全 文 ：中国药物应用与监测 ２００8年第 5卷第 5期
藤茶双氢杨梅树皮素诱导人肺癌 A549细胞凋亡及其机制研究
张玉萌 1，郑作文 2，郭成贤 2，伦玉宁 2（1 解放军总医院药品保障中心，北京，100853；2 广西中医学院药学院，南宁，530001）
摘要 目的：探讨藤茶双氢杨梅树皮素（ampelopsin, APS）抗人肺癌 A549细胞的作用。方法：以 MTT法和集落形成法观察 APS
对人肺癌 A549细胞的体外抑制作用；采用 RT-PCR技术测定 APS对人肺癌细胞株 A549抑瘤基因 p53表达的影响。结果：
APS能明显抑制体外培养的 A549细胞的生长，MTT法中 IC50为 9.8 μg·mL-1；细胞生长曲线法提示其对 A549细胞的生长也有
明显的抑制作用；集落形成试验中，当药物浓度为 14.84，9.90，6.60，4.40 μg·mL-1时，抑制率分别为 100%，91.6%，64.5%和23.4%；
当浓度为 25 μg·mL-1时，APS能显著增强 p53基因的表达水平。结论：APS对体外培养的人肺癌 A549细胞的生长有明显的抑
制作用，对抑癌基因 p53表达的影响是其抗肿瘤的作用机制之一。
关键词 APS；抗肿瘤；人肺癌 A549细胞；p53 基因
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1672 - 8157（2008）05 - 0016 - 03
Study on the effect and mechanism of ampelopsin-inducing apoptosis on human lung cancer A549 cell
ZHANG Yu-meng1, ZHENG Zuo-wen2, GUO Cheng-xian2, LUN Yu-ning2(1 Chinese PLA General Hospital, Beijing, 100853; 2 Guangxi
College of Traditional Chinese Medicine, Nanning, 530001)
ABSTRACT Objective: To investigate the anti-tumor effect of ampelopsin (APS) in vitro. Methods: The growth inhibition was
analyzed by MTT and colony forming experiment in the lung cancer A549. The effect of APS on the expression of p53 mRNA in the
human lung cancer cell line A549 was analyzed by RT-PCR. Results: Ampelopsin could obviously inhibit the growth of A549 cells
cultured in vitro, with IC50 = 9.8 μg·mL -1 in MTT assay. The inhibition ratio in colony forming experiments were 100%, 91.6%,
64.5% and 23.4%, respectively, when dosages were 14.84, 9.90, 6.60 and 4.40 μg·mL-1. APS can significantly improve the expres-
sion of p53 gene at 25 μg·mL -1. Conclusion: Ampelopsin can inhibit the growth of A549 in vitro remarkably, and the effect on
expression of p53 gene is one of its anti-tumor mechanisms.
KEY WORDS Ampelopsin; Anti-tumor; A549 cell; p53 gene
藤茶双氢杨梅树皮素（ampelopsin, APS）是藤茶总
黄酮中主要的单体化合物，广泛存在于藤茶、无刺根
等植物中，据报道在藤茶中含量较高[1]。据文献报道[2]，
APS对白血病细胞 HL-60、K562以及肝癌 Bel-7402细
胞的生长具有抑制作用；刘德育等的研究[3]也证实 APS
体外对人鼻咽癌 HK-1细胞和人乳腺癌 MCF-7细胞及
体内对小鼠移植性 B16黑色素瘤的生长均具有显著
的抑制作用。本文通过研究藤茶双氢杨梅树皮素对体
外培养的人肺癌 A549细胞的生长的影响及其作用机
制，为揭示其抗肿瘤作用提供科学依据。
1 材料
1.1 仪器
311二氧化碳培养箱（美国 Thermo Forma公司）；
DLF560型超净工作台（荷兰 clear Air Techniek bv公
司）；细胞培养瓶（加拿大 BIOFIL公司）；倒置显微镜
（德国 Leica BMIRB公司）；SUNRISE自动酶标仪（奥
地利 TECAN公司）；十万分之一电子天平（德国赛多
利斯）。
1.2 细胞系
人肺癌 A549细胞，购自中国医学科学院细胞库。
[基金项目] 广西科学基金资助项目（桂科基 0639052）
[作者简介] 张玉萌，女，药师，研究方向：抗肿瘤中药药理。
论 著
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中国药物应用与监测 ２００8年第 5卷第 5期
论 著
1.3 药品与试剂
藤茶双氢杨梅树皮素由广西中医学院中药化学教
研室从广西藤茶中提取而得，为粉状白色结晶，纯度
为 98.5%。新生牛血清（杭州四季青公司，批号 071102）；
四甲基二氮唑蓝（MTT，北京拜尔迪生物公司分装，
Amresco 0793）；二甲基亚砜（DMSO，博大泰克公司）；
0.25%胰蛋白酶（美国 Hyclone Lab公司）；注射用生理
盐水（徐州莱恩药业公司，批号 051122）。
2 方法
2.1 细胞培养
人肺癌 A549细胞置 37℃，5% CO2培养箱中培养
备用。
2.2 体外抑瘤实验[4]
将培养好的肿瘤细胞 A549瘤株悬浮于含 10%新
生牛血清的 RPMI 1640培养液中，制成单细胞悬液，
0.4%台盼蓝染液，显微镜下计数，活细胞数应大于
95%。将细胞悬液置于 96孔培养板培养，另设空白对
照孔，只加完全培养基，不加细胞。细胞接种后，在 37
℃，5% CO2培养箱预培养 24 h。将药物按实验要求稀
释至终浓度为100.00，75.00，50.00，33.33，22.22，14.84，
9.90，6.60 μg·mL-1。加药后细胞在同等条件的培养箱
中继续培养 72 h，然后每孔加入 MTT溶液，继续培养
4 h，吸去上清。每孔加入二甲基亚砜（DMSO），轻轻振
荡。用酶标仪于 1 h内在 550 nm波长处测 OD值（测
时需减去空白对照）。数据处理通常以 T/C值表示，T/
C% = 100 × OD值处理组/OD值对照组。通过回归计
算，求出 T/C = 50%的药液浓度，即 IC50值。
肿瘤细胞生长抑制率按下式计算：
肿瘤细胞生长抑制率 ＝（1 －实验组平均 A值/对照
组平均 A值）× 100%。
2.3 集落形成实验[5-6]
取对数生长期的单层培养细胞，用 0.25%胰酶溶
液消化并吹打成单个细胞悬液，接种于 24孔板中，并
作十字摇动，混匀。将药物按实验要求稀释至终浓度
为 50.00，33.33，22.22，14.84，9.90，6.60，4.40 μg·mL-1，
每个浓度 3个复孔，并设对照组。将 24孔板移入 CO2
箱，在 37℃，5% CO2及饱和湿度环境下，静置培养 7 d
后终止培养。弃去培养液，用 PBS（0.01 mol·L-1, pH
7.4）小心浸洗 2次。加入纯甲醇固定 15 min后，弃去
固定液，加适量姬姆萨应用液染色 10 ~ 30 min，然后流
水缓慢洗去染色液，空气干燥。将培养板倒置并叠加
一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆数，或
在显微镜下计数大于 50个细胞的克隆数。
克隆形成率/% =克隆数/接种细胞数 × 100；
抑制率/% = 1 -实验组克隆数/对照组克隆数；
以抑制率的对数为纵坐标，浓度为横坐标作图，
计算 IC50值。
2.4 半定量 RT-PCR法检测 p53表达变化
p53 上下游引物分别是：5-CGA AGA CTG GAT
GAC TGC C-3，5-TCA GTC TGA GTC AGG CCC CA-
3，合成片段长度为 285 bp。β-actin 上游引物为 5-
CCA AGG CCA ACC GCG AGA AGA TGA C-3，下游为
5-AGG GTA CAT GGT GGT GCC GCC AGA C-3，产
物长度为 291 bp，均为金思特科技有限公司设计。
2.4.1 RT-PCR反应 总 RNA抽提：收集上述细胞置于
离心管中，按 RNA抽提试剂盒说明书进行，分别抽提
各组总 RNA；经紫外分光光度仪测定，其纯度要求 OD
260 nm/OD 280 nm > 1.8，置于 - 70℃冰箱中保存。
cDNA合成：按 RT试剂盒说明书进行，置于 PCR
仪 42 ℃ 60 min，99 ℃ 5 min灭活，cDNA作为 RT-PCR
反应的待测模板，置于 - 20℃冰箱中保存。
PCR：按试剂盒说明书进行，分别扩增 bcl-2 PCR产
物、β-actin PCR产物。反应条件：94 ℃预变性 5 min；
94℃变性 30 s；56℃退火 45 s；72 ℃延伸 1 min；扩增
32个循环；72℃延伸 10 min。
2.4.2 琼脂糖凝胶电泳 扩增后产物加入 1/6体积溴
酚蓝上样缓冲液混匀，取 20 μL于 1%琼脂糖凝胶上进
行电泳，100 V恒压电泳 0.5 h。Doc Gel 1000凝胶成像
系统观察及拍照。
3 结果
3.1 MTT法
当 APS终浓度为 100.00 μg·mL-1时，抑瘤率与细
胞对照组相比有非常显著性差异（P < 0.01）；当 APS终
浓度为 75.00，50.00，33.33，22.22，14.84，9.90，6.60 μg·
mL-1时，抑瘤率与细胞对照组相比有差异（P < 0.05），
IC50为 9.8 μg·mL-1，提示其有较强的体外抑制 A549
细胞作用。具体结果见表 1。
3.2 集落形成法
当 APS终浓度为 50.00，33.33，22.22，14.84μg·mL-1
时，抑制率为 100%；当 APS 终浓度为 9.90 μg·mL-1
时，抑制率为 91.6%，与细胞对照组相比有显著性差异
（P < 0.01）；当 APS终浓度为 6.60 μg·mL-1时，抑瘤率
为 64.5%，当 APS 终浓度为 4.40 μg·mL-1时，抑瘤
率为 23.4%，提示其有明显的体外抑制 A549 细胞作
用。具体结果见表 2。
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中国药物应用与监测 ２００8年第 5卷第 5期
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信 息
3．3 RT-PCR结果
在近 300 bp处 A549细胞 p53表达条带清晰，经
APS处理后 p53 mRNA表达水平增强，25 μg·mL-1组
最佳，与预期 p53 285 bp片断一致，与正常对照组比较
有显著性差异（P < 0.01），且呈一定的剂量依赖性。
4 讨论
4.1 目前，采用体外培养的癌细胞寻找新抗癌药物已
逐渐成为重要的初筛手段。与体内筛选系统相比，采用
细胞培养体外实验方法具有很多优点：所需样品量少；
不需要大量动物，费用较少，实验周期短；用癌细胞作
药物筛选所得结果与体内试验相关性好。本研究采用
2种实验方法对 APS体外抗肿瘤作用进行实验，结果显
示 APS对人肺癌 A549细胞的增殖有明显抑制作用。
4.2 抑癌基因是指能抑制肿瘤生长的一种基因，属
细胞的正常基因，是细胞生长、分化、增殖、合成以及
生长信息传递等重要的生物过程中起着负调节作用
的基因。p53基因是与人类恶性肿瘤关系最为密切的
肿瘤抑制基因，定位于人类 17P13.1染色体上，编码由
393个氨基组成分子量约 53 000核磷蛋白，作为核内
转录因子，p53蛋白能将细胞周期抑制在 G1晚期，并
诱导细胞凋亡。
本研究通过采用 RT-PCR技术检测 p53的表达，
提示 APS的作用机制可能与抑癌基因 p53表达的改
变相关。APS对 p53的表达有增强作用，阻滞细胞从
G1期向 S期的进程，造成 G1期细胞堆积，阻断细胞
DNA的合成和复制，从而起到抑制 A549细胞增殖的
作用。
参考文献
[1] 何桂霞，裴刚，周天达，等. 显齿蛇葡萄中总黄酮和二氢杨梅素
的含量测定[J]. 中国中药杂志，2000，25（7）：423-425.
[2] 全国中草药汇编编写组. 全国中草药汇编（下册）[M]. 北京：人
民卫生出版社，1978：789.
[3] 周宁宁，朱孝峰，谢冰芬，等. 无刺根中蛇葡萄素体外抗肿瘤作
用研究[J]. 广东药学，2000，10（4）：7-8.
[4] 刘德育，罗曼，谢冰芬，等. 蛇葡萄素的抗肿瘤作用研究[J]. 癌
症，2001，20（1）：1372-1375.
[5] 徐叔云，卞如濂，陈修. 药理实验方法学[M]. 第 3版.北京：人民
卫生出版社，2005.
[6] 司徒镇强，吴军正. 细胞培养（修订版）[M]. 西安：世界图书出
版公司，2005.
（收稿日期：2008-02-02）
注：与细胞对照组比较，* P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01
表 1 APS对 A549细胞的体外抑制作用. n = 5, x ± s
组别 药物浓度/μg·mL-1 OD值 抑制率/% IC50/μg·mL-1
细胞对照组 － 1.494 ± 0.066 － －
顺铂对照组 3.00 0.272 ± 0.035 81.79 －
APS组 100.00 0.325 ± 0.042* 78.25
9.8
75.00 0.372±0.038**75.10
50.00 0.377±0.029**74.77
33.33 0.450±0.067**69.88
22.22 0.500± .027**66.50
14.84 0.537±0.036**64.46
9.90 0.708± .037**52.60
6.60 1.075±0.051**28.05
论 著
表 2 APS对 A549细胞的体外抑制作用.n = 3, x ± s
注：与细胞对照组比较，*P ＜ 0.01，**P ＜ 0.05
组别 药物浓度/μg·mL-1 克隆数 抑制率/%
细胞对照组 － 35.667 ± 12.423 －
APS组 50.00 0.000 ± 0.000* 100.0
33.33 0.000 ± 0.000* 100.0
22.22 0.000 ± 0.000* 100.0
14.84 0.000 ± 0.000* 100.0
9.90 3.000 ± 1.732* 91.6
6.60 12.667 ± 7.638** 64.5
4.40 27.333 ± 7.234** 23.4
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
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