全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 9 期 2012 年 9 月

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• 药理与临床 •
白花丹醌对瘦素刺激的人肝星状细胞周期及其相关蛋白表达的影响
韦燕飞 1，李景强 1，张志伟 2，张 园 1，王玖恒 1，赵铁建 1*
1. 广西中医药大学基础医学院 生理教研室，广西 南宁 530001
2. 广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁 530001
摘 要：目的 研究白花丹醌对瘦素刺激的体外培养人肝星状细胞（HSC-LX2）细胞周期及周期相关蛋白表达的影响，探讨
白花丹醌抗肝纤维化的作用机制。方法 ELISA 法检测 HSC-LX2 细胞培养上清液中自分泌瘦素水平。将 HSC-LX2 细胞分成
对照组，瘦素组，白花丹醌 2、8 μmol/L 组，秋水仙碱 6.25 μg/mL 阳性对照组。除对照组外，其余各组细胞用瘦素 100 μg/mL
刺激 24 h、再与药物共同培养 24 h 后，流式细胞仪检测 HSC-LX2 细胞周期，Western blotting 法检测细胞周期相关蛋白 cyclin D1、
cyclin E1、p21 的表达。结果 HSC-LX2 细胞自分泌瘦素的浓度先随着培养时间的延长而递减，24 h 达到低谷值，48 h 后又升
至 6 h 水平，每个时间点分泌的瘦素量无显著差异（P＞0.05）。与对照组相比，瘦素组 HSC-LX2 细胞增殖能力显著增强，S 期
和 G2/M 期细胞比例显著增加；而白花丹醌 2、8 μmol/L 干预后，HSC-LX2 细胞 G0/G1期细胞的比例明显提高，而 S 期和 G2/M
期细胞比例明显降低，且呈明显的浓度相关性。与对照组比较，瘦素组 HSC-LX2 细胞经瘦素刺激后细胞周期相关蛋白 cyclin D1、
cyclin E1 的量显著增加，p21 蛋白的表达受到抑制；白花丹醌 2、8 μmol/L 和秋水仙碱明显降低 cyclin Dl、cyclin E1 蛋白水平，
增强 p21 蛋白表达。结论 白花丹醌可明显抑制瘦素诱导的 HSC-LX2 细胞增殖，该作用主要是通过抑制细胞由 G0/G1期向 S
期转变而产生的，作用机制可能与其降低 cyclin Dl、cyclin E1 蛋白水平，增加 p21 蛋白表达相关。
关键词：白花丹醌；瘦素；人肝星状细胞；细胞增殖；细胞周期；细胞周期相关蛋白
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2012)09 - 1776 - 05
Effects of plumbagin on cell cycle of human hepatic stellate cells stimulated
by leptin and its related protein expression
WEI Yan-fei1, LI Jing-qiang1, ZHANG Zhi-wei2, ZHANG Yuan1, WANG Jiu-heng1, ZHAO Tie-jian1
1. Department of Physiology, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530001, China
2. Ruikang Hospital, of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530001, China
Abstract: Objective To investigate the effects of plumbagin on cell cycle of human hepatic satellite cells (HSC-LX2) stimulated by
leptin in vitro and its expression of related proteins, so as to explore the mechanism of anti-hepatic fibrosis of plumbagin. Methods
The level of autocrine leptin in culture supernate of HSC-LX2 was measured by ELISA. HSC-LX2 were divided into control, model
(leptin), plumbagin low- and high-dose (2 and 8 μmol/L), and colchicines (6.25 μg/mL) groups. In addition to the control group, the
other groups were stimulated by leptin (100 μg/mL) for 24 h and treated with plumbagin at different concentration and colchicine for
24 h later. HSC-LX2 cell cycle was detected by flow cytometry (FCM) and the expression of cell cycle-related proteins of cyclin D1,
cyclin E1, and p21 were tested by Western blotting. Results The concentration of autocrine leptin in HSC-LX2 decreased with
cultural time prolonging, the minimum time was at 24 h and after 48 h the level recovered to original level of 6 h (P < 0.05). There was
no significant difference in concentration of autocrine leptin at each time point (P > 0.05). FCM analysis showed that in model group
HSC-LX2 cell proliferation and cell number ratio of S and G2/M phases significantly increased compared with the control group. At
24 h after addition of plumbagin (2 and 8 μmol/L), the percentage of HSC-LX2 at G0/G1 phase was apparent increased, while the total

收稿日期：2012-01-05
基金项目：国家自然科学基金资助项目（30760321）；广西高等学校优秀人才资助项目（J11065）；广西教育厅科研项目（200103YB083）
作者简介：韦燕飞（1976—），女，广西人，医学博士，副教授，主要从事中医药防治肝脏疾病基础研究和教学工作。
Tel: (0771)2214279 E-mail: weiyanfei@163.com
*通讯作者 赵铁建 Tel: (0771)2214279 E-mail: ztj-nanning@163.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 9 期 2012 年 9 月

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percentage of HSC-LX2 cells at S and G2/M phases was apparent decreased in a dose-dependent manner. Compared with the control
group, the stimulation by leptin significantly increased the contents of cyclin D1 and cyclin E1 in HSC-LX2, and inhibited the
expression of p21 protein. However, plumbagin (2 and 8 μmol/L) and colchicine significantly decreased the level of cyclin D1 and
cyclin E1 and increased the expression of p21 protein. Conclusion Plumbagin could significantly inhibit the proliferation of
HSC-LX2 induced by leptin through blocking HSC-LX2 to enter S phase from G0/G1 phase. Its mechanism might be related to the
decrease of the expressions of cyclin D1 and cyclin E1 and the increase of p21 protein expression.
Key words: plumbagin; leptin; hepatic stellate cells; cell proliferation; cell cycle; cell cycle-related proteins

肝纤维化是多种因素作用的结果，不同病因导
致肝纤维化的共同通路是人肝星状细胞（HSCs）的
活化与增殖[1]，因此抑制 HSCs 增殖成为抗肝纤维
化的重要手段。白花丹醌（plumbagin）是白花丹
Plumbago zeylanica L. 中的主要活性成分，属小分
子萘醌类化合物，具有抗菌、抗炎、抗风湿、抗凝
血等广泛的药理活性[2]。前期研究显示，白花丹醌
体外可明显抑制人肝星状细胞（HSC-T6）的增殖，
抑制转化生长因子-β1（TGF-β1）和 α-平滑肌肌动蛋
白（α-SMA）的表达，促进活化的 HSC-LX2 细胞凋
亡[3-5]。近年来诸多研究表明细胞周期调控在细胞的
增殖和分化中起重要作用，如果细胞周期的某个环
节受阻，细胞生长、增殖就会受到抑制。本实验研
究白花丹醌对 HSC-LX2 细胞周期及其相关蛋白表
达的影响，以探讨其抑制 HSC-LX2 细胞增殖和抗
肝纤维化的作用机制。
1 材料
1.1 药品与试剂
白花丹醌（批号 20071028），Sigma 公司，质
量分数 99%，用二甲基亚砜（DMSO）溶解，配成
0.1 mol/L 储备液，于−20 ℃保存；秋水仙碱，0.5 mg/
片，西双版纳药业公司，批号 070205。重组瘦素，
Protech 公司，批号 8110060R；DMEM 培养基，Gibco
公司；胎牛血清，Hyclone 公司；碘化丙锭（PI），
上海生工生物技术有限公司；蛋白质定量试剂盒
（BCA 法），Pierce 公司；cyclin D1、cyclin E1、p21
单克隆抗体，Santa Cruz 公司；二抗辣根酶标记兔
抗羊 IgG、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）内参抗
体，北京中山生物公司。
1.2 仪器
Model 311 型 CO2 培养箱，美国 Thermo 公司；
TGL—16G—A 高速冷冻离心机，上海安亭科学仪
器厂；Epics—XL11 型流式细胞仪，美国 Beckman-
eoulter 公司。
1.3 细胞
HSC-LX2 由湖南湘雅医学院医学实验中心提供。
2 方法
2.1 细胞培养
HSC-LX2 细胞置于含 10%胎牛血清的高糖
DMEM 培养液中，37 ℃、5% CO2 条件下培养，隔
天换液，当细胞长成单层致密状时，用 2.5 g/L 胰蛋
白酶消化，每 3～4 d 传代 1 次，按 1∶2 传代，每
次实验均取指数生长期的细胞。
2.2 ELISA 法检测细胞培养上清液中瘦素自分泌
水平
传代的 HSC-LX2 细胞经胰蛋白酶消化后，用
完全培养液将细胞浓度调至 5×104/mL，细胞悬液
接种于 96 孔培养板中，每孔 180 μL，设 6 个复孔，
置 CO2 孵箱中于 37 ℃、5% CO2 条件下培养，分别
于 6、12、24、48 h 收集细胞上清液，用 ELISA 法
测定细胞培养上清液中瘦素水平。
2.3 分组与给药
实验设对照组、瘦素组、白花丹醌低和高浓度
组、秋水仙碱阳性对照组。对照组细胞加入含 10%
胎牛血清的高糖 DMEM 培养液；瘦素组细胞加入
含 10%胎牛血清、瘦素 1.0 mg/L 的高糖 DMEM 培
养液，使瘦素终质量浓度为 100 μg/L，培养 24 h；
白花丹醌低和高浓度组细胞用瘦素 1.0 mg/L 刺激
24 h 后，加入白花丹醌，使其终浓度分别为 2、8
μmol/L，培养 24 h；秋水仙碱组细胞用瘦素 1.0 mg/L
刺激 24 h 后，加入秋水仙碱（终质量浓度为 6.25
mg/L）培养 24 h；每组设 4 个复孔。
2.4 流式细胞仪检测细胞周期
收集各组细胞，PBS 冲洗 2 次，用 70%乙醇 4
℃固定过夜，PBS 洗涤，离心去上清，加入适量含
100 mg/L RNase 和 50 mg/L PI 的染液，调整细胞浓
度至约 1×105/mL，4 ℃避光染色 30 min，流式细
胞仪检测，每份标本测定 10 000 个细胞，测定速
率为每秒 50～60 个细胞。氩离子激光器激发波长
为 488 nm，阻断滤片为 633 nm 长波通滤片，
MultiCycle AV 软件进行细胞周期分析，计算各期
细胞百分率。
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2.5 Western blotting 检测细胞周期相关蛋白表达
各组细胞用 0.25%胰酶消化，离心 3 min，弃上
清，PBS 洗细胞 3 次，做好标记，并迅速移至 l mL
细胞缓冲液中匀浆，枪头反复吹打样品后转移至 1.5
mL 离心管离心，BCA 法测定上清液中总蛋白浓度。
SDS-PAGE 电泳：将凝胶取出，切去积层胶部分，
并作记号，放入盛有转移缓冲液的平皿中，用转移
缓冲液浸泡 6 张滤纸（3 张为上层，3 张为下层）凝
胶，甲醇浸泡，并用转移缓冲液浸泡的硝酸纤维素
薄膜做出三明治模型，膜面为正极，胶面为负极，
电流为 1.0～2.0 mA/cm2，1.5 h，含 5%脱脂奶粉的
TBST 缓冲液 4 ℃封闭过夜，含 5%脱脂奶粉的
TBST 缓冲液稀释抗体，cyclin D1、cyclin E1、p21
按 l∶1 000 稀释，GAPDH 按 l∶2 000 稀释。将膜
和用含 5%脱脂奶粉的 TBST 缓冲液稀释的二抗辣
根酶标记兔抗羊 IgG（1∶1 500）一起室温孵育 2 h。
将膜置于 supersignal west反应液中室温孵育 5 min，
去除过量溶液，将膜夹在两塑料薄膜之间，压 X 光
片，暗室中曝光数分钟，X 光胶片显影、定影、曝
光。Quantity One 4.62 软件分析。
2.6 统计学分析
应用 SPSS 13.0 软件进行统计学处理，计量资
料均采用 ±x s 表示，多组数据比较采用方差分析，
两组间计量资料比较采用 t 检验。
3 结果
3.1 细胞培养上清液中瘦素自分泌水平变化
结果显示，HSC-LX2 细胞自分泌瘦素的量先随
培养时间的延长而递减，24 h 达低谷值，48 h 又升
至 6 h 水平，每个时间点分泌瘦素的量之间相比无
显著差异（P＞0.05），说明 HSC-LX2 细胞自分泌瘦
素水平的变化规律仍不明确。结果见图 1。

图1 HSC-LX2培养上清液中瘦素自分泌水平的变化 (n＝6)
Fig. 1 Changes of antocrine leptin level in supernatant
of HSC-LX2 (n＝6)
3.2 对 HSC-LX2 细胞周期的影响
流式细胞术分析显示，与对照组相比，瘦素组
显著增强 HSC-LX2 细胞增殖能力，增加 S 期和
G2/M 期细胞的比例（P＜0.05、0.01）。与瘦素组相
比，白花丹醌 2、8 μmol/L 作用 HSC-LX2 细胞 24 h
后，G0/G1 期细胞比例均明显增加（P＜0.01），而 S
期和 G2/M 期细胞比例明显降低（P＜0.05、0.01），
并呈浓度相关性。结果见图 2 和表 1。

图 2 白花丹醌对 HSC-LX2 细胞周期的影响
Fig. 2 Effect of plumbagin on cell cycle of HSC-LX2



0 64 128 192 256 0 64 128 192 256 0 64 128 192 256
0 64 128 192 256 0 64 128 192 256
240
200
160
120
80
40
0
细
胞
数

420
350
280
210
140
70
0
540
450
360
270
180
90
0
780
650
520
390
260
130
0
500
450
360
270
180
90
0
细
胞
数

DNA 量
对照 瘦素 秋水仙碱
白花丹醌 2 μmol·L−1
细
胞
数

细
胞
数

细
胞
数

白花丹醌 8 μmol·L−1
6 12 24 48
t / h
瘦
素
/
(n
g·
m
L−
1 )

26
24

22

20
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表 1 白花丹醌对 HSC-LX2 细胞周期分布的影响 ( ± = 4x s , n )
Table 1 Effect of plumbagin on cell cycle distribution of HSC-LX2 ( ± = 4x s , n )
周期分布 组 别
G0/G1期 S 期 G2/M 期
对照 53.2±2.8 30.1±1.7 16.7±2.1
瘦素（100 μg·L−1） 25.7±1.9▲▲ 35.4±3.2▲ 38.9±1.8▲▲
瘦素（100 μg·L−1）＋白花丹醌（2 μmol·L−1） 51.0±3.1** 31.1±2.5 17.9±1.1**
瘦素（100 μg·L−1）＋白花丹醌（8 μmol·L−1） 56.2±2.6** 27.1±2.2* 16.7±1.5**
瘦素（100 μg·L−1）＋秋水仙碱（6.25 mg·L−1） 55.1±2.2** 29.6±1.3* 15.3±1.4**
与对照组比较：▲P＜0.05 ▲▲P＜0.01；与瘦素组比较：*P＜0.05 **P＜0.01，下表同
▲P < 0.05 ▲▲P < 0.01 vs control group; *P < 0.05 **P < 0.01 vs leptin group, same as below
3.3 对 HSC-LX2 细胞周期相关蛋白表达的影响
Western blotting 检测结果显示，经瘦素刺激后
显著增加了HSC-LX2细胞周期相关蛋白 cyclin D1、
cyclin E1 的量，降低了 p21 蛋白的表达；而白花丹
醌 2、8 μmol/L 和秋水仙碱给药后，明显降低 cyclin
D1、cyclin E1 蛋白水平，增加 p21 蛋白表达，与瘦
素组比较差异显著（P＜0.01）。结果见图 3 和表 2。
4 讨论
HSC 在肝纤维化乃至肝硬化发生、发展中的作
用非常重要，激活的 HSC 是肝纤维化时细胞外基质
的主要来源，是肝纤维化的中心环节[6-7]。HSC 的

图 3 白花丹醌对 HSC-LX2 细胞周期相关蛋白表达的影响
Fig. 3 Effect of plumbagin on cell cycle-related
protein expression of HSC-LX2
表 2 白花丹醌对 HSC-LX2 细胞周期相关蛋白表达的影响 ( ± = 4x s , n )
Table 2 Effect of plumbagin on cell cycle-related protein expression of HSC-LX2 ( ± = 4x s , n )
组 别 cyclin Dl/GAPDH cyclin El/GAPDH p21/GAPDH
对照 1.141±0.058 1.163±0.028 1.292±0.035
瘦素（100 μg·L−1） 2.327±0.127▲▲ 1.952±0.102▲▲ 0.788±0.012▲
瘦素（100 μg·L−1）＋白花丹醌（2 μmol·L−1） 1.382±0.049* 1.828±0.041 1.210±0.047*
瘦素（100 μg·L−1）＋白花丹醌（8 μmol·L−1） 0.853±0.027** 1.185±0.036** 1.224±0.032*
瘦素（100 μg·L−1）＋秋水仙碱（6.25 mg·L−1） 0.822±0.036** 1.083±0.051** 1.434±0.051**

数目是由肝纤维化不同时期 HSCs 的增殖与凋亡共
同控制的[8]。HSCs 凋亡是导致其数量减少的重要方
法，而许多药物可通过作用于细胞周期的某一环节，
阻滞细胞周期而诱导细胞凋亡[9]。
白花丹醌具有抑制多种肿瘤细胞系增殖及诱导
凋亡作用[10-11]。本课题组前期体外实验亦证实其可
明显抑制 HSC-T6 增殖，促进其凋亡。本实验发现，
HSC-LX2 自分泌瘦素的量随着培养时间的延长而
递减，24 h 达到最低，48 h 又上升至 6 h 水平，各
时间点分泌瘦素的量相比无显著差异，表明 HSC-
LX2 自分泌瘦素量的变化规律仍不明确。外源性瘦
素显著增强 HSC-LX2 细胞的增殖能力及增加 S 期
和 G2/M 期细胞的比例；白花丹醌作用 HSC-LX2 细
胞 24 h 后，G0/G1 期细胞比例均明显增多，而 S 期
和 G2/M 期细胞比例明显降低，且与其浓度呈相关
性。由此推测白花丹醌抑制瘦素诱导的 HSC-LX2
细胞增殖，可能是通过影响细胞周期实现的，具体
机制可能为：阻断 HSC-LX2 细胞由 G0/G1 期向 S
期、G2/M 期转变，进而抑制细胞的 DNA 合成和细
胞分裂，使细胞周期进程减缓，阻止其增殖。
细胞周期的程序控制主要通过各种周期蛋白
（cyclins）、周期蛋白依赖性蛋白激酶（CDKs）有序
3.6×104
5.0×104
2.1×104
3.6×104
对照 瘦素 秋水仙碱 2 8
白花丹醌 / (μmol·L−1)
cyclin D1
cyclin E1
p21
GAPDH
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的磷酸化和去磷酸化及周期蛋白依赖性蛋白激酶抑
制因子实现的。参与 G1 期调控的蛋白包括 cyclin
D1/CDK4激酶抑制因子p21和p27，cyclin D1、cyclin
E1 特异性地表达于细胞周期中最早合成的周期蛋
白，因此提高 cyclin D1、cyclin E1 的表达与促进细
胞增殖相关[12]。p21 主要抑制 cyclin D/CDK4 和
cyclin E/CDK2 等作用于 G1 期的激酶复合物的活
性，阻滞细胞周期于 G1 期[12]。Jaiswal 等[13]对小鼠
胚胎纤维母细胞进行研究时发现，白花丹醌通过诱
导 p21 的产生，使细胞周期阻滞于 S-G2/M 期。
Western blotting 检测结果显示，瘦素诱导 cyclin D1、
cyclin E1 高表达，降低 p21 的表达水平；白花丹醌作
用 HSC-LX2 细胞 24 h，促进细胞增殖、分裂的 cyclin
D1、cyclin E1 表达显著降低，同时抑制细胞增殖、分
裂的 p21 表达明显增加。综上所述，白花丹醌通过阻
止 HSC-LX2 细胞由 G0/G1期进入 S 期而抑制瘦素所
致细胞增殖，其作用机制可能与其降低 cyclin D1、
cyclin E1 蛋白表达，提高 p21 蛋白表达有关。
细胞周期调控的机制相当复杂，白花丹醌抑制
HSC-LX2 细胞增殖和诱导其凋亡的确切机制尚未完
全明了。深入研究白花丹醌对 HSC-LX2 细胞周期的
影响，有助于进一步了解白花丹醌调控 HSCs 增殖及
凋亡的分子机制，为抗肝纤维化治疗提供参考。
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