全 文 ：网络出版时间:2012 － 11 － 19 17:18 网络出版地址:http:/ /www． cnki． net /kcms /detail /34． 1086． R． 20121119． 1718． 009． html
◇论 著◇
豹皮樟总黄酮调控瘦素、TGF-β1对肝纤维化大鼠的预防作用研究
黄 成1，马陶陶1，李 浩1，李政通1，章胜朋1，邓子煜2，李 俊1
(1．安徽医科大学药学院，安徽天然药物活性研究省级重点实验室，国家中医药管理局中医药三级
实验室“中药药理实验室”，安徽 合肥 230032;2．安徽医科大学第二附属医院，安徽 合肥 230601)
收稿日期:2012 － 07 － 16，修回日期:2012 － 08 － 28
基金项目:国家自然科学基金资助项目(No 81072686) ;安徽省高等
学校省级自然科学研究项目(No KJ2010A162) ;安徽省自
然科学基金重点项目 (No KJ2012A156)
作者简介:黄 成 (1973 －) ，男，博士，讲师，研究方向:肝脏药理
学，Tel:0551-5161217，E-mail:hcahmu@ 126． com;
李 俊 (1960 －) ，男，博士，教授，博士生导师，研究方
向:肝脏药理学，抗炎免疫药理学，通讯作者，Tel:0551-
5161001;
邓子煜(1971 －) ，男，博士，副教授，研究方向:肝脏药理
学，通讯作者，Tel:0551-5167732，E-mail:zydengsy@ 163．
com
doi:10． 3969 / j． issn． 1001 － 1978． 2012． 12． 009
文献标志码:A 文章编号:1001 － 1978(2012)12 － 1666 － 06
中国图书分类号:R-332;R284． 1;R341;R347;R392． 11;
R575. 202. 2
摘要:目的 研究豹皮樟总黄酮(TFLC)调控瘦素(leptin)和
转化生长因子-β1 (TGF-β1)对肝纤维化大鼠的预防作用。
方法 采用 CCl4 诱导大鼠肝纤维化模型，TFLC 灌胃给药第
12 周末，检测 ALT、AST及 HA、LN、PⅢNP、CⅣ含量;检测Ⅰ
型胶原(Collagen Ⅰ)、瘦素、TGF-β1 的含量;检测 Hyp 及组
织病理变化;检测瘦素受体(OB-Rb)、TGFβ1Ⅰ型受体
(TGFβR1)、Smad3 mRNA 及蛋白表达。结果 TFLC(200、
400 g·L －1)能明显降低肝纤维化大鼠肝纤维化指标及血清
Ⅰ型胶原、瘦素、TGF-β1 水平;降低 Ob-Rb、TGFβR1、Smad3
的 mRNA及蛋白表达。结论 TFLC 能有效预防 CCl4 诱导
的大鼠肝纤维化，可能与下调肝内瘦素及其受体，抑制 TGF-
β1 /Smad通路有关。
关键词:肝纤维化;豹皮樟总黄酮;瘦素;瘦素受体;转化生长
因子-β1;TGF-β1Ⅰ型受体
肝纤维化是肝脏对于各种慢性损伤的修复反
应，以细胞外基质(extracellular matrix，ECM)在肝脏
内大量沉积为病理特征。瘦素(leptin)是肥胖基因
编码的肽类激素，具有重要的生理作用。研究显示，
瘦素参与肝纤维化的形成，瘦素致纤维化的机制与
转化生长因子-β1 (transforming growth factor-β1，
TGF-β1)密切相关［1 － 2］。豹皮樟总黄酮(total fla-
vonoids of Litsea coreana Levl，TFLC)是从药食同源
植物豹皮樟提取的有效部位。前期研究表明，TFLC
具有良好的抗炎和免疫调节作用，对酒精性脂肪性
肝炎、非酒精性脂肪性肝炎均具有较好的防治作
用［3 － 4］，对肝纤维化大鼠具有治疗作用［5］。本实验
将在前期研究的基础上，进一步研究 TFLC 对 CCl4
诱导肝纤维化大鼠的预防作用，并深入探讨 TFLC
对瘦素、瘦素受体(leptin receptor，Ob-Rb)及 TGF-
β1 /Smads通路蛋白表达的影响，为 TFLC 防治肝纤
维化提供实验和理论依据。
1 材料
1． 1 药品与试剂 豹皮樟总黄酮，由本院天然药物
化学室研制，总黄酮含量 ＞ 70%;秋水仙碱购于版纳
药业有限公司，临用前均以 0. 5%羧甲基纤维素钠
溶液配成相应浓度的混悬液。CCl4，分析纯，购于汕
头西陇化工厂，临用前用花生油 1 ∶ 1 稀释。谷丙转
氨酶(alanine transaminase，ALT)、谷草转氨酶(as-
partate aminotransferase， AST )、 羟 脯 氨 酸
(hydroxyproline，Hyp)测定试剂盒购于南京建成生
物科技公司。透明质酸(hyaluronic acid，HA)、层粘
连蛋白(laminin，LN)、Ⅲ型前胶原氨端肽(procolla-
gen ⅢN-terminal peptide，PⅢNP)、Ⅳ型胶原(pro-
collagenase IV，CⅣ)放免试剂盒购于北京北方生物
技术研究所。Ⅰ型胶原(collagenⅠ)、TGF-β1、leptin
ELISA试剂盒购于上海森雄科技实业有限公司。TR-
Izol Reagent 购于 Invitrogen 公司。Reverse Transcrip-
tion System逆转录试剂盒与 PCR试剂盒购于 Fermen-
tas公司。Ob-Rb、TGFβ1Ⅰ型受体(TGFβR1)、Smad3、
β-actin引物序列由上海生工生物工程技术服务有
限公司合成。小鼠抗 Ob-Rb、TGFβR1、Smad3 抗体
购于美国 Santa Cruz 公司;辣根过氧化物酶标记二
抗购于北京中杉公司;ECL 发光试剂盒购于 Pierce
公司。
1． 2 实验动物 ♂SD大鼠，体质量 200 ～ 220 g，由
安徽医科大学实验动物中心提供 (动物合格证号:
皖医实动准字第 01 号)。动物自由进食、饮水，1 周
·6661· 中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2012 Dec;28(12) :1666 ～ 71
后使用。
2 方法
2． 1 动物分组与处理 大鼠正常喂养 1 周后，随
机分为正常组、模型组、给药组(低剂量组 100 mg·
kg －1、中剂量组 200 mg·kg －1、高剂量组 400 mg·
kg －1) ，每组 10 只。除正常组外，其余各组每周二、
周五皮下注射 50% CCl4 花生油溶液(1 ml·kg
－1) ，
连续 12 周;正常组皮下注射等量的花生油溶液。给
药组于造模第 1 周起灌胃给予 TFLC，每天 1 次，直
至造模结束;正常组和模型组灌以等量的生理盐水。
第 12 周末，大鼠禁食 12 h，2%戊巴比妥钠(30 mg·
kg －1)麻醉，腹主动脉采血，常规制备血清;留取肝脏
组织标本，检测相关指标。
2． 2 血清学指标检测 大鼠取血后室温静置 1 h，
3 000 r·min －1离心 15 min，分离血清。检测血清中
ALT、AST、HA、LN、PⅢNP、CⅣ及Ⅰ型胶原、瘦素、
TGF-β1。
2． 3 组织学指标检测 肝组织石蜡切片 Masson 染
色观察形态学改变，制备肝匀浆，检测肝组织 Hyp
含量。
2． 4 RT-PCR 分析 Ob-Rb、TGF-βR1、Smad3 的
mRNA水平 按 TRIzol试剂盒说明书，提取肝脏组
织总 RNA，按 RT-PCR 试剂盒说明书，逆转录合成
cDNA。引物序列见 Tab 1。以 β-actin 为内参照。
PCR反应产物置 1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测。凝胶
成像系统进行密度扫描，以各扩增产物对 β-actin 光
密度值的比值表示目的基因的相对量。
2． 5 Western blot 检测肝组织中 Ob-Rb、TGF-
βR1、Smad3 蛋白水平 取大鼠肝组织 100 mg，加
入 1 ml RIPA 组织裂解液(每 ml 裂解液中加 10 μl
PMSF) ，冰上进行组织匀浆，12 000 r·min －1，4℃，
离心 10 min，取上清，BCA 法测定蛋白浓度。每孔
加样量为 20 μg蛋白(浓缩胶电压 80 V，分离胶 100
V)。电泳结束后由半干转仪器将蛋白转移到 PVDF
膜上，电压 20 V，时间 15 min。膜于室温下以含 50 g
·L －1脱脂奶粉的 TBST 缓冲液封闭 2 h，漂洗后加
入一抗(Ob-Rb、TGF-βR1、Smad3) ，4℃过夜。再分
别加入与一抗相匹配的二抗，室温放置 1 h。ECL发
光试剂盒显影，以 β-actin为内参，分析条带吸光值。
2． 6 统计分析 采用 SPSS 13. 0 进行单因素方差
分析及 t检验处理，等级资料采用非参数秩和检验，
结果以 珋x ± s表示。
3 结果
3． 1 TFLC 对 CCl4 诱导的肝纤维化大鼠血清
ALT、AST、HA、LN、PⅢNP、CⅣ、Ⅰ型胶原及肝组
织 Hyp的影响 模型组血清 ALT、AST 水平与正常
组比较明显增加(P ＜ 0. 01) ，TFLC (200、400 mg·
kg －1)明显降低模型大鼠血清 ALT、AST 水平(P ＜
0. 05，P ＜ 0. 01) ，表明 TFLC具有肝脏保护作用(Fig
1a) ;模型组血清肝纤维化指标 HA、LN、PⅢNP、C
Ⅳ、Collagen Ⅰ及肝组织中 Hyp 与正常组比较明显
增加(P ＜ 0. 01) ，TFLC (200、400 mg·kg －1)明显降
低模型大鼠血清 HA、LN、PⅢNP、CⅣ、Collagen Ⅰ及
肝组织 Hyp水平(P ＜ 0. 05，P ＜ 0. 01) ，见 Fig 1b、c、
d、e;以上实验结果表明，TFLC对肝损伤及肝纤维化
大鼠具有预防作用。
3． 2 TFLC对 CCl4 诱导的肝纤维化大鼠病理形态
学影响 Masson染色结果显示，正常组肝组织结构
完整，肝细胞排列整齐;模型组肝组织有大量胶原纤
维沉积，纤维间隔粗大，形成假小叶;TFLC (200、
400 mg·kg －1)明显减轻纤维沉积，纤维间隔变窄，
表明 TFLC可明显降低肝纤维化程度(Fig 2)。
Tab 1 Sequences of the primers used in the PCR measurements
Target mRNA Accession No Sequence (5-3) Product length(bp)
β-actin NM_031144
Sense:TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC
Antisense:ACGCAGCTCAGTAACAGTCCG
94℃ 40s;51℃ 40s;72℃ 1 min;35cycle
350
Ob-Rb U52966
Sense:TGCTCGGAACACTGTTAAT
Antisense:GAAGAGGACCAAATATCA
94℃ 40s;51℃ 1 min;72℃ 40s;32cycle
168
TGF-βR1 NM_012775
Sense:ATCCACGAAGACTACCAGTTGCCT
Antisense:CATTTTGATGCCTTCCTGTTGGCT
94℃ 40s;51℃ 40s;72℃ 1 min;32cycle
252
Smad3 NM_013095． 2
Sense:CCTACAGCCAGTCACCTACT
Antisense:TAGACAGCCTCAAAGCCCTG
94℃ 40s;52℃ 40s;60℃ 1 min;35cycle
342
Nucleotide sequence of primers used for RT-PCR． Position is defined as the 5 -nucleotide of the respective primer related to the source sequence．
·7661·中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2012 Dec;28(12)
3． 3 TFLC 对 CCl4 诱导的肝纤维化大鼠血清
Leptin、TGF-β1 的影响 模型组瘦素和 TGF-β1 含
量明显增加(P ＜ 0. 01) ，TFLC (200、400 mg·kg －1)
明显降低模型大鼠血清瘦素和 TGF-β1 的含量(P ＜
0. 05，P ＜ 0. 01) ，见 Fig 3a、b。
3． 4 TFLC对 CCl4 诱导的模型大鼠 Ob-Rb、TGF-
βR1、Smad3 mRNA 与蛋白表达的影响 与正常组
相比，模型组肝组织中Ob-Rb、TGF-βR1、Smad3 mR-
Fig 1 Effects of total flavonoids of Litsea Coreana level on serum ala-
nine transaminase(ALT) ，aspartate aminotransferase(AST) ，hyalu-
ronic acid(HA) ，laminin，procollagen Ⅲ N-terminal peptide(PⅢNP)
and procollagenase IV(CIV) ，hydroxyproline，Collagen Ι and liver
Hyp contents in liver fibrosis rats． Each group consists of 10 rats(珋x ±
s)
＊＊P ＜ 0. 01 vs normal group． #P ＜ 0. 05，##P ＜ 0. 01 vs model group
Fig 2 Photomicrographs of liver sections stained with Massons trichrome(× 200)
A:Normal;B:Model;C:TFLC (100 g·L －1) ;D:TFLC (200 g·L －1) ;E:TFLC (400 g·L －1)
·8661· 中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2012 Dec;28(12)
Fig 3 Effects of total flavonoids of Litsea Coreana level on serum
Leptin and TGF-β1 level in liver fibrosis rats． Each group consists
of 10 rats (珋x ± s)
* P ＜ 0. 01 vs normal group． #P ＜ 0. 05，##P ＜ 0. 01 vs model group
NA及蛋白表达均明显增高(P ＜ 0． 01) ，TFLC (200、
400 mg· kg －1)可明显降低上述各项指标 (P ＜
0. 05，P ＜ 0. 01) ，见 Fig 4。表明 TFLC 预防肝纤维
化机制可能与降低 Ob-Rb、TGF-βR1、Smad3 表达有
关。
4 讨论
肝纤维化以 ECM 的过度沉积为特征。胶原蛋
白、蛋白多糖、非胶原性糖蛋白是构成 ECM 的 3 大
类物质［6］。HA 是构成 ECM 中蛋白多糖的主要成
分，LN为一种重要的糖蛋白，PⅢNP 与肝纤维化的
程度呈定量的明显相关关系，CⅣ可反映肝细胞损
伤、纤维化程度;Hyp 为胶原蛋白特有的氨基酸，在
肝组织其含量可反映胶原增生与纤维化程度，Ⅰ型
胶原是构成胶原蛋白的重要成分［7 － 8］，以上指标联
合检测对肝纤维化具有重要诊断价值。本研究中，
CCl4 诱导肝纤维化大鼠血清 HA、LN、PⅢNP、CⅣ、
Ⅰ型胶原及肝组织 Hyp 明显升高，TFLC(200、400 g
·L －1)可明显降低血清中升高的 HA、LN、PⅢNP、C
Ⅳ、Ⅰ型胶原及肝组织中 Hyp 水平;病理形态学检
测发现，TFLC (200、400 mg·kg －1)明显减轻纤维沉
积，纤维间隔变窄;以上实验结果表明，TFLC能够有
效预防 CCl4 诱导的大鼠肝纤维化。
研究证实:活化的肝星状细胞(hepatic stellate
cell，HSC)是肝纤维化 ECM的主要来源细胞。HSC
的活化、增殖是肝纤维化的关键事件，这一复杂的病
理过程是多条细胞信号传导通路和一系列细胞信息
Fig 4 Effects of total flavonoids of Litsea Coreana level on Ob-Rb，TGF-βR1，Smad3 mRNA and protein level in liver
fibrosis rats． mRNA and protein are corrected by β-actin(珋x ± s)
1:Normal，2:Model，3:TFLC (100 mg·kg －1) ，4:TFLC (200 mg·kg －1) ，5:TFLC(400 mg·kg －1) ;＊＊P ＜ 0. 01 vs normal group． #P ＜
0. 05，##P ＜ 0. 01 vs model group．
·9661·中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2012 Dec;28(12)
分子网络共同调控的结果，TGF-β1 是其必需的调节
因子［9］。在 TGF-β1 细胞内信号传导通路中，Smad
蛋白为关键的信号传导分子。研究显示:动物肝纤
维化往往伴随血清及组织 TGF-β1 增加，HSC 数量
进行性增多，Smad3 表达明显增高。在纤维化形成
过程中，瘦素可上调 TGF-β1。瘦素具有细胞因子特
性，与细胞表面的瘦素受体结合发挥生物学作
用［10］。Honda 等［11］在研究瘦素缺陷的小鼠(ob /
ob)和天然瘦素受体缺陷大鼠(fa / fa)发现，肝纤维
化明显被抑制，肝脏 α1(Ι)前胶原 mRNA 表达明显
降低，而且肝内 TGF-β1 和 HSC活化也被抑制;如果
补充瘦素至生理水平，ob /ob 小鼠可出现明显的肝
纤维化，并且肝内 TGF-β1 水平、α1(Ι)前胶原 mR-
NA 水平也明显提高;Leclercq 等［12］的研究也得出
同样的结果。提示瘦素可上调 TGF-β1 水平增强肝
纤维化的形成［13］。本实验发现，在 CCl4 诱导的大
鼠肝纤维化模型中，外周血瘦素和 TGF-β1 含量增
高;肝组织中 Ob-Rb、TGF-βR1、Smad3 mRNA 及蛋
白表达增强;而 TFLC对模型大鼠外周血瘦素、TGF-
β1 含量及组织中 TGF-βR1、Smad3、瘦素受体的表
达有明显的降低作用。以上结果表明，TFLC预防肝
纤维化的作用机制可能与下调瘦素及其受体，抑制
TGF-β1 /Smad通路有关。
参考文献:
［1］ 李 浩，李 俊，黄 成，等．瘦素及转化生长因子-β1 与四氯
化碳诱导大鼠肝纤维化模型逆转恢复的相关性研究［J］．中国
药理学通报，2011，27(4) :473 － 7．
［1］ Li H，Li J，Huang C，et al． Correlative research between leptin
and TGF-β1 and the recovery on CCI4 induced hepatic fibrosis in
rats［J］． Chin Pharmacol Bull，2011，27(4) :473 － 7．
［2］ 曹 琦，李 俊． 瘦素在肝脏疾病中的作用和分子机制［J］．
中国药理学通报，2004，20(9) :972 － 6．
［2］ Cao Q，Li J． Role of leptin in the pathogenesis of liver disease and
molecular m echanism of leptin s effects［J］． Chin Pharmacol
Bull，2004，20(9) :972 － 6．
［3］ Wang J Q，Li J，Zou Y H，et al． Preventive effects of total fla-
vonoids of Litsea coreana leve on hepatic steatosis in rats fed with
high fat diet［J］． J Ethnopharmacol，2009，121(1) :54 － 60．
［4］ 王媛媛，李 俊，曹 琦，等． 豹皮樟总黄酮对大鼠酒精性脂
肪性肝炎的防治作用及部分机制［J］． 安徽医科大学学报，
2007，42(2) :179 － 82．
［4］ Wang Y Y，Li J，Cao Q，et al． The protective and therapeutic
efects of total flavonoids of Litsea coreana level on alcoholic steato-
hepatitis and its mechamsms［J］． Acta Univ Med Anhui，2007，42
(2) :179 － 82．
［5］ 朱鹏里，李 俊，张 磊，等． 豹皮樟总黄酮抗肝纤维化作用及
对肝组织中 TGF-β1、CTGF mRNA表达的影响［J］． 安徽医科
大学学报，2009，44(2) :232 － 6．
［5］ Zhu P L，Li J，Zhang L，et al． Effect of total falvonoids of Litsea
coreana level on hepatic fibrosis and expression of TGF-β1，CTGF
mRNA in liver［J］． Acta Univ Med Anhui，2009，44(2) :232 － 6．
［6］ 黄 艳，黄 成，李 俊． 肝纤维化病程中 Kupffer细胞分泌的
细胞因子对 肝星状细胞活化增殖、凋亡的调控［J］． 中国药理
学通报，2010，26(1) :9 － 13．
［6］ Huang Y，Huang C，LI J． Effect of cytokines secreted from
Kupffer cell on HSC proliferation，apoptosis in hepatic fibrosis
process［J］． Chin Pharmacol Bull，2010，26(1) :9 － 13．
［7］ 崔东来，姚希贤． 肝纤维化的血清学检测［J］． 世界华人消化
杂志，2000，8(6) :683 － 4．
［7］ Cui D L，Yao X X． Serodiagnosis of liver fibrosis［J］． World
Chin J Digestol，2000，8(6) :683 － 4．
［8］ Plebani M，Burlina A． Biochemical markers of hepatic fibrosis
［J］． Clin Biochem，1991，24(3) :219 － 39．
［9］ Tang L X，He R H，Yang G，et al． Asiatic acid inhibits liver fibro-
sis by blocking TGF-beta /Smad signaling in vivo and in vitro［J］．
PLoS One，2012，7(2) :e31350．
［10］ Leclercq I A，Farrell G C，Schriemer R，et al． Leptin is essential
for the hepatic fibrogenic response to chronic liver injury［J］． J
Hepatol，2002，37(2) :206 － 13．
［11］ Honda H，Ikejima K，Hirose M，et al． Leptin is required for fibro-
genic responses induced by thioaceta mide in the murine liver［J］．
Hepatology，2002，36(1) :12 － 21．
［12］ Leclercq I A，Field J，Farrell G C． Leptin-specific mechanisms for
impaired liver regeneration in ob /ob mice after toxic injury［J］．
Gastroenterology，2003，124(5) :1451 － 64．
［13］ Bertolani C，Marra F． Role of adipocytokines in hepatic fibrosis
［J］． Curr Pharm Des，2010，16(17) :1929 － 40．
Regulatory effects of Litsea Coreana level on the expressions of
Leptin and TGF-β1 to prevent the hepatic fibrosis in rats
HUANG Cheng1，MA Tao-tao1，LI Hao1，LI Zheng-tong1，ZHANG Sheng-peng1，DENG Zi-yu2，LI Jun1
(1． School of Pharmacy，Anhui Key Laboratory of Bioactivity of Natrual Products，Anhui Medical University，Hefei 230032，China;
2． Dept of Pharmacology，The Second Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230601，China)
Abstract:Aim To evaluate whether Litsea Coreana
level (TFLC)would have regulatory effects on the ex-
pressions of Leptin and TGF-β1 of hepatic fibrosis in
rats． Methods The liver fibrosis model rats were in-
·0761· 中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2012 Dec;28(12)
duced by injecting 50% CCl4(1 ml·kg
－1)twice a
week for 12 weeks． From the first week，all the thera-
peutic groups were treated with TFLC (100，200，400
mg·kg －1)and the colchicines (0. 1 mg·kg －1)re-
spectively． At the end of the twelfth week，the levels
of ALT，AST，HA，LN，PⅢNP，CIV，Collagen Ι，
Leptin，TGF-β1 in serum and Hyp in liver were meas-
ured． Masson staining was used to evaluate the degree
of hepatic fibrosis． The mRNA and protein expressions
of Ob-Rb，TGF-βR1 and Smad3 in liver were detected
by RT-PCR and Western blot． Results TFLC (200
and 400 mg·kg －1)treatment significantly reduced the
elevations of ALT，AST，HA，LN，PⅢNP，CIV，Col-
lagen Ⅰ，Leptin，TGF-β1 in serum and Hyp in liver．
In addition，TFLC treatment improved the morphologic
changes of hepatic fibrosis，suppressed expressions of
Ob-Rb，TGF-βR1，Smad3 in the liver fibrosis in rats．
Conclusions TFLC is able to ameliorate liver injury
and protect rats from liver fibrosis． This process may
be related to inhibiting the expression of Ob-Rb，TGF-
βR1 and Smad3．
Key words:liver fibrosis; total flavonoids of Litsea
Coreana level (TFLC) ;leptin;OB-Rb;transforming
growth factor-beta1;TGF-βR1
网络出版时间:2012 － 11 － 19 17:18 网络出版地址:http:/ /www． cnki． net /kcms /detail /34． 1086． R． 20121119． 1718． 010． html
穿透性 Sox2 蛋白的质粒构建及功能鉴定
丁道芳1，王 瑧2，李晓锋1，徐乐勤1，梁倩倩1，王拥军1
(1．上海中医药大学龙华医院脊柱病研究所，上海 200032;2．复旦大学肿瘤医院中心实验室，上海 200433)
doi:10． 3969 / j． issn． 1001 － 1978． 2012． 12． 010
文献标志码:A 文章编号:1001 － 1978(2012)12 － 1671 － 04
中国图书分类号:R-332;R329． 24;R341;R394． 2
摘要:目的 构建具有细胞性穿透性的 9R-Sox2 蛋白的重组
质粒，使其在 293T细胞中表达，并对所表达的 9R-Sox2 蛋白
的功能进行鉴定。方法 从小鼠胚胎干细胞中扩增 Sox2 基
因，并且在其 N端加上 9 个精氨酸短肽，此融合基因连接到
pPYCAG载体上，pPYCAG-9R-Sox2 和 pPYCAG 分别转染到
293T细胞中。3 d后，对转染细胞用嘌呤霉素筛选，1 周后筛
选得到阳性克隆细胞株，对其进行细胞免疫荧光鉴定。表达
9R-Sox2 蛋白的细胞株进行裂解，取细胞裂解液加入至小鼠
胚胎成纤维细胞的培养基中进行通透。48 h后，小鼠胚胎成
纤维细胞进行细胞免疫荧光检测，并提取蛋白 Western blot
检测 PCNA表达。结果 用 Sox2 抗体进行细胞免疫荧光鉴
定，结果均显示所有细胞表达 9R-Sox2。在细胞裂解液处理
的成纤维细胞，细胞免疫荧光结果显示 9R-Sox2 蛋白定位在
收稿日期:2012 － 08 － 15，修回日期:2012 － 09 － 29
基金项 目:国 家 基 础 研 究 计 划 (973 计 划)资 助 项 目 (No
2010CB530400) ;国家自然科学基金重点项目(No
30930111) ;长江学者计划(Teach people［2009］17) ;
上海创新团队项目 (No 08YZ56) ;曙光计划 (No
10GG20) ;上海高校创新团队项目(Shanghai Education
Commission，Division 6［2009］)．
作者简介:丁道芳(1979 －) ，女，博士，助理研究员，研究方向:中医
骨伤科学，E-mail:051101049@ fudan． edu． cn;
王拥军(1964 －) ，男，博士，教授，研究方向:中医骨伤科
学，通讯作者，E-mail:yjwang88@ hotmail． com
细胞核，表明 9R-Sox2 构建和翻译正确。同时经含 9R-Sox2
的细胞裂解液处理的成纤维细胞，PCNA 表达明显上调。结
论 成功构建表达 9R-Sox2 融合蛋白的 pPYCAG-9R-Sox2 重
组质粒，并证明具有细胞通透及促细胞增殖功能。
关键词:穿透性;9R-Sox2;细胞免疫荧光;Western blot;增
殖细胞核抗原;小鼠胚胎成纤维细胞
诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，
iPS cells)最初由日本科学家于 2006 年利用病毒载
体将 Oct4、Sox2、Klf4 和 c-Myc 4 个转录因子的组合
转入体细胞中，使其重编程而得到的类似胚胎干细
胞的一种细胞［1］。进一步的研究发现转录因子
Sox2 和 Oct4 是诱导 iPS 细胞生成的必要的转录因
子［2］。
iPS 细胞将有希望成为病人治疗用靶细胞来
源，因此其安全性成为首要关注问题，其次效率也是
目前研究的重点之一。目前获得 iPS 细胞大多采用
病毒的方式，此种方法可以有效的得到 iPS 细胞，但
同时由于病毒的引入增加致癌的风险。在此基础
上，出现修饰性 Sox2 和 Oct4 蛋白，即在 Sox2 等基因
的 C末端加 9 ～ 11 个精氨酸肽，再将这些蛋白纯化
或者细胞的裂解物加入到细胞培养基中，这些已经
修饰后的蛋白肽可以直接进入细胞，从而将这些体
细胞转变成 iPS细胞［3 － 4］。蛋白转导的方式可以规
避这些风险，但这些蛋白的活性及效率也将成为问
·1761·中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2012 Dec;28(12) :1671 ～ 4