全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 22 期 2013 年 11 月

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• 药材与资源 •
不同产地老鹳草遗传多样性 ISSR 分析
尹海波 1，王吉华 1，涂秀文 1，朱明慧 1，姜海燕 1，钟 鸣 2
1. 辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110847
2. 辽宁省农业生物技术重点实验室，辽宁 沈阳 110866
摘 要：目的 从 DNA 水平对老鹳草种质进行遗传多样性分析，并建立老鹳草稳定的 ISSR-PCR 反应体系。方法 采用正
交试验设计及单因素梯度优化相结合的方法确定老鹳草 ISSR-PCR 反应体系，对我国 20 个主要分布区的老鹳草进行
ISSR-PCR 扩增与检测，扩增结果转化为“0”、“1”矩阵后，利用 Popgene32 及 Ntsyspc-2.1 软件对数据进行处理计算遗传距
离，并采用 UPGMA 聚类法构建亲缘关系树状图。结果 15 条引物共得到 207 条清晰可辨的扩增条带，其中有 197 条呈现
多态性，占 94.6%，遗传距离变化范围在 0.201 8～0.939 4。20 份样品分为 2 大类，聚类较为复杂，大多种质遗传多样性与
地理位置及生态环境具有一定的关系。结论 我国老鹳草植物的遗传多样性十分丰富，为筛选优质种质奠定了遗传基础。
关键词：老鹳草；ISSR；遗传多样性；正交试验；多态性
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2013)22 - 3206 - 06
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2013.22.020
ISSR analysis on genetic diversity of Geranium wilfordii from different habitats
YIN Hai-bo1, WANG Ji-hua1, TU Xiu-wen1, ZHU Ming-hui1, JIANG Hai-yan1, ZHONG Ming2
1. Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110847, China
2. Key Laboratory of Agriculture Biotechnology Liaoning Province, Shenyang 110866, China
Abstract: Objective To analyze the genetic diversity of Geranium wilfordii from different habitats at DNA molecular level and to
establish the ISSR-PCR system of G. wilfordii. Methods Using orthogonal design test combined with the single factor gradient
optimization method, the geranium ISSR-PCR system of G. wilfordii was determined. G. wilfordii from 20 germplasmic resources was
amplified and analyzed by ISSR-PCR. After translating the amplification results into “0” and “1” matrix, the genetic distances were
calculated by Popgene32 and Ntsyspc-2.1 software and the systematic diagram of genetic relationship was clustered by UPGMA
method. Results A total of 207 bands were detected using 15 primers, among which 197 (94.6%) were polymorphic bands. The
genetic distances were changed from 0.201 8 to 0.939 4. The genetic relationship of G. wilfordii was more complex. The 20 samples
were divided into two kinds, and the correlation between the most germplasm and its geographic origin had a certain relationship.
Conclusion The significant polymorphism and genetic diversity are observed among G. wilfordii germplasm resources which could
provide a wealth of genetic basis for the germplasm high quality.
Key words: Geranium wilfordii Maxim.; ISSR; genetic diversity; orthogonal test; polymorphism

老鹳草属于我国传统中药，为牻牛儿苗科植物牻
牛儿苗Erodium stephanianum Willd.、老鹳草Geranium
wilfordii Maxim. 或野老鹳草 G. carolinianum L. 的干
燥地上部分，前者习称“长嘴老鹳草”，后两者习称
“短嘴老鹳草”[1]。其中老鹳草为药材主要来源，在我
国河北、江苏及东北三省等地均有分布。目前有关老
鹳草的研究多集中于化学成分分析、分离及临床应用
等方面，鲜见 DNA 分子水平的研究。
ISSR 分子标记是利用真核生物基因组广泛存
在的简单重复序列（SSR）设计引物（一般为 16～
18 个碱基序列），无需克隆和测序，扩增产物经聚
丙烯酰胺凝胶或较高浓度的琼脂糖凝胶电泳分离获

收稿日期：2013-05-28
基金项目：辽宁省教育厅资助项目（2009A498）；杏林青蓝工程杰出人才基金（115065）
作者简介：尹海波（1973—），辽宁沈阳人，教授，硕士生导师，主要研究方向为种质资源鉴定及中药的品质评价。
Tel: 15998530628 (0411)87586004 E-mail: yhb0528@sina.com
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得扩增指纹图谱，而本实验 PCR 产物片段大小在
10 bp 以上，应用琼脂糖凝胶电泳分离，其 DNA 模
板用量少，多态性丰富，实验稳定性高，多应用于
显性标记，现在广泛应用于种质资源鉴定、遗传多
样性、分子标记育种等多方面[2]。
本研究以来源于我国不同分布区的 20 份老鹳
草种质为实验材料，采用 ISSR 分子标记方法[3]，以
PCR 技术为基础对其进行遗传多样性研究，旨在探
讨我国老鹳草地理种源的遗传变异特点，为该药材
种质资源的进一步收集利用及新种质的筛选提供分
子水平上的参考依据。
1 材料与仪器
1.1 材料
20 份老鹳草 Geranium wilfordii Maxim. 种质资
源，分别采自辽宁、吉林、黑龙江、河北、北京、山
东等地（表 1），由辽宁中医药大学药学院药用植物教
研室王冰教授鉴定，凭证标本保存于辽宁中医药大学
药学院药用植物教研室。根据均匀分布、随机取样的
原则，每个产地均选取 10 株成熟植株，在植株上采
集当年萌发的幼嫩叶片，硅胶干燥后置低温干燥处保
存。ISSR 引物参考加拿大UBC 大学提供的引物序列，
由北京赛百盛生物工程技术服务有限公司合成。
表 1 样品来源信息
Table 1 Information of sample sources
编号 产 地 经度 (E) 纬度 (N) 海拔 / m 生长环境
1 辽宁沈阳北陵 123°42′ 41°85′ 55.3 林下草丛
2 山东潍坊 118°30′ 36°45′ 525.3 山坡林缘草丛
3 河北承德 117°61′ 40°43′ 827.2 林下草丛
4 吉林集安 125°89′ 41°52′ 453.6 山坡
5 辽宁抚顺新宾 125°03′ 41°71′ 374.8 林下草丛
6 辽宁昌图县 124°11′ 42°74′ 142.9 林下草丛
7 北京延庆 115°83′ 40°50′ 770.6 林下草丛
8 辽宁大连庄河冰峪沟 122°97′ 39°98′ 234.6 林下草丛
9 山东烟台 121°72′ 37°26′ 264.8 林下草丛
10 辽宁大连庄河天门山 122°90′ 41°14′ 367.8 林下草丛
11 辽宁沈阳东陵 123°59′ 41°83′ 92.8 林下草丛
12 河北围场 117°75′ 41°93′ 844.1 林下草丛
13 辽宁本溪桓仁 125°52′ 41°33′ 375.0 林下草丛
14 吉林白山 126°50′ 41°64′ 349.9 林下草丛
15 吉林敦化 127°85′ 42°78′ 551.2 林下草丛
16 吉林长白 127°27′ 41°50′ 842.0 路边草丛
17 吉林通化 125°94′ 41°73′ 370.9 林下草丛
18 吉林临江 126°74′ 41°75′ 432.5 林缘草丛
19 黑龙江尚志 127°66′ 45°40′ 439.3 林下草丛
20 吉林延吉 129°16′ 43°13′ 375.9 路边草丛

1.2 试剂
PCR 反应相关试剂购自天根生化科技（北京）
有限公司。
1.3 仪器
数显恒温水浴锅 HH—6（国华电器有限公司），
台式高速离心机 D—78532 Tuttlingen（德国 Hettich
公司），BIO-RAD PTC—200 型 PCR 仪（德国），
NanoDrop 微量分光光度计（ND—1000）BFQ，
PALLPL5243 超纯水仪，MP 200A 分析天平，
BIO-RAD 凝胶成像分析仪等。
2 方法
2.1 DNA 基因组提取与检测
采用天根生化科技有限公司植物基因组 DNA
提取试剂盒（目录号：DP305）提取药材 DNA，其
DNA 浓度和纯度经 NanoDrop 微量分光光度计
（ND—1000）BFQ[4]，并用 1%琼脂糖电泳检测，
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凝胶成像系统（GelDocTM，Bio-Rad）观察并照相，
用无菌双蒸水稀释到 10 ng/μL，−20 ℃冰箱保存。
2.2 ISSR-PCR 扩增及产物检测
ISSR-PCR 扩增在 Bio-Rad PTC—200 型 PCR
仪上进行。ISSR-PCR 反应体系：20 μL 反应体系
中含有引物浓度 0.3 μmol/L，Taq 酶浓度 0.5 U，
dNTP 0.3 mmol/L，Mg2+浓度 2.4 mmol/L，DNA
模板 30 ng；ISSR-PCR 扩增程序：94 ℃预变性 5
min，36 个循环：94 ℃变性 30 s，52 ℃退火 1 min，
72 ℃延伸 90 s，完成最后一个循环后，72 ℃延
伸 7 min，4 ℃保存。扩增产物在含有溴化乙锭的
2%琼脂糖凝胶上电泳分离，当溴酚蓝指示剂距离
琼脂糖凝胶前沿 1～2 cm 时，停止电泳，在紫外
凝胶成像系统观察照相并记录实验结果。
2.3 引物的筛选
利用所提取的基因组 DNA，随机选用 11、14 号
种质作为 PCR 反应模板对 100 条引物进行筛选，从中
选出 15 条扩增产物多态性好、背景清晰、反应稳定的
引物用于全部样本的 ISSR 分析，部分引物筛选见图 1。
2.4 数据处理
ISSR 标记数据统计将反映在电泳图谱上，不同

1～12-UBC835、UBC841、UBC842、UBC855、UBC857、UBC886、
UBC887、UBC840、UBC847、UBC848、UBC893、UBC894
图 1 引物筛选
Fig. 1 Primers selection
产地同一位点出现的清晰条带记为“1”，没有条带
则记为“0”，建立 0/1 数据矩阵。应用 Popgene32
软件计算其群体间遗传多样性参数、Shannon 信息
指数（I）、Nei’s 基因多样性指数（H）、遗传距离（GD）
及遗传一致性等；利用 NTsys2.10e 软件系统计算材
料间遗传相似系数（Gs），根据 Gs 值按不加权成对
群算术平均法（UPGMA）构建不同产地种质间亲
缘关系树状聚类图。
2.5 ISSR-PCR 反应程序的优化与建立
2.5.1 正交试验设计反应体系 按照 L9(34)正交表
形成 9 个组合的实验方案，随机选取 12、18 号种质
（河北围场、吉林临江）的 DNA 模板 30 ng，选取 2
条引物 UBC811、UBC857 进行 4 因素 3 水平的正
交试验，见表 2。
2.5.2 单因素试验 通过正交试验设计初选 PCR
反应体系最优条件的基础上，考察单因素是否对优
化后的条件有影响。随机选取辽宁大连产种质进行
单因素试验，分别对引物浓度、dNTP 浓度、Taq 酶、
Mg2+浓度、DNA 模板量进行设置，并通过验证性
试验考察反应体系的稳定性及不同产地种质对反应
条件的适应性。
2.5.3 PCR 扩增与产物检测 选用引物 UBC811、
UBC857 为 ISSR-PCR 反应体系优化的引物，反应
体系按照正交试验 L9(34)进行实验。扩增程序及产
物检测同“2.2”项所述方法。
3 结果与分析
3.1 老鹳草 ISSR-PCR 反应体系的建立
3.1.1 正交试验结果 分别用河北围场、吉林临江
产的材料对应引物UBC811、UBC857进行正交试验，
其结果以河北围场为例，见图 2。从图中可以看出 4
号实验方案使药材在不同引物中的扩增效果最好，
表 2 正交试验 L9 (34)
Table 2 L9 (34) Orthogonal test
因素 序号 引物浓度 / (μmol·L−1) Taq 酶用量 / U dNTP 浓度 / (mmol·L−1) Mg2+浓度 / (mmol·L−1)
1 0.1 0.5 0.1 1.2
2 0.1 1.0 0.3 1.8
3 0.1 1.5 0.5 2.4
4 0.3 0.5 0.3 2.4
5 0.3 1.0 0.5 1.2
6 0.3 1.5 0.1 1.8
7 0.5 0.5 0.5 1.8
8 0.5 1.0 0.1 2.4
9 0.5 1.5 0.3 1.2
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
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图 2 正交设计 ISSR-PCR 反应体系扩增结果
Fig. 2 Amplification of ISSR-PCR system
by orthogonal design
其中 7 号实验方案在引物最好，其中 UBC857 中扩
增效果明显，但不适用于引物最好，其中 UBC811，
所以从实验的适应性看，方案 4 为最佳反应体系。
3.1.2 单因素试验结果 PCR 扩增条带随引物、
dNTP 浓度、Taq 酶浓度增加而变清晰明亮，DNA
模板加样量对反应无明显影响，Mg2+浓度与正交试
验结果一致。验证性试验：采用单因素试验结果对
4 号实验方案进行优化，优化后的实验方案为引物
浓度 0.3 μmol/L，Taq 酶浓度 1.25 U，dNTP 0.3
mmol/L，Mg2+浓度 2.4 mmol/L，从图 3 可以看出，
优化后的实验方案不稳定，适应性不强，而 4 号实
验方案稳定且条带清晰，最终选择原方案进行 PCR
实验的扩增。
3.2 基因组 DNA 扩增产物的多态性分析
本实验筛选出 15 条谱带清晰、重复性及稳定性
好，多态性显著的引物用于全部 DNA 样品的 ISSR

引物浓度泳道 1～5-0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 / μmol·L−1
Taq 酶泳道 1～5-0.25、0.5、0.75、1.0、1.25 U
dNTP 浓度泳道 1～5-0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mmol·L−1
Mg2+浓度泳道 1～5-1.2、1.5、1.8、2.1、2.4 mmol·L−1
DNA 模板量 1～5-10、20、30、40、50 ng
primer with different concentration 1—5: 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 μmol·L−1
Taq polymerases levels 1—5: 0.25, 0.5, 0.75, 1.0, 1.25 U
dNTP concentration 1—5: 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 mmol·L−1
Mg2+ concentration 1—5: 1.2, 1.5, 1.8, 2.1, 2.4 mmol·L−1
template DNA concentration 1—5: 10, 20, 30, 40, 50 ng
图 3 单因素不同梯度对 ISSR-PCR 反应的影响
Fig. 3 Effect of single factor at different gradients
on ISSR-PCR
多态性检测，部分引物（UBC857、UBC813）扩
增结果见图 4、5。根据 ISSR 扩增条带统计结果
（表 3）可以看出 15 条引物共扩增出 207 条 DNA
片段，其相对分子质量在 250～2 000 bp，其中多
态性条带 197 条，多态性百分率为 94.6%，不同
引物扩增出的清晰条带数在 7～22 条，平均每个
引物扩增出的片段条数为 13.8 条，扩增的多态性
条带数为 6～21 条，每个引物的多态性百分率为
80%～100%，平均每个 ISSR 引物扩增出的多态
性条带数目为 13.1 条。条带最多的是引物
UBC886，共 22 条；条带最少的是引物 UBC811，
共 7 条；其中引物 UBC807、UBC810、UBC813、
UBC817、UBC841、UBC842、UBC849、UBC887
多态率高达 100%。其种群间平均 H 和 I 分别为
0.423 和 0.611。从统计数据上可以看出老鹳草不
同种质之间 ISSR 多态性水平较高。
3.3 遗传多样性和聚类分析
根据 Gs 的计算方法，从而得到 ISSR 标记扩增
产物结果的相似性系数矩阵并结合 UPGMA 法，建
立老鹳草种质资源的亲缘关系树形图（图 6）；20
个老鹳草种质之间的遗传一致度（genetic identity）变
化范围在 0.411 2～0.812 7，GD 变化范围在 0.201 8～
0.939 4；其中同来源于辽宁的 5 与 6 之间遗传距离最
小，为 0.201 8，其次是 2 与 3（0.220 6），12 与 20
遗传距离最大为 0.939 4，其次 5 与 13（0.888 8）。
通过实验结果提示相同产地的不同老鹳草种质之间

图 4 引物 UBC857 对 20 份老鹳草样品的扩增谱带
Fig. 4 Amplification bands of 20 batches
of G. wilfordii by Primer UBC857

图 5 引物 UBC813 对 20 份老鹳草样品的扩增谱带
Fig. 5 Amplification bands of 20 batches
of G. wilfordii by Primer UBC813
M 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 M 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 M1 2 3 4 5 M
引物浓度 Taq酶浓度 dNTP浓度 Mg2+浓度 DNA加样量 验证结果

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
引物 UBC811 引物 UBC857
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
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表 3 ISSR 引物扩增结果及多态性
Table 3 Amplification results and polymorphism of ISSR primers
引物 5’-3’DNA 片段 DNA 谱带数 多态性条带数 多态位点比率 / % H I
UBC807 (AG)8T 12 12 100 0.423 0.608 0
UBC810 (GA)8T 15 15 100 0.449 0.640 0
UBC811 (GA)8C 7 6 85.7 0.425 0.615 0
UBC813 (CT)8T 15 15 100 0.411 0.598 0
UBC817 (CA)8A 12 12 100 0.430 0.618 0
UBC834 (AG)8YT 13 12 92.3 0.440 0.629 0
UBC841 (GA)8YC 9 9 100 0.382 0.566 0
UBC842 (GA)8YG 12 12 100 0.344 0.520 2
UBC847 (CA)8RC 15 12 80.0 0.461 0.653 0
UBC848 (CA)8RG 9 8 88.9 0.400 0.585 0
UBC849 (GT)8YA 20 20 100 0.374 0.556 0
UBC857 (AC)8YG 16 15 93.8 0.440 0.631 0
UBC886 VDVCTCTCTCTCTCTCT 22 21 95.5 0.442 0.562 0
UBC887 DVDTCTCTCTCTCTCTC 18 18 100 0.453 0.644 0
UBC891 CCGACTCGAGNNNNNN
ATGTGG
12 10 83.3 0.453 0.644 0
平均 13.8 13.1 94.6 0.423 0.611 0
R (A/G), Y = (C/T), V = (G/A/C), D = (G/T/C), N = (A/G/C/T)

图 6 20 份老鹳草样品的聚类结果
Fig. 6 Clustering results of 20 batches of G. wilfordii
具有较近的亲缘性并同时存在着一定的遗传变异
性；不同产地老鹳草种质之间的遗传距离较大，但
个别地理距离较远的样品间遗传距离却较近，提示
可能由于我国气候复杂多样，雨热同期[5]以及资源
所处生态环境不同等因素的影响，造成不同种质之
间具有较高的遗传一致性。
通过亲缘关系树形图可见，20 个种质主要聚为
2 大类，7、12、9、14 号种质为一类与上述分析具
有一致性；其余种质来源聚为一类，其中 4（吉林）、
5、6、10、11、8 号聚为一亚类以辽宁为主，4 号地
理位置、生态环境与 5、6 号近似聚为一小类，1～3
号、15～20 号聚为一亚类，1、2、3 号聚为一小类，
2（山东）、3（河北）号地理位置接近生态环境相似
而聚为一小类，15～20 号聚为一小类，13 号单为一
类。通过聚类分析可以看出不同产地老鹳草种质间
的遗传多样性与地理位置及生态环境具有一定的关
系，居群间地理位置差异越大，其遗传信息差异相
对越大，虽然存在少数特例，但仍遵循相对普遍的
遗传规律。
4 讨论
4.1 PCR 反应的确定
PCR 反应易受反应体系、扩增程序及循环周期
等因素的影响[6]。引物浓度一般控制在 0.2～1.0
μmol/L，在 25 μL 反应体系中，DNA 聚合酶用量一
般在 0.125～1.25 U，当引物浓度过高时产生的非特
异性产物及引物二聚体会与靶序列竞争 DNA 聚合
酶和 dNTP 底物，从而使特异性产物扩增量降低；
dNTP 浓度过高易导致错误掺入，过低则降低产率；
Mg2+能够增强蛋白酶的稳定性，过低则降低酶活
性，过高则酶催化非特异性条带的扩增[7-9]，同时与

1
2
3
15
16
17
18
19
20
13
4
5
6
10
11
8
7
12
9
14
0.53 0.61 0.69 0.77 0.85
遗传距离
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dNTP 具有一定的相关性，Mg2+至少应比 dNTP 总
浓度高出 0.2～2.5 mmol/L 为宜。
4.2 退火温度考察
通过设置 PCR 仪，使退火温度在 8 排实验槽中
呈 50～60 ℃（A＝60 ℃，B＝59.4 ℃，C＝58.3 ℃，
D＝56.3 ℃，E＝53.9 ℃，F＝52 ℃，G＝50.7 ℃，
H＝50 ℃）梯度变化，A～D 退火温度较高，扩增
谱带特异性较差，非特异性产物条带明显，G、H
温度较低，扩增谱带弥散故不利于扩增反应，可以
看出 E、F 扩增谱带相对清晰，通过仔细观察与反
复实验并结合引物自身特点，最后选用 52 ℃为其
退火温度。
4.3 ISSR 引物选择及 DNA 模板应用
引物（G＋C）量在 40%～60%为宜，过低则引
物解链温度低，易于从模板上解离，扩增效果不佳，
过高则解链温度升高，易于与非特异性序列杂交出
现非特异性扩增条带；考虑到老鹳草种质间的遗传
差异性，及不同引物对不同种质 DNA 模板产生的
不同适应性，为了筛选得到稳定并具有一定普遍适
用性的引物，本实验随机选取 2 个来源的老鹳草种
质进行引物的筛选并最终确定了 15 条引物进行
ISSR-PCR 反应，选用了多个 DNA 模板，针对不同
的引物优化老鹳草 ISSR-PCR 反应体系，并最终建
立分辨率高、稳定性强、适用性好的反应体系。
近年来分子生物学技术广泛应用于农业及种植
业[10-11]，而随着中药资源开发利用的扩大化，对中
药资源的研究上升到分子领域，分子生物学技术开
始应用于药材的遗传多样性、亲缘关系[12-13]等方面
的研究，中药资源的多样性是我国生物多样性的重
要组成部分，其物种多样性及基因多样性，是其功
能、用途多样性的物质基础，是深度开发利用中药
资源的重要依据。
本实验以不同产地老鹳草种质为研究对象，侧
重于药材不同居群间的遗传多样性研究，并建立了
稳定性强、普遍适用性好的 ISSR-PCR 反应体系，
利用 ISSR-PCR技术对 20个老鹳草种质进行定性分
析，通过各引物对药材 DNA 模板的扩增情况来看，
不同居群间的老鹳草存在明显差异，并具有很高的
遗传多样性。在亲缘关系上，遗传距离越小，遗传
一致性越大，药材间的亲缘关系也就越近[14]，从聚
类结果可以看出老鹳草不同种质之间存在“大杂居，
小聚居”的遗传模式，与地理位置生态环境具有一
定的联系但不绝对，可能与药用植物本身对环境的
适应能力或药用植物通过遗传变异适应异质生境[5]
有关。
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