% DMSO）200 μL 中，80 ℃水浴保温
2 h 后转移至 96 孔培养板内，测 475 nm 处 A 值。
2.4.2 B16 细胞酪氨酸酶活性检测[7-9] 细胞加药
前处理同“2.4.1”项。待细胞贴壁良好后加入不同
质量浓度对羟基桂皮醛（使终质量浓度为 2、4、6
μg/mL）或者阳性对照药福司克林（终浓度为 5
μmol/mL），以只加培养液作为对照组。细胞在 37
℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养 48 h，倾去培养
液，用生理盐水洗 2 次，0.25%胰酶消化，收集细
胞，调整每组细胞密度为 5×105/mL，设 3 个平行
管，每管 1 mL，1 000×g 离心 5 min，倾去上清液，
细胞团溶于 0.5%脱氧胆酸钠溶液 100 μL 中，充分
振荡使细胞溶解，0 ℃放置 15 min，试管 37 ℃水浴
保温 10 min 后加入 1%左旋多巴继续孵育 2 h，再转
移至 96 孔培养板内，测 475 nm 处 A 值。
2.5 RT-PCR 法检测对羟基桂皮醛对酪氨酸酶基
因表达的影响
取对数生长期 B16 细胞，加入质量浓度为 6
μg/mL 的对羟基桂皮醛，以只加培养液作为空白对
照组，每组 3 个复孔，于 37 ℃、5%CO2培养箱中
培养 6、12、24 h，用预冷的 PBS 洗 2 遍，用核酸
提取试剂盒提取总 RNA，用反转录试剂盒反转录为
cDNA；以反转录出的 cDNA 为模板，加入相对应
目的基因的上下游引物和 qPCR 染料，用 RT-PCR
仪进行检测。目的基因引物序列和片段长度见表 1。
反应条件：95 ℃预变性 5 min，95 ℃变性 15 s，57
℃退火 30 s，72℃延伸 25 s，40 个循环；95 ℃变
性 15 s，57 ℃退火 1 min，95 ℃延伸 30 s，终止反
应。以 2－ΔΔCt 方法进行半定量分析[9]。
表 1 目的基因引物序列及产物片段长度
Table 1 Primer sequences of target genes and length of product segaments
基因 引物序列 产物长度 / bp
正向引物：5’-GGAACACCTGAGGGACCACTATTAC-3’ 酪氨酸酶
反向引物：5’-GAGCGGTATGAAAGGAACCATGTA-3’
426
正向引物：5’-ATCAGGTTTGGGCTCAGTTTCC-3’ 酪氨酸酶相关蛋白-1
反向引物：5’-CGGCAAGTCCCACAGTTGTGT-3’
283
正向引物：5’-ATTGCCTGTCTCTCCAGAAGTTTG-3’
酪氨酸酶相关蛋白-2
反向引物：5’-CCCAGGATTCCAATGACCACT-3’
457
正向引物：5’-ACCTGACCTGCCGTCTAGAA-3’ GAPDH
反向引物：5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’
247

2.6 统计学处理
采用 SPSS13.0 统计软件进行统计学处理，多组
间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用 LSD
检验，数据用 ±x s 表示。
3 结果
3.1 对 B16 细胞生长的影响
3.1.1 木鳖子 5 个单体化合物对 B16 细胞生长的影
响 与对照组相比，化合物质量浓度为 2、4、6、8
μg/mL 且作用于 B16 细胞 48 h 后，细胞数明显减少
并呈质量浓度相关性，其中对羟基桂皮醛、3-甲氧
基对羟基苯甲醛在 8 μg/mL 时对 B16 细胞生长的抑
制率分别为（58.7±1.3）%、（50.8±3.9）%（图 1）。

图 1 木鳖子中 5 个单体化合物对 B16 细胞生长的影响
( 3=± n , sx )
Fig. 1 Effects of five monomer compounds in seeds
of M. cochinchinensis on growth of B16 cells
( 3=± n , sx )

60
50
40
30
20
10
0
IR
/
%

0 2 4 6 8
ρ / (μg·mL−1)
对羟基桂皮醛
松柏醛
对羟基苯甲醛
3-甲氧基对羟基苯甲醛
ligballinol
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因此选择对细胞生长抑制作用较强的对羟基桂皮
醛进行 B16 细胞分化等实验。
3.1.2 对羟基桂皮醛对 B16 细胞生长的影响 以对
羟基桂皮醛 2、4、6 μg/mL 及福司克林处理 B16
细胞 72 h 后，对 B16 细胞生长的抑制率分别为
（14.6±8.6）%、（66.8±1.4）%、（79.5±7.3）%、
（40.3±4.6）%，且呈质量浓度相关性。结果见图 2。


图 2 对羟基桂皮醛对 B16 细胞生长的影响 ( 3=± n , sx )
Fig. 2 Effect of PHC on growth of B16 cells
( 3=± n , sx )
3.2 对 B16 细胞形态的影响
以对羟基桂皮醛 6 μg/mL 处理 B16 细胞 24、
48、72 h 后，细胞体积增大、变成梭形，排列有序，
成纤维状生长，多数细胞出现树突状结构，为典型
的细胞分化形态。表明对羟基桂皮醛能够诱导黑素
瘤 B16 细胞分化，与前期研究结果相符[5]。结果见
图 3。
3.3 对 B16 细胞黑色素量的影响
对照组 B16 细胞黑色素 A 值为 0.081±0.010，对
羟基桂皮醛 2、4、6 μg/mL 组 B16 细胞黑色素 A 值分
别为 0.094±0.006、0.121±0.006、0.151±0.005（P＜
0.05），福司克林组为 0.124±0.005。由于正常黑素
细胞产生黑色素的能力强于黑素瘤细胞[10-12]，因此
该结果证实对羟基桂皮醛能够诱导黑素瘤细胞向正
常黑色素细胞方向分化，且 6 μg/mL 组的作用强于
福司克林。结果见图 4。
3.4 对 B16 细胞酪氨酸酶活性的影响
对照组 B16 细胞黑色素 A 值为 0.686±0.047，对
羟基桂皮醛 2、4、6 μg/mL 组 B16 细胞黑色素 A 值分
别为 1.212±0.014、1.353±0.047、1.406±0.063，与

图 3 对羟基桂皮醛给药后不同时间黑素瘤 B16 细胞形态观察
Fig. 3 Morphological changes of B16 cells treated with PHC for different time periods

与对照组比较：*P＜0.05；与福司克林组比较：▲P＜0.05，下同
*P < 0.05 vs control group; ▲P < 0.05 vs forskelin group, same as below
图 4 对羟基桂皮醛对 B16 细胞黑素量的影响 ( 3=± n , sx )
Fig. 4 Effect of PHC on melanin amount of B16 cells
( 3=± n , sx )
对照组相比差异显著（P＜0.05），福司克林组为
1.256±0.007，与对照组相比差异显著（P＜0.05）。
表明对羟基桂皮醛能够增强B16细胞酪氨酸酶活性，
且 6 μg/mL 组的作用强于福司克林。结果见图 5。
3.5 对 B16 细胞酪氨酸酶基因表达的影响
对照组B16细胞酪氨酸酶基因荧光时循环的平
均数（Ctmean）为 12.155；对羟基桂皮醛 6 μg/mL 处
理 B16 细胞 6、12、24 h 后，酪氨酸酶基因 Ctmean
值分别为 12.110、10.650、12.545，通过计算 power
值，3 组酪氨酸酶基因的表达水平分别是对照组的
1.055、1.906、3.233 倍。对羟基桂皮醛 6 μg/mL 处
理 B16 细胞 6、12、24 h 后，酪氨酸相关蛋白-1 基
因 Ctmean 值分别为 12.407、12.241、11.498，通过
2 4 6 福司克林
对羟基桂皮醛 / (μg·mL−1)
100
80
60
40
20
0
IR
/
%


对照 给药后 24 h 给药后 48 h 给药后 72 h
对照 2 4 6 福司克林
对羟基桂皮醛 / (μg·mL−1)
0.20
0.15
0.10
0.05
0
A
值
* *
*▲
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图 5 对羟基桂皮醛对 B16 细胞酪氨酸酶活性的影响
( 3=± n , sx )
Fig. 5 Effect of PHC on tyrosinase activity of B16 cells
( 3=± n , sx )
计算 power 值，3 组酪氨酸相关蛋白-1 基因的表达
水平分别是对照组的 1.22、1.478、2.688 倍。对羟
基桂皮醛 6 μg/mL 处理 B16 细胞 6、12、24 h 后，酪
氨酸相关蛋白-2 Ctmean 值分别为 12.763、12.565、
11.893，通过计算 power 值，3 组酪氨酸相关蛋白-2
基因的表达水平分别是对照组的 1.079、1.539、1.717
倍。结果见图 6。表明对羟基桂皮醛能够上调酪氨
酸酶、酪氨酸相关蛋白-1、酪氨酸相关蛋白-2 的基
因表达水平。
4 讨论
大量研究表明，在一些细胞分化诱导剂作用下，
肿瘤细胞可发生分化，有的出现类似于正常细胞的


图 6 对羟基桂皮醛对 B16 细胞酪氨酸酶基因表达的影响 ( 3=± n , sx )
Fig. 6 Effect of PHC on expression of tyrosinase mRNA ( 3=± n , sx )
表型，有的恢复了正常细胞的某些功能[13-15]，这对
“一旦成为癌细胞，永远是癌细胞”的观念提出挑战，
也为抗肿瘤药物研究开辟了一条新的途径。因此探
寻新的高效、低毒的细胞诱导分化剂，或以联合用
药方式提高细胞分化效应，对肿瘤的临床治疗具有
积极的现实意义。
木鳖子是传统中药，主要功效为消肿散结、解
毒、追风止痛，用于治疗痈肿、疔疮、无名肿毒等
症。在前期研究中发现，木鳖子醇提物可以诱导 B16
细胞分化[5]，但木鳖子中的对羟基桂皮醛是否对
B16 细胞具有分化诱导作用尚不得知。本实验结果
表明，对羟基桂皮醛对B16细胞生长具有抑制作用，
可以促进 B16 细胞向正常细胞转化；还可以使 B16
细胞黑色素的量增加，酪氨酸酶活性增强（酪氨酸
酶是合成黑色素的关键酶），且在较高质量浓度时的
作用强于福司克林；结果还显示，对羟基桂皮醛可
以上调酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白-1 及酪氨酸酶
相关蛋白-2 基因表达水平，说明对羟基桂皮醛不仅
对 B16 细胞形态，而且在细胞功能及基因水平方面
可以协同诱导 B16 细胞的分化。对羟基桂皮醛具有
开发为黑素瘤细胞分化诱导剂的潜力，但其诱导
B16 细胞分化的机制尚不清楚，有待进一步的研究。
参考文献
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melanogenesis stimulation activity of (−)-cubebin in
对照 2 4 6 福司克林
对羟基桂皮醛 / (μg·mL−1)
2.0
1.5
1.0
0.5
0
A
值

*
* *
▲
*

3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
2.0
1.0
1.0
0.5
0
酪
氨
酸
酶
基
因
相
对
表
达
量

酪氨
酸酶
相关
蛋白
-1
基因
相对
表达
量
酪氨
酸酶
相关
蛋白
-2
基因
相对
表达
量
对照 6 12 24
对羟基桂皮醛处理 / h
对照 6 12 24
对羟基桂皮醛处理 / h
对照 6 12 24
对羟基桂皮醛处理 / h
*
*
*
*
*
*
*
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