全 文 ：• 2982 • 中华中医药杂志(原中国医药学报)2011年 12月第 26 卷第 12 期 CJTCMP , December 2011, Vol . 26, No. 12
·研究报告·
南方红豆杉水提物对人肺癌A549细胞增殖
抑制作用的研究
舒琦瑾1，李萍2，王彬彬1，朱国猛1
（1浙江中医药大学附属第一临床医学院肿瘤科，杭州 310006；2杭州师范大学附属医院肿瘤科，
杭州 310015）
摘要：目的：研究南方红豆杉水提物对人肺癌A549细胞增殖的抑制作用和机制。方法：采用MTT法检测南
方红豆杉水提物对A549细胞增殖的抑制作用；生长曲线法观察其抑制A549细胞的时间-效应曲线；流式细胞仪检
测其对A549细胞周期及凋亡的影响；倒置显微镜及电镜观察其对A549细胞形态的影响。结果：南方红豆杉水提物
对A549细胞的增殖有抑制作用；其抑制作用机制为使A549细胞周期出现明显的G0/G1期阻滞，诱导细胞凋亡。结
论：南方红豆杉水提物对人肺癌A549细胞的增殖有抑制作用。
关键词：南方红豆杉；抑制作用；人肺癌A549细胞；细胞增殖
基金资助：浙江省自然基金项目（No.Y2081051），浙江省中医药科技计划重点项目（No.2009ZA003）
Study on inhibitory action of proliferation of human lung carcinoma A549 cell with
aqueous extract of Taxus chinensis.var
SHU Qi-jin1, LI Ping2, WANG Bin-bin1, ZHU Guo-meng1
( 1Department of Oncology, the First Affi liated Hospital, Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine, Hangzhou 310006,
China; 2Department of Oncology, the Affi liated Hospital of Hangzhou Normal University, Hangzhou 310005, China )
Abstract: Objective: To study the inhibitory effect of aqueous extract of T.chinensis var on vitro cultured human lung
carcinoma A549 cell, and to explore its mechanism. Methods: The inhibitory effect of T.chinensis var on human lung carcinoma
A549 cells was tested by MTT method; time-effect relationship was observed by growth curve; effects on blockage of cell cycle
and apoptosis was inspected by fl ow cytometry; morphology of the A549 cells was observed by inversion microscope and electron
microscope. Results: The aqueous extract of T.chinensis var had inhibitory effect on the proliferation of A549 cells, and the
mechanism related to blocking the cycle of A549 cells at G0/G1 period and inducing apoptosis of tumor cells. Conclusion: The
aqueous extract of T.chinensis var had inhibitory effect on the proliferation of A549 cells.
Key words: Taxus chinensis. var; Inhibitory effect; Human lung carcinoma A549 cell; Cell proliferation
Fund assistance: Natural Science Foundation of Zhejiang Province (No.Y2081051), Science and Technology
Planning Key Project of Zhejiang Province (No.2009ZA003)
通讯作者：舒琦瑾，浙江省杭州市邮电路54号浙江中医药大学附属第一临床医学院肿瘤科，邮编：310006，电话：0571-87072196
传真：0571-86613586，E-mail：shuqjhz@yahoo.com.cn
红豆杉是红豆杉科红豆杉属植物总称，是世界上公认的濒
临灭绝的天然珍稀抗癌植物。《本草纲目》就记有红豆杉治疗
霍乱、伤寒、排毒等疗效，《现代中药大辞典》、《本草推陈》等
医药书中则有进一步记载。其性味苦、平，有小毒，归心经，功
效消肿散结，主治：肿瘤、肾病、风湿等。目前已经从红豆杉中
分离出400多种化合物，包括紫杉烷类化合物和少量的非紫杉
烷类化合物[1-6]。
水煎剂是中药应用的传统方式及临床应用的主要形式，红
豆杉水煎剂已在临床广泛应用，且安全有效。目前国内外尚未
见应用红豆杉水提物抑制肿瘤的研究报道。本课题通过对南
方红豆杉水提物的研究，验证其对人肺癌A549细胞的增殖抑
制作用，进一步阐明南方红豆杉水提物的抗肿瘤作用，为天然
药物南方红豆杉的开发应用提供理论和实验依据。
仪器和材料
Elx808型酶标仪（美国BioTek公司），FACS Calibur流式
细胞仪（美国BD 公司），BX 20型荧光 显微镜摄像机（日本
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OLYMPUS公司），ULTRACUT E超薄切片机（奥地利Reichert-
Jung公司），JEM-1230型透射电镜（日本JEOL公司）。
南方红豆杉：购自浙江省中医院中药房，宁波泰康红豆杉生
物工程有限公司生产，规格：8g/袋。人肺腺癌细胞株A549，购
自中国科学院上海细胞生物学研究所。Hylcone胎牛血清（美国
Thermo公司），F12-K培养液（美国GIBCO公司），MTT粉（美国
Sigma公司），Annexin V/PI apoptosis kit（美国Invitrogen公司），
DNA染色剂（美国AMRESCO公司）。
方法
1. 细胞培养 用体积分数为10％的胎牛血清F12-K培养
液，在37℃、体积分数为5％的CO2培养箱中培养，细胞呈贴壁
生长，实验时均取对数生长期细胞。
2. 药物制备 参考文献[7]方法，80g南方红豆杉3次煎煮
药液经真空抽滤器过滤，电磁炉上浓缩至约100mL，旋转蒸发
仪上浓缩成约40mL药液，入真空干燥箱干燥，按100%浓度计
算得率。取1g干燥水提物，加入10mL超纯水，溶解、离心，取
上清液，再经0.22μm微孔滤膜除菌，制成母液浓度100mg/mL，
置-20℃冰箱备用。
3. M T T 法 收 集 对 数 期细胞，调整细胞 悬液浓度约
5×10 4/mL，接种于96孔板，每孔加入100μL，培养箱中培养
至细胞单层铺满孔底，以F12-K培养液稀释药物至不同浓度，
每孔加入100μL，水提物浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、
3.0mg/mL，并设空白组和阳性对照组，每浓度设3个复孔。培养
24h后，倒置显微镜下观察。每孔加入20μL MTT溶液（5mg/mL，
即0.5%MTT），继续培养4h，2 000r/min离心96孔板，利用虹吸
原理弃去培养液。每孔加入150μL二甲基亚砜，置摇床上振荡
10min。在酶标仪490nm波长处测量各孔的吸光值（OD值）。按
下列公式计算细胞生长抑制率：细胞生长抑制率=（1-实验组
吸光度值/对照组吸光度值）×100%。用SPSS 13.0统计软件分
析处理，剂量和效应关系用药物浓度抑制软件（LOGIT法）版
本1.0.0求半数抑制率（IC50）。
4. 生长曲线法 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度约
2×104/mL，接种于96孔板，每孔加入100μL。培养箱中培养至
细胞单层铺满孔底，以F12-K培养液稀释药物至0.5、1.0、1.5、
2.0、2.5、3.0mg/mL，每孔加入100μL，各取4个复孔。培养24h、
48h、72h、96h、120h，倒置显微镜下观察。每孔加入20μL MTT
溶液，继续培养4h，2 000r/min离心96孔板利用虹吸原理弃去
培养液。每孔加入150μL二甲基亚砜，置摇床上振荡10min。在
酶标仪490nm波长处测量各孔的吸光值（OD值）。根据药物浓
度及各孔吸光值，绘制细胞生长曲线。
5. 流式细胞仪检测细胞周期及凋亡 取对数生长期A549
细胞用0.25%胰酶-EDTA消化，制成2×105/mL细胞悬液接种于
60mm无菌培养皿中，5×105个/皿。培养箱内培养24h贴壁后弃
上清，加入无血清F12-K培养液，饥饿同步化18h后，使细胞停
滞于G0期[8]。空白对照组加入10%胎牛血清的F12-K培养液，药
物组设置浓度分别为：2、2.5、3mg/mL，药物A组：2mg/mL，药
物B组：2.5mg/mL，药物C组：3.0mg/mL，另设阳性对照组（DDP
组）给予DDP 200μg/mL，培养24h后，收集上清液细胞，0.25%
胰酶-EDTA消化，1 000r/m离心10min，收集贴壁细胞，1640培
养液洗涤2次，1 000r/m离心10min，加入70%冷乙醇在4℃固定
12h，在检测细胞凋亡的试管中先后加入1×Buffer 100mL，AV
染液5μL，PI染液1μL，避光15min，再加入1×Buffer 400μL，上
机检测；在检测细胞周期的试管中加入1mL的DNA染色剂，避
光30min，上机检测。并用随机软件进行数据分析，用SPSS 13.0
统计软件分析处理。
6. 细胞凋亡形态学观察 在Olympus倒置显微镜下观察培
养瓶中的活细胞，并于电镜下行超微结构观察。细胞经2.5%戊
二醛和1%锇酸双固定，梯度乙醇和丙酮脱水，Epon812树脂包
埋，ULTRACUT E超薄切片机切片，行醋酸钠和柠檬酸铅双重
染色，在透射电镜下观察并拍照。
结果
1. MTT法药物敏感实验 200μg/mL浓度组DDP的抑制率
为70.46%，南方红豆杉水提物作用A549细胞24h后，对A549
细胞有明显的抑制作用，且随着药物浓度的增加，其抑制作
用逐步增强，呈明显的剂量-效应关系。半数抑制率（IC50）为
2.20mg/mL。
2. 南方红豆杉水提物对A549细胞作用的生长曲线的影
响 根据5d的MTT结果来绘制生长曲线，结果示：低浓度的
南方红豆杉水提物对A549细胞的抑制呈时间、剂量依赖性。
见图1。
3. 南方红豆杉水提物对人肺癌A549细胞周期及凋亡的
影响
3.1 南方红豆杉水提物对人肺癌A549细胞周期分布的影
响 实验结果显示：与空白对照组相比，经药物处理24h后的细
图1 不同浓度南方红豆杉水提物对A549细胞的生长曲线
吸
光
值
时间/d
mL
mL
mL
mL
mL
mL
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组别
空白对照组
DDP组
药物A组
药物B组
药物C组
G1（%）
51.42±0.02
72.58±4.96▲
61.78±5.78▲
64.11±3.21▲
75.21±2.08▲
S（%）
36.72±3.05
20.60±5.65
22.36±4.64
23.85±5.85
21.85±2.85
G2（%）
11.86±3.05
6.82±3.92
15.86±1.28
12.04±3.76
2.94±1.17
表1 南方红豆杉水提物对A549细胞周期的影响（x-±s，n=3）
注：与空白对照组比较，▲P<0.01。
图7 药物C组（×100）图6 药物B组（×100）
图4 空白对照组（×100 ） 图5 药物A组（×100）
表2 南方红豆杉水提物对A549细胞凋亡的影响
组别
空白对照组
DDP组
药物A组
药物B组
药物C组
UL（%）
（单核细胞）
0.01
0.09
0.07
0.20
1.17
UF（%）
（坏死+晚期凋亡）
8.87
6.51
29.30
26.10
34.87
LL（%）
（正常活细胞）
86.48
58.13
49.22
34.27
13.28
LF（%）
（早期凋亡）
4.63
35.28
21.41
39.43
50.68
胞呈现细胞周期阻滞，表现为G1期细胞增多，S期细胞相应减
少，使其发生G1期阻滞，且随着给药浓度的增加，作用增强，呈
现一定的剂量－效应关系。见表1，图2。
3.2 南方红豆杉水提物对人肺癌A549细胞凋亡的影响 实
验结果：与空白对照组相比，经药物处理24h后的细胞早期凋亡
的比例均有明显升高，且早期凋亡的比例呈现一定的剂量－效
应关系。见表2，图3。
4. 南方红豆杉水提物对人肺癌A549细胞形态的影响
4.1 倒置显微镜观察细胞形态变化 水提物2、2.5、3mg/mL
处理A549细胞24h后，与空白对照组相比，随着红豆杉水提物
剂量增加，A549细胞增殖受抑制，形态发生明显变化，细胞出
现皱缩、坏死，呈典型凋亡表现。见图4-图7。
图3 Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪分析南方红豆杉水提
物处理A549细胞凋亡
注：a.空白对照组；b.DDP组；c.药物A组；d.药物B组；e.药物C组。
d c
ba
e
4.2 电镜观察细胞形态变化 水提物2、2.5、3mg/mL处理
A549细胞24h后，与空白对照组相比，随着红豆杉水提物剂量
增加，A549细胞形态发生明显变化，出现细胞核固缩，细胞核
碎裂，凋亡小体形成等凋亡的典型形态学改变。见图8-图11。
图2 流式细胞仪分析南方红豆杉水提物处理A549细胞周期
注：a.空白对照组；b.DDP组；c.药物A组；d.药物B组；e.药物C组。

e

c
d
a b
Channels（FL2-A） Channels（FL2-A）
Channels（FL2-A）
Channels（FL2-A）Channels（FL2-A）
400
300
200
100
Nu
mb
er
600
500
400
300
200
100
Nu
mb
er
600
500
400
200
Nu
mb
er
500
400
300
200
100
Nu
mb
er
600
500
400
300
200
100
Nu
mb
er
• 2985 •中华中医药杂志(原中国医药学报)2011年 12月第 26 卷第 12 期 CJTCMP , December 2011, Vol . 26, No. 12
讨论
细胞周期分为四期：G1期（DNA合成前期）、S期（DNA合成
期）、G2期（DNA合成后期）、M期（有丝分裂期）。S期进行染色
体复制和M期将复制的染色体分配到两个子细胞中是细胞周期
的两个基本条件。细胞分裂的精确性及定时性是正常细胞生长
和分化所必须，肿瘤的发生和发展起源于细胞周期“start”位点
的失控，使大量G0期细胞无限制地通过G1/S和G2/M转换，从而
导致细胞的异常增殖。肿瘤细胞的增殖动力学特点表现为细胞
群体分布主要与DNA合成活跃的S期有关，细胞一旦进入此期，
如无特殊干扰，便能按细胞周期的顺序发展下去，直至重新回
到G1期。因此若在G1/S和G2/M期予以阻断，便能有效控制肿瘤
细胞周期，从而控制肿瘤增殖。
随着肿瘤分子生物学研究的深入，人们认识到肿瘤的发生
和发展不仅与肿瘤细胞的增殖、分化异常有关，而且同细胞凋
亡的调控失常有关。因此，设法诱导肿瘤细胞的凋亡已成为一
种新的治疗方向[9]。
本研究表明，南方红豆杉水提物具有一定的抑制人肺癌
A549细胞增殖的作用，并呈一定的剂量依赖性和时间依赖性。
南方红豆杉水提物能够阻止人肺癌A549细胞周期于G0/G1期，
诱导其凋亡，为该中药抗肿瘤作用机制之一。
鉴于几乎所有的癌基因、抑癌基因的生物学效应最终都归
结到细胞周期的机制上[10]，因此如何调控细胞周期以及特异性
地诱导肿瘤细胞凋亡已成为当前肿瘤研究的特点。至于南方红
豆杉水提物阻滞肿瘤细胞细胞周期，诱导肿瘤细胞凋亡的确切
作用机制，尚需进一步研究证实。
参 考 文 献
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4305
（收稿日期：2011年4月4日）
图8 空白对照组（醋酸钠、
柠檬酸铅染色×10 000）
图9 药物A组（醋酸钠、
柠檬酸铅染色×8 000）
图11 药物C组（醋酸钠、柠
檬酸铅染色×30 000）
图10 药物B组（醋酸钠、
柠檬酸铅染色×5 000）