全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 3 期 2012 年 3 月

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• 药材与资源 •
千里光全长 cDNA 文库的构建及分析
平军娇，张 珍，蔡振锋，汤贤春，钱 刚*
遵义医学院 细胞生物学与遗传学教研室，贵州 遵义 563099
摘 要：目的 构建千里光全长 cDNA 文库，以期研究千里光的功能基因组学信息，为克隆药理学性状相关的功能基因提
供数据资源。方法 Trizol 法提取千里光叶片总 RNA，通过 SMART（switching mechanism at 5’ end of RNA transcript）构建
全长 cDNA 文库，随机挑取 600 个单克隆测序分析文库滴度、全长率及冗余率，得到的 EST 序列进行 Blast 分析（NR、NT、
Swiss-Prot、KEGG）及 COG 功能分类。结果 文库的库容为 4.3×106 cfu/mL，插入片段大小平均 1.7 kb，文库重组率 96.35%，
全长率 58.24%，冗余率 10.88%；获得 524 条全长 EST 序列，含有 467 条独立基因（unigenes），其中 5 条序列与千里光次生
代谢产物的合成、运输与代谢有关。结论 经检测，SMART 技术成功构建了千里光全长 cDNA 文库，该文库可用于千里光
功能基因组鉴定、新基因筛选及次生代谢产物生物合成的表达调控研究。
关键词：千里光；全长 cDNA 文库；SMART；EST；基因组学
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2012)03 - 0557 - 05
Construction of a full-length cDNA library for Senecio scandens
PING Jun-jiao, ZHANG Zhen, CAI Zhen-feng, TANG Xian-chun, QIAN Gang
Department of Cell Biology and Genetics, Zunyi Medical College, Zunyi 563099, China
Abstract: Objective In the present study, our information from Senecio scandens full-length cDNA clones will serve as a useful
resource for elucidating functional genes and will also aid a precise annotation of genomics in Compositae plants. Methods The total
RNA was extracted from S. scandens using Trizol method. SMART (switching mechanism at 5’ end of RNA transcript) was applied to
constructing the full-length cDNA library. Titer of the library, full-length ratio, and redundancy rate for 600 monoclone randomly
selected sequencing library were evaluated by PCR amplification. NCBI and COG database was used to compare those sequences.
Results Parameters of the the quality of cDNA library were as follows: the capacity of the library (4.3×106 cfu/mL), the average size
of the inserted fragment (1.7 kb), the recombination rate (96.35%), the full-length rate (58.24%), and the redundancy rate (10.88%).
EST sequences for 524 full-length were obtained in this study, involving 467 unigenes, among which five sequences associated with
synthesis, transport, and metabolism of S. scandens secondary metabolites. Conclusion SMART technology could be effectively
applied to constructing the full-length cDNA library of S. scandens. Our results indicate that the full-length cDNA library could be
further applied to regulation of expression on identification of functional genome, screening of novel genes, and biosynthesis of
metabolism genes in S. scandens.
Key words: Senecio scandens Buch.-Ham. ex D. Don; full-length cDNA library; SMART; EST; genomics

千里光 Senecio scandens Buch.-Ham. ex D. Don
为菊科（Compositae）千里光属多年生草本植物[1]，
叶片组织有清热解毒、杀虫、明目、凉血、生肌、
驱风除湿等功效[2]。其主要具有抗菌、抗钩端螺旋
体、抗滴虫及抗氧化等药理活性，对各种炎症性疾
病及细菌性感染具有一定疗效[3-5]，是一种临床疗效
显著、不良反应少的广谱抗菌中药[6]。
cDNA 文库的构建已成为当前分子生物学研究
和基因工程操作的基础以及研究功能基因组学的重
要手段，迄今，拟南芥[7]、水稻[8]、小麦[9]、北柴胡[10]
等重要模式植物的全长 cDNA 文库已成功构建并用
于后期蛋白质表达及功能分析。近年来，中药功能基

收稿日期：2011-11-20
基金项目：贵州省优秀科技教育人才省长基金项目（黔省专合字 2008-61 号）
作者简介：平军娇（1987—），女，河北邯郸人，在读硕士研究生，研究方向为药用植物分子遗传学。
Tel: (0852)8609692 Fax: (0852)8609535 E-mail: pingjunjiao@126.com
*通讯作者 钱 刚 Tel: (0852)8609692 E-mail: qiangang69@yahoo.com.cn
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 3 期 2012 年 3 月

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因的研究，特别是药用植物次生代谢产物的生物合成
基因调控研究已成为中药现代化研究的热点。
目前，何首乌、甘草、冬虫夏草、水母雪莲和
青蒿等中药的 cDNA 文库已经成功构建，其中水母
雪莲和青蒿为菊科中药，已有研究发现其次生代谢
产物种类丰富。目前对于菊科中药有效成分的生物
合成途径及基因调控的基础研究相对缺乏。千里光
是一种具有良好开发前景的抗菌菊科中药，但国内
外关于千里光的研究主要集中在化学成分、药理作
用、分析方法、毒理、临床应用等方面，对于千里
光功能基因组学方面的研究未见报道。本研究以千
里光为材料，采用文库构建试剂盒 Creator SMART
cDNA Library Constuction Kit 构建高质量的千里光
叶片全长 cDNA 文库并进行 EST 序列分析，为进一
步探讨千里光的分子遗传机制、功能基因组学、生
物合成途径及次生产物代谢调节机制提供基础。
1 材料
千里光 Senecio scandens Buch.-Ham. ex D. Don
系本研究组采自贵州省遵义地区野生种，由遵义医
学院细胞生物学与遗传学教研室钱刚副教授鉴定。
取千里光幼苗的新鲜叶片置于液氮中保存备用。
总 RNA 提取试剂 Trizol 购自宝生物工程（大连）
公司；文库构建试剂盒 Creator SMART cDNA Library
Constuction Kit及Advantage 2 PCR Kit购自Clonetech
公司；DH10B 感受态细胞购自 Invitrogen 公司。
2 方法
2.1 总 RNA 的提取及检测
将 0.1 g 千里光叶片组织用液氮研磨后加入 1
mL Trizol，静置 5 min 后离心，吸取上清，加氯仿
剧烈震荡 15 s，待充分乳化后离心，吸取上清加入
等体积异丙醇，充分混匀后静置 10 min，离心，在
试管底部可见白色沉淀，75%乙醇清洗 2 次，最后
用少量 DEPC 处理水溶解沉淀。采用分光光度计和
1%琼脂糖凝胶电泳检测其浓度、纯度和完整性。
2.2 cDNA 的合成
采用 Clonetech 的 Creator SMARTTM cDNA 合
成试剂盒合成一链和二链，引物 CDS /3Ⅲ primer 改
为 CDS-3M adapter（5’-AAGCAGTGGTATCAACG-
CAGAGTGGCCGAGGCGGCC（T）20VN-3’，N＝
A、C、G、T；V＝A、G、C）。一链 cDNA 合成体
系总体积为 10 μL，其中包括总 RNA 0.96 μg，寡聚
核苷酸（SMART Oligonucleotide）1 μL，CDS-3M
PCR 引物 1 μL，一链合成缓冲液（5 × First Strand
Buffer）2 μL，二硫苏糖醇（DTT）（20 mmol/L）1 μL，
dNTP Mix （ 10 mmol/L ） 1 μL 和 反 转 录 酶
PowerScriptTM Reverse Transcriptase 1 μL，混匀后 42
℃孵育 1 h，冰上终止第 1 链反应。
采用 LD-PCR 法以 cDNA 第 1 链为模板扩增获
得双链 cDNA，PCR 扩增总体积为 100 μL，其中包
括一链 cDNA 2 μL，去离子水 80 μL，PCR 缓冲液
（10×Advantage® 2 PCR 缓冲液）10 μL，50×dNTP
Mix 2 μL，PCR 引物 4 μL 和聚合酶（50×Advantage
2 Polymerase）2 μL。PCR 反应条件为：95 ℃、1 min；
95 ℃、7 s，66 ℃、20 s，72 ℃、4 min，19 个循环。
产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检测。
2.3 双链 cDNA 纯化及短链 cDNA 去除
采用 QIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN
Cat.No.28104）进行双链 cDNA纯化，终体积用80 μL
ddH2O 溶解。纯化的 cDNA 用 Sfi EnzymeⅠ 酶切（50
℃水浴，2 h），酶切产物采用 1%琼脂糖凝胶电泳检
测。酶切产物通过试剂盒 QIAquick PCR Purification
Kit 回收大片段 cDNA（1～3 kb），并检测。
2.4 cDNA 与载体的连接转化及菌落 PCR 鉴定
100 ng 的 cDNA 与 pDNR-LIB 质粒连接，连
接产物经 0.25 μmol/L Millipore 纯化膜上脱盐纯化
1 h，电击法转化到 50 μL 大肠杆菌 DH10B 中，涂
平板，37 ℃培养过夜，计算平板上的库容数及文库
滴度；从文库中随机挑取 30 个克隆进行菌落 PCR，
产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检测。
2.5 单克隆 EST 测序及分析
从平板上随机挑选600个单克隆接种于96孔板
上，采用 T7 引物从 cDNA 5’方向测序（华大基因科
技股份有限公司）。序列通过 Cross_match 软件、
Phrep 软件去除载体序列、核糖体及小于 100 bp 序
列后，聚类拼接，得到所测千里光 EST 的相应
Unigene 数据，采用 Getorf 软件分析其开放阅读框
并分析文库的全长率，冗余率。得到的 EST 序列
进行 Blast 分析（NR、NT、Swiss-Prot、KEGG）。
用 BLASTP 将 Unigene 数据与 COG（Cluster of
Orthologous Groups of Protein）数据库（http：//
www.ncbi.nlm.nih.gov/COG）进行比对分析，获得
千里光表达基因的功能注释及其 COG 功能分类。
3 结果
3.1 总 RNA 的分析
总 RNA 提取后，检测得出总 RNA 的质量浓度
为 321 ng/μL，A260/A280＝1.98，A260/A230＝2.09，表
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明总 RNA 纯度良好；1%琼脂糖凝胶电泳结果表明
总 RNA 完整性良好（图 1），可以用来建库。
3.2 cDNA 合成结果与分析
采用 LD-PCR 法扩增 cDNA 第一链以获得双链
cDNA，检测结果显示（图 2），双链 cDNA 的长度
在 250～5 000 bp 分布及含有中高丰度基因带，表明
mRNA 得到有效的反转录和扩增。

M-Marker 1-总 RNA
M-Marker 1-total RNA
图 1 总 RNA 电泳结果
Fig. 1 Electrophoresis of total RNA

M-plus Marker 1-双链 cDNA
M-plus Marker 1-double strand cDNA
图 2 双链 cDNA 电泳结果
Fig. 2 Electrophoresis of double strand cDNA
3.3 cDNA 文库及 PCR 鉴定结果分析
经过计算分析文库滴度为 1.3×106 cfu/mL，文
库的库容大于 4.3×106 cfu/mL。如图 3 所示，随机
选取 30 个克隆的插入片段在 1.0～3.0 kb，平均大小
约为 1.7 kb，满足全长 cDNA 文库构建要求。
3.4 单克隆 EST 测序结果及分析
从原始文库中随机挑选 600 个单克隆进行 5’端
EST 测序，结果显示，文库重组率高达 96.35%，去
除低质量的序列后得到 524 条高质量 ESTs 序列，
其平均长度为 1.7 kb。含有 467 条独立基因
（unigenes），其中包括 43 个重叠群（contigs）和 424
个单拷贝基因（singlets），独立基因片段长度及其
ORF 长度如图 4 所示，文库的冗余率为 10.88%，
全长率为 58.24%，独立基因的大小分布见表 1。NR、

M-Marker 1～30-单克隆 PCR 结果
M-Marker 1—30-results of monoclone PCR
图 3 全长 cDNA 文库插入片段大小鉴定
Fig. 3 Identification of inserted fragment length
in full-length cDNA library

图 4 独立基因序列长度 (A) 及其 ORF 长度 (B)
Fig. 4 Sequence length of unigene (A) and its ORF (B)
NT、KEGG、Swiss-Prot COG 数据库 ESTs Blast 比
对, EST 数目分别为 460、427、459、392、242，通
过计算得到 272 条全长序列。467 条千里光独立基
因在 COG 数据库中有 242 个独立基因可获得生物
学功能注释（图 5）。
4 讨论
明确中药材药用品质成为制约中药现代化进程



16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 M
3 000 bp
1 000 bp
3 000 bp
1 000 bp
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 M
<400 <650 <900<1150<1400<1650<1900<2150<2400<2650<2900<3150<3400
0
20
40
60
80
00
20


<400 <650 <900 <1150<1400<1650<1900<2150<2400<2650<2900<3150
0
20
40
60
80
00
20

<400 <900 <1 400 <1 900 <2 400 <2 900 <3 400
120
100
80
60
40
20
0
<650 <1 500 <1 650 <2 150 <2 650 <3 150
120
100
80
60
40
20
0
频
率
/
%

频
率
/
%

A
B
序列长度 / bp
5 000 bp
250 bp
M 1
28 S
18 S

5 S
M 1
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表 1 独立基因的数目及比例
Table 1 Number of ESTs in unigene
簇大小 / 个 独立基因数目 独立基因比例 / %
1 424 90.79
2 34 7.28
3 6 1.28
4～5 2 0.43
6～10 1 0.21
11～20 0 0.00
21～50 0 0.00
51～100 0 0.00
＞100 0 0.00

图 5 千里光表达基因的 COG 功能分类
Fig. 5 Functional classification of S. scandens
expression genes
的瓶颈之一，药用植物活性成分及其功能基因研究
成为我国药用生物资源可持续利用发展的一项最重
要的基础研究[11-12]。本研究得到的 cDNA 文库代表
着千里光正在表达的有功能的基因，得到的 ESTs
序列不含内含子序列和调控序列，与氨基酸序列具
有对应性，为深入了解菊科药用植物功能基因组序
列信息提供基础资料，也为分离千里光的次生代谢
基因、揭示药用品质的分子遗传机制奠定基础。
cDNA 文库种类很多，经典 cDNA 文库存在克隆片
段短等缺点，而全长 cDNA 文库能提供完整的
mRNA 信息[13]，且只需通过 1 次阳性筛选，即可获
得基因的全长序列，可最大程度地缩短获取全长基
因所花费的时间[14]。对于基因组庞大，近期内尚不
能进行全基因组测序的中药千里光来说更是进行功
能基因组研究的有效途径。本研究结果表明该文库
可用于基因鉴定、启动子分析和功能基因组研究，
为快速、高效获得完整的基因全序列信息并进行相
关功能的研究提供有效途径。
cDNA 文库的质量对于大规模 EST 序列测定至
关重要，评价全长 cDNA 文库质量主要有两方面：
即文库的代表性和插入序列的完整性，文库的代表
性是指 cDNA 文库中所含的 mRNA 种类的完整性，
即要有足够的克隆数使能够含有低丰度表达的
mRNA，可用文库滴度来衡量。一般来说，文库滴
度能达到 105 cfu/mL 以上即为有效文库[15]，过低则
文库含有的组织内表达基因的全面性和代表性就会
受到质疑，而且筛选到低丰度基因的概率也会小很
多。而 LD-PCR 法合成的二链 cDNA，相比于普通
的引物法增大了低丰度基因的表达率，因此本研究
采用 LD-PCR 法构建了千里光的 cDNA 文库，文库
的滴度为 1.3×106 cfu/mL，高于理论标准值，从中
筛选低丰度目的基因在理论上具有可行性。完整性
通常用文库的全长率和插入片段大小来衡量，
cDNA 文库的构建方法主要有 Oligo-capping 法[16]，
CAPture 法[17]，SMART 法[18]，Cap-Select 法[19]，
Vector-Capping 法[20-21]以及 Cap-jumping 法[22]等，通
常都是以 oligo（dT）为引物，利用 mRNA 3’端的
poly（A）尾巴，反转录合成 cDNA 的第一链。该
方法的缺点在于若 mRNA 较长或者具有复杂二级
结构，则转录得到的 mRNA 序列往往会存在 5’端的
缺失情况，造成完整性降低。本研究采用 Clontech
公司的 SMART 技术[23]能够克服这一不足，可避免
因 mRNA 在分离纯化时的多步骤所造成 mRNA 的
降解作用，可以有效保证 cDNA 的完整性，而且所
获得的 cDNA 全长比例也较高 [24]。相对于普通
cDNA 文库，全长 cDNA 文库的优点主要在于提高
全长 cDNA 的比例。本研究为了评价全长 cDNA 在
文库中所占的比例，随机挑取 600 个单克隆进行完
整性分析，通过序列比对与分析得到文库的全长率
为 58.24%，插入片段大小平均约为 1.7 kb，保证了
cDNA 片段的完整性，满足了全长基因筛选的要求。
尽管全基因组测序是获知功能基因组信息的有
效途径，但花费巨大，并需要辅以强有力的计算机
软件乃至国际间的合作。鉴于表达基因只占整个基
因组序列的 2%，因此，源于 mRNA 表达水平研究
是进行功能基因筛选快捷、经济、有效手段[25]。本
研究利用构建千里光全长 cDNA 文库，并通过基因
041083124165115712812072482892107331413537661702
组所占比例 / %
0.41 1.24 11.57 2.07 2.48 21.07 4.13 6.61 7.72
RNA 加工和修饰
染色质结构和动力学
细胞内物质转运、分泌和囊泡运输
复制、重组和修复
核苷酸的运输和代谢
次级代谢产物的合成、运输和代谢
翻译
防御机制
功能未知
细胞骨架
辅酶的转运和代谢
信号转导机制
细胞壁或细胞膜的合成
无机离子转运和代谢
氨基酸转运和代谢
翻译、核糖体结构和生物合成
脂质体转运和代谢
能量生产和转换
碳水化合物转运和代谢
翻译后修饰、蛋白质转运和分子伴侣
基因功能预测
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组数据库已知序列信息比较，获得了 524 条高质量
ESTs 序列，242 条序列与 GenBank 上公布的序列有
较高的同源性，通过 COG 功能注释分类发现有 31
条序列参与了翻译后修饰，蛋白质转移，分子伴侣
的功能，有 28 条序列参与了碳水化合物运输和代
谢，有 17 条序列参与了能量产生和转换。千里光的
药理学作用主要集中于千里光的次生代谢产物，本
课题组的结果表明，2.07%的序列参与了次生代谢
产物的合成、运输和代谢，这为研究千里光药理学
性状功能基因奠定了基础；而且，288 条未知功能
基因序列信息也为进一步探讨新的功能基因提供了
序列信息。
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