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Neuroprotection of fucoidan against H 2 O 2 -induced oxidative stress injury in primary cortical neurons

褐藻多糖硫酸酯对H2O2诱导皮层神经元氧化应激损伤保护作用



全 文 :中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 5 期 2012 年 5 月

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褐藻多糖硫酸酯对 H2O2诱导皮层神经元氧化应激损伤保护作用
郭宏举,史 宁,陈 乾,马天翔,潘敏翔,吴久鸿*
解放军第 306 医院药学部,北京 100101
摘 要:目的 研究褐藻多糖硫酸酯对 H2O2 诱导小鼠皮层神经元氧化损伤的保护作用,并探讨其作用机制。方法 以含有
B-27 的 Neurobasal 培养基无血清体外原代培养新生小鼠大脑皮层神经元,H2O2(50 μmol/L)诱导氧化应激损伤模型,MTT
法检测不同质量浓度(0.01、0.1、1 g/L)褐藻多糖硫酸酯对细胞存活的影响,生化法测定乳酸脱氢酶(LDH)释放量和丙
二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)的活性。结果 与 H2O2处理组比较,0.1、1 g/L 褐藻多糖硫酸酯能显著提高 H2O2
诱导损伤皮层神经元的存活率(P<0.05),并且降低培养液中 LDH 的漏出量,抑制细胞内 MDA 的生成,提高细胞内 SOD
的活性。结论 褐藻多糖硫酸酯对 H2O2损伤皮层神经元具有显著的保护作用,其机制与抗氧化作用有关。
关键词:褐藻多糖硫酸酯;氧化应激;抗氧化;神经保护作用;神经元
中图分类号:R285.51 文献标志码:A 文章编号:0253 - 2670(2012)05 - 0962 - 03
Neuroprotection of fucoidan against H2O2-induced oxidative stress injury
in primary cortical neurons
GUO Hong-ju, SHI Ning, CHEN Qian, MA Tian-xiang, PAN Min-xiang, WU Jiu-hong
Department of Pharmacy, The 306 Hospital of PLA, Beijing 100101, China
Key words: fucoidan; oxidative stress; anti-oxidation; neuroprotection; neurons

褐藻多糖硫酸酯(fucoidan)是从海带、昆布等
藻类中提取的一类硫酸多糖,主要由岩藻糖和硫酸
基组成。大量研究已证实褐藻多糖硫酸酯具有抗肿
瘤、抗病毒、调节免疫等多种生物活性[1]。在体和
离体实验也表明,褐藻多糖硫酸酯还表现出明显的
抗氧化活性[2],特别对超氧阴离子具有良好的清除
作用;其在多种模型所致的帕金森病细胞和动物模
型中也有明显的神经保护作用 [3];对 H2O2 刺激
dPC12 细胞模拟的高氧化损伤导致神经元凋亡的
AD 模型[4]也具有良好的神经保护作用,提示褐藻多
糖硫酸酯可作用于神经系统,并发挥神经保护作用。
但目前关于褐藻多糖硫酸酯对中枢系统皮层神经元
保护作用的研究未见报道。本研究采用 H2O2的氧化
作用建立体外培养小鼠大脑皮层神经元氧化损伤模
型,观察褐藻多糖硫酸酯对 H2O2所致皮层神经元损
伤的保护作用,并探讨其可能的作用机制。
1 材料
1.1 动物
昆明种仔鼠,由第四军医大学实验动物中心提
供,合格证号 XCSK(军)2002-005。
1.2 药品与试剂
褐藻多糖硫酸酯,购于西安慈缘生物技术有限
公司(批号 CY101118,质量分数为 98%)。
NeurobasalTM Medium、DMEM、B-27 supplement
均购于 Gibco 公司。新生牛血清(杭州四季青公司);
L- 多聚赖氨酸(相对分子质量为 1.5×105 ~
3.0×105,Gibco 公司);MTT、二甲基亚砜(DMSO)
Amresco 分装;乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化
酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒,均为南京建
成生物工程研究所产品。
1.3 仪器
BIO—RAD(Model 680)型酶标仪,SW—CJ—
IF 型超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司),
倒置相差显微镜(Olympus CKX41),CO2 培养箱
(Hera Cell),PHS—3C 精密 pH 计(上海精密科学
仪器有限公司),三蒸水(高压灭菌)。
2 方法
2.1 大脑皮层神经元培养
出生 14~16 d 的昆明仔鼠,无菌条件下分离双
侧大脑,迅速置于预冷的 CMF-HBSS 液中除去大脑

收稿日期:2011-08-08
基金项目:国家自然科学基金资助项目(3077263)
作者简介:郭宏举(1983—),男,药师,研究方向为药理学。Tel: (010)66356172 E-mail: ghj4329502@126.com
*通讯作者 吴久鸿 Tel: (010)66354564 E-mail: jiuhongwu@hotmail.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 5 期 2012 年 5 月

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髓质、脑膜和血管,将皮层部分剪碎为 1~2 mm3
的小组织块。转入含 0.125%胰蛋白酶的 5 mL 离心
管中,细口玻璃管轻轻吹打后置 37 ℃消化 15 min
(每 5 min 振荡 1 次)。将组织块转入等体积含 10%
新生牛血清的 DMEM 培养基中,终止消化 5 min。
再吸出组织块置于离心管中,用 3 mL DMEM 的培
养液轻轻吹打 15 次左右,静置 3 min 后取上清。重
复操作两次,收集上清液,500 r/min 离心 5 min。弃
去上清液,200 目金属网滤过,调整细胞数至 8×
105/mL,接种于 0.01% L-多聚赖氨酸包被过的培养板
中,置 37 ℃、5% CO2孵箱中培养,每 3 d 进行 1 次
半量换液。每天观察细胞生长情况。采用神经元特异
性标志物微管相关蛋白 2(microtubule-associated
protein 2, MAP2)与细胞核双标记法对培养皮质神经
细胞进行了纯度鉴定,结果显示采用此法培养神经元
纯度较高,纯度在 90%以上;且杂质细胞极少。
2.2 H2O2 诱导神经元损伤模型制备
取培养 7 d 的皮层神经元,分为对照组、H2O2
处理组(0、10、25、50、100、200 μmol/L)、褐藻
多糖硫酸酯+H2O2 (50 μmol/L) 处理组进行实验。
H2O2 处理组吸去原培养液,PBS 洗 2 遍,加入含各
种浓度 H2O2的 Neurobasal 培养基,继续培养 6 h 进
行实验。对照组不加 H2O2,其余同 H2O2 处理组。
给药组在 H2O2 处理前 24 h 加入不同浓度的褐藻多
糖硫酸酯,终质量浓度为 0.01、0.1、1 g/L。褐藻多
糖硫酸酯溶媒为高压灭菌的三蒸水。
2.3 MTT 比色法测定细胞存活率
H2O2作用 6 h 后,每孔内加入 20 μL MTT 液(终
质量浓度为 0.5 mg/mL),37 ℃继续培养 4 h,弃上
清液,加入 DMSO 150 μL,室温振荡 10 min。待孔
内颗粒完全溶解后,酶标仪上测定 570 nm 处的吸
光度(A570)值,计算细胞存活率。
细胞存活率=实验组 A570 / 对照组 A570
2.4 培养液中 LDH 测定
细胞处理后,收集细胞培养上清液,参照试剂
盒说明书测定培养液中 LDH 漏出量。
2.5 细胞内 SOD 活性和 MDA 测定
细胞经损伤处理后去除原培养液,细胞用 PBS
洗 2 遍,每孔加入 0.1 mol/L PBS 和 0.05 mmol/L
EDTA(pH 8.0)1 mL,再加入 1% Triton-X100 50 μL,
将培养板置振荡器振荡 1 min 使之溶解,加入 25%
H3PO4 100 μL 以沉淀蛋白,10 000×g 于 4 ℃离心
1 h,取上清液按说明书测定 SOD活性和MDA水平。
2.6 统计学处理
所有数据均以 sx ± 表示,应用 SPSS13.0 软件
进行统计分析,组间比较采用单因素方差分析。
3 结果
3.1 褐藻多糖硫酸酯对 H2O2 损伤皮层神经元存活
率的影响
25 μmol/L 以下浓度 H2O2对神经元存活率无影
响,从 50 μmol/L 开始细胞存活率明显下降。与对
照组相比,50、100、200 μmol/L H2O2 诱导神经元
不同程度的损伤(P<0.01),细胞存活率呈浓度依
赖性的降低。其细胞存活率分别降至 68.96%、
35.02%、8.78%。预先 24 h 给予褐藻多糖硫酸酯
(0.01、0.1、1 g/L),可以预防 H2O2 对细胞的损伤,
明显提高细胞存活率,结果见表 1。
为进一步考察褐藻多糖硫酸酯对 H2O2 损伤皮
层神经元的保护作用,以培养液中 LDH 漏出量作
为观察指标进行实验,神经元经 50 μmol/L H2O2损
伤后,细胞膜通透性增大,LDH 大量漏出。致使培
养液中 LDH 的量显著增加。预先 24 h 给予褐藻多
糖硫酸酯(0.01、0.1、1 g/L)与 H2O2处理组相比,
0.1、1 g/L 褐藻多糖硫酸酯可明显降低细胞培养液
中 LDH 的漏出量。结果见表 1。
表 1 褐藻多糖硫酸酯对 H2O2损伤原代培养皮层神经元的
保护作用 ( ± = 6x s , n )
Table 1 Protection of fucoidan on primary cortical
neurons injured by H2O2 ( 6=± n , sx )
组 别 ρ / (g·L−1) 细胞存活率 / % LDH / (kU·L−1)
对 照 - 98.15±1.78 22.33±1.34
H2O2 - 65.44±3.61** 60.95±2.14**
褐藻多糖硫酸酯 0.01 63.26±3.13 61.13±4.23
0.1 75.33±4.57Δ 55.26±3.37Δ
1 80.76±3.65ΔΔ 48.35±5.12ΔΔ
与对照组比较:**P<0.01;与 H2O2组比较:ΔP<0.05 ΔΔP<0.01
**P < 0.01 vs control group; ΔP < 0.05 ΔΔP < 0.01 vs H2O2 group
3.2 褐藻多糖硫酸酯对细胞 MDA 水平和 SOD 活
性的影响
与对照组相比,皮层神经元经 50 μmol/L H2O2
损伤后培养液中 MDA 水平显著增加,SOD 活性显
著降低;预先 24 h 给予褐藻多糖硫酸酯(0.01、0.1、
1 g/L)与 H2O2 处理组相比,0.1、1 g/L 褐藻多糖硫
酸酯可明显降低培养液中 MDA 水平并且升高 SOD
活性,结果见表 2。
4 讨论
传统的细胞培养方法以各种血清提供神经营养
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 5 期 2012 年 5 月

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表 2 褐藻多糖硫酸酯对 H2O2损伤皮层神经元培养液中
MDA 水平和 SOD 活性的影响 ( 6=± n , sx )
Table 2 Effect of fucoidan on MDA level and SOD activity in
medium of neurons injured by H2O2 ( 6=± n , sx )
组 别 ρ / (g·L−1) MDA / (μmol·L−1) SOD / (U·mL−1)
对 照 - 0.42±0.04 17.49±1.21
H2O2 - 1.12±0.11** 7.95±1.14**
褐藻多糖硫酸酯 0.01 1.03±0.08 8.52±1.23
0.1 0.73±0.09ΔΔ 10.26±2.37ΔΔ
1 0.62±0.05ΔΔ 13.41±2.17▲ΔΔ
与对照组比较:**P<0.01;与 H2O2 处理组比较:ΔΔP<0.01;与
褐藻多糖硫酸酯 0.1 g·L−1 组比较:▲P<0.05
**P < 0.01 vs control group; ΔΔP < 0.01 vs H2O2 group; ▲P < 0.05 vs
fucoidan 0.1 g·L−1 group
因子,神经元生长良好,但血清中含有的丰富营养
成分也同时促进了神经胶质细胞生长。这类细胞通
常占神经元的比例很大,并且还具有增殖能力。因
此需要加入阿糖胞苷等有丝分裂抑制剂抑制胶质细
胞的生长[5]。另外,血清培养不宜进行长期研究,
而且血清的成分相对比较复杂,含有一些未知因素
可能影响实验结果。采用无血清培养则可以免除血
清带来的弊端,并且能明显改善神经元的生长状态
和存活时间[6]。本研究则以无血清培养基培养新生
小鼠的大脑皮层神经元,细胞生长良好,皮层神经
元典型清楚,且神经胶质细胞的干扰很少,培养至
第 5 天神经元的纯度即可达 95%以上。
H2O2 是一种较强的氧化剂,极易进入细胞内,
通过 Haber-Weiss 或 Fenton 反应,形成高活性的氧
自由基或羟基自由基。这些自由基几乎可与细胞内
的任何成分发生反应造成细胞损伤[7]。使神经元发
生脂质过氧化反应生成 MDA,SOD 是主要存在于
细胞浆和线粒体里的一种金属蛋白酶,能够清除代
谢产生的超氧阴离子,是体内抗氧化系统的重要组
成部分。因此,测定 MDA、SOD 活性既可以反映
细胞损伤程度又可以判断细胞损伤原因[8-9]。研究表
明大脑皮层是中枢神经系统的重要组成部分,参与
多种功能作用。本实验研究结果显示 H2O2(50
μmol/L)诱导皮层神经元 6 h,与对照组相比细胞内
MDA 水平明显升高而胞内 SOD 活性显著降低,提
示 H2O2(50 μmol/L)所致皮层神经元损伤与脂质
过氧化损伤有关,褐藻多糖硫酸酯可提高皮层神经
元内 SOD 活性并显著降低胞内 MDA 的量,提高皮
层神经元存活率,表明褐藻多糖硫酸酯可明显地减
弱 H2O2 所造成的皮质神经元氧化应激损伤。研究
显示褐藻多糖硫酸酯对 MPP+诱导 MN9D 细胞的损
伤模拟的 PD 模型[10]、H2O2 刺激 dPC12 细胞模拟高
氧化损伤导致神经元凋亡的 AD 模型[11-12]产生良好
保护作用。提示褐藻多糖硫酸酯有可能对帕金森病、
阿尔茨海默病[13]等神经性退行疾病产生治疗作用。
本实验结果初步显示褐藻多糖硫酸酯具有体外神经
保护作用。
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