全 文 :中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 19 期 2013 年 10 月
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人参蛋白研究进展
王 逸 1,鲍勇刚 1, 2,贾韦国 3,刘新民 1*
1. 中国医学科学院北京协和医学院 药用植物研究所,北京 100193
2. 北京博肽健诺威生物技术有限公司,北京 100085
3. 加拿大不列颠哥伦比亚大学医学院,温哥华 V6T2B5
摘 要:人参作为一种名贵中药材,拥有悠久的药用历史。长期以来除对人参皂苷等少数几种物质进行广泛研究外,对人参
蛋白也进行了一定研究。已从人参根中分离纯化出具有重要生物学活性的多肽及蛋白质,以及重要生物合成酶蛋白并开展了
相应的人参代谢工程研究。人参根中差异蛋白的发现为人参蛋白研究、品质鉴定及质量控制提供参考。目前人参蛋白的研究
已逐渐成为人参研究的热点之一,就人参蛋白的研究进展进行了整理归纳,以期对人参蛋白的研究提供帮助。
关键词:人参;人参多肽;人参蛋白;蛋白差异;代谢工程
中图分类号:R282.1 文献标志码:A 文章编号:0253 - 2670(2013)19 - 2782 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2013.19.028
Research progress on ginseng proteins
WANG Yi1, BAO Yong-gang1, 2, JIA William 3, LIU Xin-min1
1. Institute of Medicinal Plant Development,Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College, Beijing
100193, China
2. Jiannuowei Biotechnology Co., Ltd., Beijing 100085, China
3. University of British Columbia, Vancouver V6T2B5, Canada
Key words: Panax ginseng C. A. Mey.; ginseng polypeptide; ginseng proteins; differences of proteins; metabolic engineering
人参 Panax ginseng C. A. Mey. 是国内外公认的
药用保健珍品,其属五加科(Araliaceae)人参属 Panax
L.,为多年生宿根草本植物,被誉为“百草之王”。
我国具有悠久的人参栽培及使用历史,《神农本草经》
记载人参:“补五脏、安精神、定魂魄、止惊悸、除
邪气、明目开心益智,久服轻身延年”。《本草纲目》
对人参更有详细记载:“补五脏血脉,益气生血,故
为强壮药,能振奋精神”。现代大量研究表明,人参
及其制品具有抗衰老[1-2]、抗肿瘤[3-4]、改善记忆力[5]、
增强免疫力[6-7]等作用;同时,对治疗心血管疾病[6,8]、
糖尿病[9]、脑部疾病[10]等均有很好的疗效。
人参根中成分复杂,迄今已知人参根中含有人参
皂苷、多糖、挥发油、脂肪酸、甾醇、维生素、蛋白
质、多肽等多种有效成分[11-12]。但目前的研究主要集
中于人参皂苷及挥发性成分上,蛋白质及多肽的研究
相对较少。本文从人参多肽,人参蛋白及不同生境人
参蛋白差异性等方面对目前人参蛋白的研究给予总
结,以期对后续深入研究人参蛋白有所帮助。
1 人参多肽
20 世纪 60 年代,德国科学家首次从人参中提
取分离出氨基酸及 5 个小肽[13],早期人参蛋白的研
究主要集中于人参多肽的提取方法及活性研究上。
20 世纪 80 年代初,日本学者[14]从人参中发现
能强烈抑制肾上腺素诱导脂肪分解的 14 肽,但未进
行一级结构鉴定;之后,韩国学者[15]和中国学者[16]
分别从人参中分离得到具有抗脂肪分解活性的寡肽
以及胰岛素样的 14 肽。20 世纪 90 年代后,对人参
多肽进行了更加广泛深入的研究。1990 年 Takaku
收稿日期:2013-05-05
基金项目:国际合作专项——人参益智药效与基因/蛋白表达谱关联规律合作研究(2011DFA32730);航天医学基础与应用国家重点实验室开
放基金——模拟失重认知功能受损动物模型的建立(SMFA10K01);全军医学科技“十二五”科研项目——中长期航天飞行所致应
激损伤评价与防护关键技术研究(BWS11J052)
作者简介:王 逸(1987—),女,北京协和医学院在读硕士研究生,研究方向为神经药理学。E-mail: wangyi3394@126.com
*通信作者 刘新民(1962—),男,研究员,博士生导师。E-mail: liuxinmin@hotmail.com
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等[17]从高丽红参中得到一种名为焦谷氨酸的酸性
物质,认为该物质能抑制肾上腺素诱导的脂肪分解
并能刺激胰岛素参与的脂肪合成。王本祥等[18]从人
参中分离得到了具有抗脂质分解及降低血糖和肝糖
作用的多肽。魏俊杰等[19]采用二乙氨乙基(DEAE)
纤维素色谱和 HPLC 法从人参中分离得到 1 个 11
肽及1个12肽,这2种肽具有降低二倍体细胞(2BS)
内多糖量和增强该细胞内琥珀酸脱氢酶活力的作
用。朱苗力等[20]采用黄金分割法并经 EDEPP/2 程序
计算得到人参 14 肽的最低构象能,并得到最低构
象能下的人参 14 肽构象由 β-折叠及 α-螺旋肽段构
成。1996 年,外国研究人员从人参中分离得到 1
种具有强烈金属结合活性的 15 肽,并确定该肽的
一级结构[21]。1998 年,Chen 等[22]从人参中分离出
6 种含 α 氨基酸的小肽,实验证明该物质具有调节
动物睡眠的作用。2005 年,腾宇等[23]从鲜人参的醇
溶蛋白中,分离得到人参多肽,其质量分数在 95%
以上,相对分子质量介于 3.5×103~1×104。
2 人参蛋白
2.1 人参蛋白的分类及活性
随着现代生物技术在中药领域的广泛应用,进
入 21 世纪后人参蛋白的研究日益增多。应用二维
电泳技术现已发现人参中共有蛋白 300 多种,其中
仅有不足五分之一的蛋白被报道[24-25],其中包括:
(1)类 RNA 酶蛋白。类 RNA 酶蛋白是人参的主
要蛋白(ginseng major protein,GMP),该酶相对
分子质量为 2.8×104,其氨基酸序列与植物的 RNA
酶具有高度同源性[26]。二维电泳分析显示 GMP 的
量随季节的变化而变化,因此这一蛋白也被认为是
人参的储存蛋白。该酶具有抗真菌、抗病毒和转录
抑制活性[27]。(2)核糖核酸酶。Lam 等[28]从人参
根中分离得到 1 种由 2 个相对分子质量为 2.7×104
和 2.9×104 的亚基组成的非耐热核糖核酸酶,其具
有抗真菌、抗病毒和抑制增殖的活性。随后他们又
从人参花蕾中分离得到 1 种相对分子质量为 2.3×
104 的核糖核酸酶,但却没有抗真菌、抗病毒和抑
制增殖的活性[29]。Gennady 等[30]也从人参愈伤组
织中分离得到 2种相对分子质量都为 1.8×104的核
糖核酸酶。(3)皂苷合成相关酶。从人参中分离的
皂苷 β-葡萄糖苷酶相对分子质量为 5.9×104,能水
解人参皂苷 Rg3,得到抗癌物质人参皂苷 Rh2[31]。
(4)几丁质样蛋白。该蛋白相对分子质量为 1.5×
104,具有抗真菌功能[32]。(5)木聚糖酶。从人参
根部提取的木聚糖酶相对分子质量只有 1.5×104,
具有人工型免疫缺陷病毒转录抑制活性[33]。
近几年国内学者在人参水溶性蛋白提取分离及
活性研究方面做了很多有益工作。侯元等[34]采用薄
层等电聚焦技术,分离鉴定人参水溶性蛋白,发现
24 条电泳谱带。张巍等[35]利用生物化学方法从人参
中提取纯化出相对分子质量为 6.58×104、6.55×
104、2.47×104、1.51×104、7.6×103的 5 种水溶性
人参蛋白。之后,姜先刚等[36]使用 SDS-PAGE 指纹
图谱技术对人参药材的水溶性蛋白进行分析鉴定,
结果表明该技术稳定性、重复性和精密度良好,适
用于人参药材的质量评价。此外,研究发现用不同
方法提取纯化的人参水溶性蛋白具有调血脂[37]、抗
疲劳[38]、抗辐射[39]、增强小鼠免疫力[40]及抑制人喉
癌 Hep-2 细胞增殖的作用[41]。
2.2 人参蛋白代谢工程
人参蛋白酶的代谢工程研究也是人参蛋白研究
的热点之一。人参皂苷是人参主要的药理活性成分,
属于三萜类化合物,对其生物合成途径目前已有初
步的认识,因此提高人参皂苷量,针对皂苷合成代
谢过程中主要酶类的皂苷生物合成研究成为重点。
Lee 等 [42]通过人参叶 cDNA 文库表达序列标签
(EST)分析分离出鲨烯合成酶(SS)全长 cDNA
克隆基因 PgSS1,转基因人参中过度表达的 PgSS1
增强了 PgSS1 酶的活性,导致人参中植物固醇和人
参皂苷量显著增加。达玛烷合酶(DS)被认为是最
重要的人参皂苷生物合成酶,转基因人参中 RNA
干扰 DS 可沉默 DS 的表达,从而导致了人参根中
皂苷产量减少至 84.5%。Han 等[43-44]通过过量表达
人参皂苷的转基因人参实验确定1种细胞色素P450
(CYP)酶基因 CYP716A47,体外活性研究发现其
可以氧化达玛烯二醇-II 生成原人参二醇。到目前为
止,仅对人参中 SS、DS、β-香树酯合酶(β-AS)
和环阿屯醇合酶(CS)有所研究。此外,人参不同
组织的 cDNA 文库的 EST 分析[45]结果显示,与人参
皂苷生物合成有关的候选基因编码的酶有:3-羟基-3-
甲基戊二酸单酰辅酶 A 还原酶(HMGR)、铁氧还
原蛋白还原性物质(ferredoxin-reducing substance,
FRS)、香叶基二磷酸合酶、CYP、糖基转移酶、β-
葡萄糖苷酶和羽扇豆醇合酶(LUS)。
2.3 人参蛋白差异表达
2.3.1 不同产地人参蛋白差异表达 随着人参的深
度开发和应用,人参种植面积不断增加,但不同产
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地人参的质量参差不齐,必将影响和限制人参产业
的健康发展。通过现有技术手段鉴别不同产地人参
蛋白的差异,为人参产品的深加工和科学研究提供
参照,也可成为人参质量鉴别的有效手段。
1992 年,侯元等[34]采用薄层等电聚焦技术鉴定
人参水溶性蛋白,发现量较高的蛋白等电点(PI)
值在 4~7。同年,曹立亚等[46]采用同一技术对冻干
参、鲜参、生晒参及红参中水溶性蛋白进行了比较
分析,结果表明,在 pH 4.5~5.6 内,冻干参与鲜参
蛋白几乎相同,生晒参蛋白量稍低,红参蛋白量最
低且谱带几乎没有区别。姜先刚等[36]使用十二烷
基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)指纹
图谱技术对人参水溶性蛋白进行分析鉴定,幺宝金
等[47]也采用这一技术对园参、野山参、西洋参中水
溶性蛋白成分进行比较研究,结果表明 3 种人参水
溶性蛋白的SDS-PAGE图谱及凝胶分析图谱存在很
大差异,可以通过这一技术对园参、野山参、西洋
参进行鉴别和质量评价。白雪媛等[48]针对长白山区
15 个不同产地人参中水溶性蛋白成分的量进行比
较研究,结果表明不同产地人参中水溶性蛋白的
SDS-PAGE 电泳谱带条数无明显差别,主要谱带为
13 条,但因浓度的不同而引起的谱带的指纹信息差
异较大。而霍艺丹等[49]采用凯氏定氮法研究人参粗
蛋白量随海拔高度的变化规律,结果显示同一海拔
同一地区 4 年生人参粗蛋白量高于 5 年生。海拔
127~305 m 人参粗蛋白量随海拔升高而降低;海拔
400~600 m 人参粗蛋白量随海拔升高而增加;海拔
700~1 410 m 人参粗蛋白量随海拔的升高而降低。
这些都表明不同的生长条件和环境下人参将诱导表
达不同的蛋白质。
2.3.2 不同酶类人参蛋白的差异表达 以赵雨研究
员为首的国内研究者,近几年对人参酶活性变化进
行大量研究。人参不同部位的超氧化物歧化酶
(SOD)活力不同,其中以芦头最高、主根次之,须
根最低[50]。山参、园参、西洋参中以山参的 SOD
酶活力最高,红参中 SOD 酶活力几乎为零[51]。在 5
年生人参根的不同生长时期,酶活性也有差异。过
氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)活力在果
后参根生长期之前维持在较低水平,随后快速上升,
并于果后参根生长期达到整个生长季的最高值;过
氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)
活力分别在展叶期和果后参根生长期出现高峰[52]。
硝酸还原酶(NR)活力在展叶期最高,谷丙转氨酶
(GPT)和延胡索酸酶活力分别在展叶期、结果期、
果熟期出现峰值,葡萄糖磷酸异构酶(GPI)在结
果期和果熟期活力均较高[53]。淀粉酶(AMY)、酸
性磷酸酯酶(ACP)和碱性磷酸酯酶(ALP)在展
叶期、开花期和果后参根生长期活力高;酯酶(EST)
在果实形成初期平均活力较高;植酸酶(PHY)在
展叶末期和开花前期活力明显升高[54]。上述研究为
人参的鉴定和优选提供理论依据。
不同产地人参中 SOD、淀粉酶(AMY)、EST
和 ACP 活力差别很大;POD、CAT、苹果酸脱氢酶
(MDH)活性有一定的差别;它们可以作为不同产
地人参质量鉴定的指标之一[55-57]。不同年份人参中,
4 年与 5 年生人参酶活力没有明显差异;但 POD、
CAT、APX 活力以 5 年生人参最高,ALP 和 EST
活力以 6 年生人参最高,PPO、AMY、ACP 活力以
7 年生人参最高,上述 8 种酶活力可作为不同年生
人参的鉴定和评价依据[58]。不同生长期人参根中
SOD 和细胞色素氧化酶(CYT)在人参果后参根生
长期和枯萎期活力升高,CAT 在人参生长发育的各
个时期活性相对稳定[59]。
3 展望
人参是传统名贵中药材,作为一种具有极高药用
价值和广泛药理作用的中药在中医临床的应用中已
有悠久的历史。近些年人参蛋白的研究越来越受到人
们的重视,研究重点从最初专注于提取人参中的总蛋
白、多肽和游离氨基酸等转向人参可溶性蛋白活性鉴
定、基于人参蛋白酶的代谢工程以及人参蛋白差异研
究。这一转变符合人参产业发展的需要,也取得一些
进展,但还存在许多问题:(1)已纯化的人参蛋白活
性不清,已知活性的蛋白机制尚不明确;(2)传统上,
人参根被视为人参皂苷生物合成的主要组织,然而,
负责大部分人参皂苷生物合成的 DS 在人参花蕾中表
达最高[42];(3)缺乏相应人参的基因组数据库,通过
质谱鉴定二维电泳技术分离出的差异人参蛋白的数
量不多[60]。因此,需要从文献研究、实验研究及应用
研究 3 方面入手,深入探讨人参蛋白功效在分子水平
上的机制;加强人参代谢酶类的分离鉴定,选择合适
的人参活性成分生物合成切入点;引入新技术、新方
法,并结合不同的分析方法,将有助于人参差异蛋白
的分离、鉴定。人参基因组计划自 2010 年 4 月在我
国启动以来,已完成人参根、茎、叶和花的转录组测
序,相信随着人参基因组测序的深入进行,人参蛋白
研究将会进入全面发展阶段。
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