全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 3 期 2011 年 3 月 •550•
亚麻木酚素对肺癌 A549 细胞的抑制作用及其机制
李先伟，唐丽娟，杨解人*
皖南医学院 药理学教研室，安徽 芜湖 241001
摘 要：目的 观察亚麻木酚素（SDG）对肺癌 A549 细胞增殖、侵袭和凋亡的影响及机制。方法 在体外培养的肺癌 A549
细胞株中加入不同浓度的 SDG（5、10、20、40 μmol/L），MTT 观察细胞增殖情况；Transwell 小室评价细胞侵袭能力；Hochest
染色观察细胞凋亡情况；比色法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）活性；Real Time PCR、Western Blotting 检测
基质金属蛋白酶-2（MMP-2）mRNA 和蛋白表达。结果 SDG 呈时间-浓度依赖性抑制 A549 细胞的增殖（P＜0.05）。细胞
侵袭能力明显下降、凋亡比率和 Caspase-3 活性明显升高、MMP-2 mRNA 和蛋白的表达显著下降（P＜0.05）。结论 SDG
呈时间和剂量依赖性抑制 A549 细胞的增殖和侵袭，其机制可能与其促凋亡、抑制 MMP-2 的表达有关。
关键词：亚麻木酚素；肺癌 A549 细胞；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3；基质金属蛋白酶-2；侵袭能力
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2011)03 - 0550 - 05
Inhibition of secoisolariciresinol diglucoside on lung cancer cell line A549 and its
mechanism
LI Xian-wei, TANG Li-juan, YANG Jie-ren
Department of Pharmacology, Wannan Medical College, Wuhu 241001, China
Key words: secoisolariciresinol diglucoside (SDG); lung cancer cell line A549; Caspase-3; MMP-2; invasion ability
亚麻是中国重要的油料作物之一，亚麻籽除含
有丰富的油脂和蛋白质之外，还含有丰富的亚麻木
酚素（secoisolariciresinol diglucoside，SDG）。SDG
的结构与体内雌二醇结构类似，因而影响一些激素
相关性疾病，如 SDG 可通过抗雌激素作用发挥抑
制乳腺癌、前列腺癌的效应[1]。其抗肿瘤作用的机
制可能包括诱导癌细胞分化、抑制血管新生、抗氧
化作用、抑制酪氨酸激酶和 DNA 拓扑异构酶活性
等[2-3]。最新研究表明雌激素受体阻断剂他莫昔芬可
以抑制非小细胞肺癌（NSCLC）的生长[4]，而 SDG
也具有他莫昔芬样的抗雌激素作用，因此，推测
SDG 对 NSCLC 可能也具有一定的防治作用。本实
验采用肺癌 A549 肿瘤细胞株为研究对象，观察
SDG 对 A549 的抑制作用，进一步探讨 SDG 抗肿瘤
作用机制，为开发新型的抗肿瘤中药提供理论依据。
1 材料
SDG（质量分数 73.6%，芜湖天一绿宝科技有
限公司），肺癌细胞株 A549（广州市十环医药科技
有限公司），DMEM 培养基（北京索莱宝），胎牛血
清（杭州四季青公司），MTT（Amresco），Transwell
小室（Costar），基质胶（Becton Dickinson），Hochest
染色、Caspase-3 和 BCA 蛋白定量试剂盒（杭州碧
云天生物技术研究所），PrimeScriptTM RT reagent
Kit、Power SYBR Green PCR Master Mix 检测试剂
盒[宝生物工程(大连)有限公司]，MMP-2 抗体
(ab37150，Abcam)、HRP 抗兔(Santa Cruz)、
BeyoECL Plus 超敏 ECL 化学发光试剂盒（杭州碧
云天生物技术研究所），ELx— 880 型酶标仪
（BIO-TEK），TE2000-E 倒置荧光显微镜（Nikon），
荧光定量实时 PCR 仪（Applied Biosystem）。
2 方法
2.1 细胞培养
A549 细胞置于含 10%胎牛血清、100 U/mL 青
霉素、100 μg/mL 链霉素的 DMEM 培养液中，在
37 ℃、5%CO2 培养箱中传代培养。待细胞生长至
80%～90%时，用 0.25%胰蛋白酶消化，按 1︰2 传代。
收稿日期：2010-05-20
作者简介：李先伟（1979—），男，安徽芜湖人，讲师，博士研究生，研究方向为心血管药理与分子药理。
Tel: 13548986682 13866384544 E-mail: wnmclixianwei69@163.com
*通讯作者 杨解人 E-mail: wnmcyaoli@sina.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 3 期 2011 年 3 月 •551•
2.2 MTT 试验
取对数生长期细胞，用 10% FBS 的 DMEM 培
养液调整细胞数为 3×105～5×105/mL，加入 96 孔
培养板，每孔 0.2 mL，待细胞贴壁 70%～80%时，
弃去培养液，分别加入含不同浓度 SDG（5、10、
20、40 μmol/L）的培养液 0.2 mL，另设阴性对照孔
和溶媒对照孔（DMSO），每组设 8 个复孔。培养
24、36、48 h，每孔加入 MTT 10 μL，继续培养 4 h，
弃去培养液，加入 DMSO 150 μL/孔，置摇床上低
速振荡 10～15 min，在 492 nm 处测定吸光度（A）
值，计算抑制率。
抑制率＝1－实验孔 A 值/阴性对照孔 A 值
2.3 Transwell 肿瘤细胞侵袭试验
细胞侵袭试验在 Transwell 小室中（聚碳酸滤膜
孔径为 8 μm）进行。在小室滤膜的上表面铺以 10 μg
基质胶，放入 37 ℃培养箱孵育 4～5 h，当出现白色
层时，说明胶已凝固。取指数生长期的细胞，用
10%FBS 的 DMEM 培养液配成细胞密度为 3×
105～5×105/mL悬液，加入24孔培养板，每孔1 mL，
分别加入不同浓度的 SDG（5、10、20、40 μmol/L），
另设阴性对照孔，每组设 4 个复孔。37 ℃、5% CO2
培养箱中培养 48 h。消化细胞，1%FBS 的 DMEM
培养液配成细胞悬液（3×105～5×105/mL）。DMEM
培养液洗 Transwell 小室 1 次，上室加入 200 μL 细
胞悬液；下室中加入 600 μL 含 20%FBS 的 DMEM
培养液。37 ℃培养箱孵育 20 h。取出 Transwell 小
室用 PBS 洗 2 次，5%多聚甲醛 4 ℃固定 2 h。加入
0.1%结晶紫 500 μL，室温染色 30 min，PBS 洗 2 次，
用棉球擦去上表面细胞，显微镜下观察滤膜下表面
的细胞（200×）。随机选取 5 个视野计数细胞个数，
统计分析。以侵袭细胞的相对数目来表示肿瘤细胞
的侵袭能力。
2.4 Hochest 染色
取对数生长期细胞，用 10%FBS 的 DMEM 培
养液调整细胞数为 3×105～5×105/mL，加入 12 孔
培养板，每孔 1 mL，待细胞贴壁 70%～80%时，弃
去培养液，分别加入含不同浓度 SDG（5、10、20、
40 μmol/L）的培养液 1 mL，另设阴性对照孔。培
养 48 h 后，吸尽培养液，加入 0.5 mL 固定液，4 ℃
过夜。去固定液，PBS 洗两遍，每次 3 min。加入
0.5 mL Hoechst 33258 染色液染色 5 min。去染色液，
用 PBS 洗两遍，每次 3 min。荧光倒置显微镜下任
选 5 个视野观察计数并拍照。分别计数正常细胞数
（细胞膜完整，呈均匀的蓝色），凋亡细胞数（核染
亮蓝色，呈均匀的致密斑块或分叶状），镜下计数细
胞凋亡率。实验重复 3 次。
2.5 Caspase-3 活性检测
取指数生长期的 A549 细胞，用 10% FBS 的
DMEM 培养液配成细胞悬液（ 3 × 105 ～ 5 ×
105/mL），加入 12 孔培养板，每孔 1 mL，分别加入
不同浓度的 SDG（5、10、20、40 μmol/L），另设阴
性对照孔，每组设 2 个复孔。培养 48 h 后吸取细胞
培养液，备用。用胰酶消化细胞，并收集至备用的
细胞培养液中。1 000×g、4 ℃离心 5 min 收集细胞，
小心吸除上清，每个 EP 管加入 100 μL 细胞裂解液，
重悬沉淀，冰浴裂解 30 min。4 ℃、16 000×g 离心
10 min。将上清转移到冰浴预冷的 EP 管中。按试剂
盒步骤进行 Caspase-3 活性检测，酶标仪 405 nm 波
长读取 A 值，根据标准曲线计算产物浓度。另取少
量上清按 BCA 试剂盒方法测定蛋白浓度。实验重
复 3 次。
2.6 RT-PCR 检测细胞 MMP-2 mRNA 表达水平
取指数生长期的 A549 细胞，用 10% FBS 的
DMEM 培养液配成细胞悬液（ 3 × 105 ～ 5 ×
105/mL），加入 6 孔培养板，每孔 2 mL，分别加入
不同浓度的 SDG（5、10、20、40 μmol/L），另设阴
性对照孔。培养 48 h 后用 Trizol 试剂提取总 RNA
后，按照逆转录试剂盒操作步骤进行 RT 反应。所
得 cDNA 在实时荧光定量 PCR 仪（7300 Real Time
PCR System，Applied Biosystem）上进行反应。按
照说明，使用 Power SYBR Green PCR Master Mix
试剂盒，以 1 μL cDNA 为模板，β-actin 为内参照，
PCR 扩增基因片段。引物如下：β-actin 上游引物为
5-AGTGTGACGTGGACATCCGCA-3，下游引物为
5-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3，扩增产
物 243 bp；MMP-2 上游引物为 5-GGATCCGC
AAGTGGTCCGTGTGAAGTAT-3，下游引物为 5-A
AGCTTGCTGTACCCTTGGTCAGGGCAGAA-3 ，
扩增产物 547 bp。PCR 反应参数：95 ℃预变性 30 s，
95 ℃变性 5 s，60 ℃退火、延伸 31 s，40 个循环，
在延伸的过程中收集荧光信号。于每次扩增的同时
设置无 cDNA 的阴性对照。将 PCR 产物做熔解曲
线，以证实以上 PCR 反应产物特异性良好。用 7300
System SDS Software 相对定量分析数据，统计 ΔΔCt
值以比较各组 mRNA 的相对表达水平。
2.7 Western blotting 检测 MMP-2 蛋白表达
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 3 期 2011 年 3 月 •552•
取指数生长期的 A549 细胞，用 10% FBS 的
DMEM 培养液配成细胞悬液（ 3 × 105 ～ 5 ×
105/mL），加入 6 孔培养板，每孔 2 mL，分别加入
不同浓度的 SDG（5、10、20、40 μmol/L），另设阴
性对照孔。低温提取蛋白，BCA 法测定蛋白浓度。
每孔上样 50 μg 蛋白，12%SDS-PAGE 分离样品，
转膜，封闭，将膜与溶于封闭液中的一抗（1︰800），
4 ℃过夜。洗膜，将膜浸入以 1︰2 000 稀释的二抗
稀释液中，室温孵育 1 h。加入 ECL 试剂，曝光，
显影，定影，分析。
2.8 统计分析
结果用 sx ± 表示。用单因素方差分析进行统计
学处理，组间差异采用 Student-Newman-Keuls 多重
比较 t 检验。数据用 SPSS11.5 统计软件包统计处理。
3 结果
3.1 SDG 对肺癌 A549 细胞增殖的影响
SDG 呈明显的时间-浓度依赖性抑制肺癌细胞
的增殖。随着 SDG 作用时间延长，SDG 对 A549
细胞的抑制作用逐渐加强，24、36、48 h 之间相比
差异均显著（P＜0.05）；不同浓度 SDG 对 A549 细
胞抑制率较对照组均明显提高（P＜0.05），40
μmol/LSDG 作用 48 h 抑制率最高，结果见表 1。
表 1 SDG 对肺癌 A549 细胞增殖的影响 ( 8=± n , sx )
Table 1 Effect of SDG on proliferation of A549 cells ( 8=± n , sx )
抑制率/%
组别 C/(µmol·L−1)
24 h 36 h 48 h
对照 − 2.34±0.31 3.78±0.48 5.93±0.84
SDG 5 15.47±3.96▲ 20.62±4.53▲* 29.60±4.43▲*△
10 20.43±5.03▲＃ 26.29±5.58▲*＃ 34.49±5.01▲*△＃
20 28.16±4.46▲＃★ 35.94±6.33▲*＃★ 44.36±6.15▲*△＃★
40 45.06±5.91▲＃★◆ 57.62±7.87▲*＃★◆ 64.67±6.82▲*△＃★◆
与对照组比较：▲P＜0.05；与 24 h 比较：* P＜0.05；与 36 h 比较：△P＜0.05；与 5 µmol/L 组比较：＃P＜0.05
与 10 µmol/L 组比较：★P＜0.05；与 20 µmol/L 组比较：◆P＜0.05
▲P<0.05 vs control group; *P<0.05 vs 24 h group; △P<0.05 vs 36 h group; ＃P<0.05 vs 5 µmol/L group
★P<0.05 vs 10 µmol/L group; ◆P<0.05 vs 20 µmol/L group
3.2 SDG 对肺癌 A549 细胞侵袭能力的影响
基质胶能在聚碳酸滤膜表面形成类似天然基底
膜的结构，细胞侵袭穿过重建基质胶的能力反映该
细胞的侵袭能力。用 SDG 处理 A549 细胞 48 h 后，
随着浓度增加，细胞穿透基底膜的能力明显受到抑
制，侵袭至滤膜下表面的细胞数分别降低至对照组
的（79.6±7.4）%、（62.2±5.9）%、（50.2±4.6）%、
（39.8±2.9）%，表明 SDG 可明显降低肺癌 A549
细胞的侵袭能力，见图 1。
3.3 SDG 诱导肺癌 A549 细胞凋亡的形态学变化
对照组细胞呈正常的生长状态，可见细胞核为
圆形，染色均匀。凋亡细胞阳性染色定位于细胞核，
呈蓝紫色颗粒。与对照组比较，用 SDG 处理细胞
48 h 后，给药组细胞的结构形态发生明显的改变，
部分细胞呈典型的凋亡表现，细胞变小、核固缩或
边缘化或破碎，出现凋亡小体。细胞凋亡率均明显
升高，具有统计学意义（P＜0.05），表明 SDG 可促
进肺癌 A549 细胞的凋亡，见图 2 和 3。
3.4 SDG 对肺癌 A549 细胞 Caspase-3 活性的影响
用 SDG 处理细胞 48 h 后，随着 SDG 浓度的增
加，Caspase-3 活性显著增高。药物处理组与对照组
比较，Caspase-3 活性均明显升高，具有统计学意义
（P＜0.05），表明 SDG 可增强肺癌 A549 细胞的
Caspase-3 活性，见图 4。
对照组 SDG 5 µmol·L−1 SDG 10 µmol·L−1 SDG 20 µmol·L−1 SDG 40 µmol·L−1
图 1 SDG 对肺癌 A549 细胞侵袭能力的影响
Fig. 1 Effect of SDG in different concentration on invasion ability of A549 cells
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 3 期 2011 年 3 月 •553•
对照组 SDG 5 µmol·L−1 SDG 10 µmol·L−1 SDG 20 µmol·L−1 SDG 40 µmol·L−1
图 2 Hoechst 33258 荧光染色观察肺癌 A549 细胞凋亡的形态学变化
Fig. 2 Morphological change of A549 cell apoptosis observed by Hoechst 33258 staining
与对照组比较：*P＜0.05 **P＜0.01，下图同
*P<0.05 **P<0.01 vs control group, same as below
图 3 SDG 对肺癌 A549 细胞凋亡率的影响
Fig. 3 Effect of SDG in different concentration
on apoptosis rate of A549 cells
图 4 SDG 对肺癌 A549 细胞 Caspase-3 活性的影响
Fig. 4 Effect of SDG in different concentration
on Caspase-3 activity of A549 cells
3.5 SDG对肺癌A549细胞MMP-2 mRNA表达的
影响
与对照组比较，用 SDG 处理细胞 48 h 后，随
着 SDG 浓度的增加，MMP-2 mRNA 的表达显著降
低，具有统计学意义（P＜0.05、0.01），提示 SDG
能降低肺癌 A549 细胞 MMP-2 mRNA 表达。目的
基因 MMP-2 和内参基因 β-actin 的 PCR 产物通过熔
解曲线分析发现均只有一个峰，说明在该反应条件
下，各基因的扩增具有特异性，见图 5。
图 5 SDG 对肺癌 A549 细胞 MMP-2 mRNA 表达的影响
Fig. 5 Effect of SDG in different concentration on mRNA
expression of MMP-2 of A549 cell
3.6 SDG对肺癌A549细胞MMP-2蛋白表达的影响
用浓度为 5、10、20、40 μmol/L 的 SDG 处理
48 h 后，MMP-2 蛋白条带逐渐变细，表明 SDG 呈
剂量依赖性的抑制 MMP-2 蛋白的表达。图像灰度
分析结果显示，随着药物浓度的增加，MMP-2 蛋白
的表达显著降低，见图 6。
4 讨论
动物实验证明，大鼠哺乳期摄入 10％的亚麻籽
或相当量的 SDG，可促进子代正常乳腺的分化，因
而可潜在降低乳腺癌发生的风险[5]。在 MCF-7 细胞
（ER+）乳腺癌裸鼠移植模型的研究中也发现，摄入
10％亚麻籽可以抑制肿瘤的生长，同时加强他莫西
芬的抗肿瘤效应[6]。但在雌激素受体阴性的乳腺癌
移植瘤模型中研究发现， SDG 可抑制裸鼠
MDA-MB-23l 细胞（ER-）乳腺移植瘤的生长[7]，这
是因为 SDG 除了具有抗雌激素样作用外，还具有
抗氧化、抑制血管生成等活性。
本研究通过 MTT 法发现，SDG 能明显抑制肺
对照 5 10 20 40
SDG / (µmol·L−1)
M
M
P-
2/
β-
ac
tin
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
**
** **
*
C
as
pa
se
-3
活
性
/(U
·m
g−
1 )
15
10
5
0
对照 5 10 20 40
SDG / (µmol·L−1)
*
**
**
**
40
30
20
10
0
细
胞
凋
亡
率
/%
对照 5 10 20 40
SDG / (µmol·L−1)
*
**
**
**
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 3 期 2011 年 3 月 •554•
图 6 SDG 对肺癌 A549 细胞 MMP-2 蛋白表达的影响
Fig. 6 Effect of SDG in different concentration on protein expression of MMP-2 of A549 cells
癌 A549 细胞的生长，并且呈时间-浓度依赖性。随
着 SDG 作用时间延长，其对 A549 细胞的抑制作用
不断加强，48 h 组抑制作用最强；随着 SDG 浓度
增加，其对 A549 细胞抑制率亦明显增加。用 SDG
处理细胞 48 h 后，给药组细胞的结构形态发生明显
的改变，部分细胞呈典型的凋亡表现：细胞变小、
核固缩或边缘化或破碎，出现凋亡小体。酶标仪检
测发现随着 SDG 浓度的增加，Caspase-3 活性显著
增高。提示 SDG 能通过 Caspase 依赖性途径促进细
胞凋亡，抑制细胞的增殖，但详细的机制有待于进
一步研究。同时，SDG 可抑制 A549 细胞 MMP-2
mRNA 表达，使 A549 细胞穿过基质胶滤膜的能力
明显下降，表明 SDG 可明显降低肺癌 A549 细胞的
侵袭能力，但详细的机制也有待于进一步研究。本
实验研究证实 SDG 在体外对肺癌 A549 细胞有明显
的抑制的作用，其机制涉及诱导细胞凋亡、抑制肿
瘤细胞转移两个方面。
参考文献
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志, 2007, 3(28): 176-178.
MMP-2
β-actin
72 000
43 000 M
M
P-
2/
β-
ac
tin
40 20 10 5 对照
SDG / (µmol·L−1)
对照 5 10 20 40
SDG / (µmol·L−1)
1.5
1.0
0.5
0
**
**
**
*