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二苯乙烯苷对脑缺血再灌注大鼠神经生长因子表达
及神经细胞凋亡的影响
杨 杰,周芝文,杨期东,曾 进, 郑丽君*
(中南大学湘雅医院 神经内科,湖南 长沙 410008)
摘 要:目的 探讨二苯乙烯苷 ( TSG) 对缺血再灌注大鼠的神经保护作用及分子机制。方法 线栓法制备大鼠
大脑中动脉缺血再灌注损伤模型,再灌注后 6 h、24 h、48 h、7 d 观察动物神经行为学变化并评分,采用原位末端脱
氧核苷酸转移酶标记法 ( T UNEL ) 检测神经细胞凋亡; 免疫组化法检测神经生长因子 ( NGF ) 蛋白表达。结果
神经功能评分显示模型组各时间点均有明显的神经功能缺损症状, 除 6 h 时间点外, 两个剂量 TSG 治疗组其余各
时间点神经功能评分明显低于模型组,差异显著 ( P< 0 05) ;与模型组相比, 除 7 d 时间点外, 两个剂量 TSG 组其
余各时间点凋亡细胞数均减少,差异非常显著 ( P< 0 01) ;与模型组相比, 两个剂量 TSG 组各时间点 NGF 表达均
升高,差异非常显著 (P < 0 01)。结论 TSG 能够增加脑缺血再灌注大鼠缺血周边区 NGF 蛋白表达, 拮抗神经细
胞凋亡,改善神经功能。
关键词:二苯乙烯苷; 脑缺血再灌注; 神经生长因子; 细胞凋亡
中图分类号: R285 5 文献标识码: A 文章编号: 0253 2670( 2010) 10 1676 04
经典理论认为中枢神经系统损伤后不能再生,
但目前研究证实当给损伤的中枢神经提供适当的条
件后也可再生, 从而认识到脑缺血的治疗和预防是
可行的。研究发现在脑缺血损伤早期应用药物提高
脑内神经生长因子 ( ner ve grow th facto r, NGF) 的
表达水平, 对神经再生和功能的恢复具有积极意
义[ 1]。亦有研究明确 NGF 对细胞凋亡具有抑制作
用。二苯乙烯苷 ( 2, 3, 5, 4 四羟基二苯乙烯2O
D葡萄糖苷, tet rahydro xy st ilbene g lucoside, T SG)
是中药何首乌的活性成分[ 23]。现代药理学研究证
明, T SG 具有抗氧化、抗衰老、增强免疫、调节血脂、
抗动脉粥样硬化、提高学习记忆能力、抗炎、抗肿瘤、
护肝、刺激黑色素合成以及诱导 AD 小鼠内源性
NGF 增加的作用 [ 49] ,而 TSG 对脑缺血后 NGF 表
达及神经细胞凋亡影响的研究未见报道。本研究旨
在观察 TSG 对脑缺血再灌注损伤大鼠缺血周边区
NGF 表达及神经细胞凋亡的影响, 从而为临床脑保
护剂的研制和开发提供实验依据。
1 材料与方法
1 1 药物、试剂与仪器: T SG 由湖南中医研究所制
剂室提供,经高效液相色谱法提取分离、纯化,测定
其质量分数为 70% , 4 ! 冰箱保存, 临时制备成
12、24 mg/ mL 溶液备用。T UNEL 试剂盒购自德
国 Roche 公司。兔抗鼠 NGF 抗体购自 Millipore
公司;兔 SABC 浓缩型免疫组化试剂盒购自武汉博
士德生物工程有限公司; DAB 显色剂购自北京中杉
金桥生物工程有限公司。恒低温组织切片机购自美
国 AO 公司; 生物光学显微镜照相机购自日本
Olympus; HPIAS ∀ 1000 彩色病理图像分析系统购
自武大影像工程公司。
1 2 实验动物分组与给药: 清洁级雄性 SD 大鼠
96 只,体质量 200~ 300 g (购自湖南农业大学实验
#1676# 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 10 期 2010 年 10月
收稿日期: 20100115 基金项目:湖南省自然科学基金资助项目 ( 08J J3083)作者简介:杨 杰( 1965 ∀ ) ,女,湖南省长沙市人,副教授,博士,主要研究方向为脑血管疾病。
T el : 13755138437 Email: yangjie6523@ 163. com
动物中心)。随机分为假手术组、模型组、小剂量
TSG 组、大剂量 T SG 组, 每组各 24 只。各组大鼠
按照再灌注后处死的时间分为 6 h、24 h、48 h、7 d
共4个亚组, 每个亚组各 6只。假手术组:进行各项
手术操作,但栓线仅进入 8~ 10 mm; 模型组: 造模
手术前 7 d ig 生理盐水 5 mL/ kg ,第 7天 ig 1 h 后
造模,以后每天定时给药直至处死; TSG 组:造模手
术前 7 d 分别 ig TSG 60、120 mg/ kg [ 6, 8, 10] ,第 7天
给药 1 h 后造模, 以后每天定时给药直到处死。
1 3 模型制作:参考 Longa[ 11] 的线栓法制备局灶
性大脑中动脉栓塞模型。大鼠以 10% 水合氯醛
0 35 mL/ 100 g ip麻醉, 颈部正中切口,分离右侧颈
动脉鞘,游离右侧颈动脉及分支, 结扎颈总动脉、颈
外动脉,在颈内动脉近端夹动脉夹,颈总动脉远端作
血管切口,插入远端钝化的 0 234 mm 单丝尼龙钓
鱼线,松开动脉夹,直视下尼龙线自颈总动脉切口处
插入约 ( 18 ∃ 5) mm 栓塞大脑中动脉入口, 保留 2
h 后拔出,形成再灌注。手术过程中予以照射灯保
持体温在 ( 37 ∃ 0 5) ! , 监测肛温、呼吸及心率。
手术结束后将动物单独置于笼中,直至苏醒后予以
评分。假手术组插线深度为 8~ 10 mm ,其余操作
同手术组。
1 4 神经功能评分:根据 Longa[ 11] 的 5 级标准评
分法,动物苏醒后开始首次评分,直至动物死亡或被
处死。0分为正常, 未见任何神经功能缺损表现; 1
分为垂直提尾时对侧前爪不能伸直; 2分为行走时
身体向对侧旋转; 3分为行走时身体向对侧跌倒; 4
分为不能自发行走或意识丧失。根据首次评分, 0
分、4分、有呼吸困难、提前死亡及处死时发现有蛛
网膜下腔出血的动物均弃之不用。此外对于手术中
出血过多的动物也弃去。
1 5 免疫组织化学: ip 10% 水合氯醛深度麻醉动
物,经心脏灌注 4% 多聚甲醛约 300 mL 至大鼠四
肢强直僵硬,断头取自额极 4~ 11 mm 的脑组织, 置
于 4% 多聚甲醛室温下固定 24 h。4 ! 下 10%、
20%、30% 蔗糖分别沉底, A O 恒低温组织切片机
连续冠状切片 ( 16 ~ 20 m) , 切片晾干后, 应用
SABC 法进行 NGF 的免疫组织化学染色。具体步
骤: PBS ( 0 01 mmol/ L, pH 7. 2~ 7. 4) 漂洗;滴加
新鲜配制的 3% H 2O 2 , 室温下静置 10 m in 以灭活
内源性过氧化物酶; 0. 03% Tr iton100 PBS 溶液室
温下 30 min;滴加 10% 正常山羊血清 37 ! 孵育
20 min 封闭抗原, 0 01 PBS 稀释的兔抗大鼠 NGF
多克隆抗体 ( 1%1 000) 4 ! 24 h。PBS 漂洗后滴
加生物素化山羊抗兔 IgG 抗体 ( 1% 100) , 37 ! 孵
育 1 h; PBS 漂洗后滴加 SABC 复合物 ( 1% 100,新
鲜配制) , 37 ! 孵育 1 h; PBS 漂洗后滴加 DAB 显
色 (暗室操作, 镜下控制反应时间, 蒸馏水终止反
应) ;常规乙醇梯度脱水, 二甲苯透明, 中性树脂封
片。阴性对照采用 PBS 代替一抗, 其余同上述操
作,结果为阴性。
1 6 TU NEL 染色: 冰冻切片按照 TU NEL 试剂
盒说明书操作,进行细胞凋亡染色。
1 7 结果观察:光学显微镜下选择胞浆中出现棕黄
色颗粒者为阳性细胞。采用 HPIAS1000 高清晰
彩色病理图像分析系统对切片进行图像分析。每个
时间点每只大鼠每个指标随机选取 4 张切片,每张
切片随机选取顶叶缺血半暗带 5 个不重复视野, 高
倍镜下 ( & 400) 观察计数每个视野中阳性细胞数,
取均数作为各时间点该指标阳性细胞数。
1 8 统计学分析: 所有数据均用 x ∃ s 表示, 组间
差异比较用 ANOVA 及 N ewmanStudent 多重比
较 t 检验分析,所有数据均使用 SPSS 13 0 统计软
件包进行处理。
2 结果
2 1 T SG 对大鼠脑缺血再灌注后神经功能缺损的
影响:大鼠大脑右侧中动脉阻塞 2 h 后再灌注, 各缺
血组动物均出现神经功能缺损, 主要表现为提尾悬
空时, 阻断对侧肩部内旋, 前肢屈曲、内收, 肌力下
降。单纯缺血再灌注模型组尤为显著; 大、小剂量
T SG 组神经功能缺损都有改善, 肌力明显增强, 有
些动物提尾悬空时两前肢近对称地伸向地面,行为
接近正常,除 6 h 时间点体征不稳定外,其余各时间
点行为学评分均较模型组降低 ( P< 0 05) ;两个剂
量 T SG 组间差异不明显 ( P> 0 05)。结果见表 1。
表 1 缺血各组大鼠神经功能评分的比较 ( x∃ s, n= 6)
Table 1 Comparison on neurological function scores
of ischemic rats in each group (x ∃ s, n= 6)
组别
剂量/
( mg# kg- 1)
再灌注不同时间神经功能评分
6 h 24 h 48 h 7 d
模型 - 2 00 ∃ 0 89 2 67 ∃ 0 52 2 33 ∃ 0 52 1 50 ∃ 0 55
T SG 60 2 00 ∃ 0 63 1 67 ∃ 0 52* 1 33 ∃ 0 52* 0 83 ∃ 0 43*
120 1 67 ∃ 0 82 1 33 ∃ 0 52* 1 17 ∃ 0 41* 0 67 ∃ 0 52*
与模型组比较: * P < 0 05
* P < 0 05 v s model group
2 2 T SG 对大鼠脑缺血再灌注后缺血周边区神经
细胞凋亡的影响: 显微镜下,假手术组可以观察到散
在分布的凋亡细胞, 凋亡细胞核阳性,细胞体积小,
且皱缩变形。模型组再灌注 6 h 缺血侧坏死灶周围
#1677#中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 10 期 2010 年 10月
可以观察到凋亡细胞明显增多, 24 h 达到最高峰,
48 h 下降, 7 d 病灶区仅见少数凋亡细胞。凋亡阳
性细胞特征:圆形,棕色浓染, 体积较小,不显示正常
的胞浆结构。与假手术组相比, 缺血各组凋亡细胞
数明显增加 ( P< 0 01) , 与模型组相比, 6、24、48 h
时间点 T SG 治疗组凋亡细胞数量均明显减少
( P< 0 05) ,两种剂量 TSG 治疗组间凋亡细胞数量
无明显差异 ( P< 0 05)。结果见图 1,表 2。
2 3 TSG 对大鼠脑缺血再灌注后缺血周边区顶叶
皮质 NGF 表达的影响: 缺血再灌注后 6 h 缺血周
边区顶叶皮质神经元 NGF 蛋白阳性表达增加, 24 h
表达达高峰 (阳性细胞计数明显增高) , 48 h 表达有
所下降, 7 d 仍见表达。形态学上多数阳性细胞体
积较大,典型神经元形态, 细胞轮廓清晰, 阳性细胞
膜、浆、核内均有表达, 主要为胞浆着色, 呈棕黄色。
与假手术组比较,缺血各组表达增加,差异有统计学
意义 ( P< 0 01) ;与模型组相比, TSG 治疗组再灌注
6 h、24 h、48 h、7 d阳性表达细胞数量均明显增多,差
异有统计学意义 ( P< 0 01) , 两个剂量 TSG 治疗组
间无明显差异 ( P> 0 05) ,结果见表 3,图 2。
图 1 大鼠缺血再灌注 24 h 后缺血周边区顶叶皮质神经元细胞凋亡 TUNEL 检测
Fig. 1 TUNEL Labeling of neurons apoptosis in ischemic cortex of parietal lobe at 24 h af ter ischemiareperfusion
表 2 各组大鼠缺血侧顶叶皮质 TUNEL细胞数的比较
( x∃ s, n= 6)
Table 2 Comparison of TUNEL cell numbers in ischemic
cortex of parietal lobe of each group of rats
(x ∃ s, n= 6)
组 别
剂量 /
( mg# kg- 1 )
再灌注不同时间神经细胞凋亡数量/个
6 h 24 h 48 h 7 d
假手术 - 402∃ 1 10 453 ∃ 120 4 23 ∃ 1 04 3 94 ∃ 1 10
模型 - 1836∃ 1 27 ∋ ∋ 4707 ∃ 161∋ ∋ 19 57 ∃ 2 23 ∋ ∋ 6 26 ∃ 1 96
TSG 60 1601∃ 2 03 ∋ ∋ * 3572 ∃ 209∋ ∋* 15 38 ∃ 2 25 ∋ ∋* 4 41 ∃ 0 69
120 1591∃ 1 71 ∋ ∋ * 3439 ∃ 192∋ ∋* 16 31 ∃ 2 02 ∋ ∋* 5 29 ∃ 1 07
与假手术组比较: ∋ ∋P < 0 01; 与模型组比较: * P< 0 05
∋ ∋P< 0 01 v s Sham gr ou p; * P < 0 05 v s model grou p
表 3 各组大鼠缺血侧顶叶皮质 NGF 蛋白表达的比较
(x ∃ s, n= 6)
Table 3 Comparison on NGF protein expression in ischemic
cortex of parietal lobe among every group of rats
( x∃ s, n= 6)
组 别
剂量/
( m g #kg- 1 )
再灌注不同时间 NGF 阳性表达细胞数/ 个
6 h 2 4 h 48 h 7 d
假手术 - 06 8 ∃ 0 17 0 76 ∃ 0 24 0 71 ∃ 0 20 0 65 ∃ 0 19
模型 - 164 7 ∃ 1 54∋ ∋ 27 02 ∃ 3 58 ∋ ∋ 2 0 72 ∃ 1 58∋ ∋ 13 53 ∃ 0 89∋ ∋
TSG 60 271 2 ∃ 1 13∋ ∋ * * 44 57 ∃ 3 25 ∋ ∋* * 3 1 33 ∃ 1 21∋ ∋* * 22 12 ∃ 0 75∋ ∋* *
1 20 266 0 ∃ 1 75∋ ∋ * * 42 85 ∃ 3 41 ∋ ∋* * 3 0 37 ∃ 1 28∋ ∋* * 21 23 ∃ 0 64∋ ∋* *
与假手术组比较: ∋ ∋ P< 0 01; 与模型组比较: * * P < 0 01
∋ ∋P < 0 01 v s Sham group; * * P < 0 01 v s model group
图 2 免疫组织化学检测大鼠缺血再灌注 24 h后缺血周边区顶叶皮质神经元 NGF 蛋白的表达
Fig. 2 Immunohistochemical labeling of NGF protein expression in ischemic cortex of parietal lobe
at 24 h after ischemiareperfusion
3 讨论
脑缺血再灌注损伤机制十分复杂, 主要涉及自
由基损伤、兴奋性氨基酸毒性、钙离子超载、能量代
谢障碍、炎症反应、细胞凋亡等多个方面。胡伟
等[ 1 2]研究发现缺血缺氧性脑损伤早期应用 NGF,
可减轻神经功能损伤程度。赵晖等[ 1]报道侯氏黑散
可上调脑缺血再灌注损伤后缺血脑组织内源性
NGF 的表达,起到脑保护作用。近年来大量研究表
#1678# 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 10 期 2010 年 10月
明,脑缺血再灌注损伤后缺血半暗区神经细胞凋亡
是造成迟发性神经元死亡的重要原因。且有研究证
实, NGF 对神经细胞凋亡有明确的抑制作用。
TSG 是中药何首乌的活性成分, 是一种多羟基
酚类化合物。神经科学大量研究证明, 何首乌及其
活性成分 T SG 具有抗衰老、抗氧化、减轻脑缺血引
起的脑水肿及脑组织损害, 改善神经功能缺损等脑
保护作用。在 AD 小鼠模型研究中发现 T SG 能够
诱导内源性神经生长因子上调, 明显提高小鼠的学
习记忆能力[ 8]。另外亦有研究[ 13] 发现 TSG 能抑制
啮齿动物脑缺血再灌注所导致的脑组织 NMDA 受
体结合力升高, 降低神经细胞内钙离子浓度, 减轻钙
超载所致的脑细胞损伤与凋亡。
本研究采用 TU NEL 法检测大脑中动脉栓塞
大鼠模型大脑皮层神经细胞凋亡,免疫组化法检测
缺血周边区 NGF 表达产物。结果显示,与假手术
组相比,脑缺血再灌注后缺血周边区 NGF 表达增
加,这与以往研究结果一致;与模型组相比, 两个剂
量 TSG 组可明显上调 NGF 的表达,减少神经细胞
凋亡。提示 T SG 能够通过诱导脑缺血再灌注损伤
大鼠 NGF 表达上调,减少神经细胞凋亡,从而减轻
神经功能缺损, 起到神经保护作用,这对缺血性中风
后的脑功能恢复具有积极意义。本实验研究为
TSG 作为临床脑保护剂的研究与开发提供了实验
依据,但 TSG 在体内对脑缺血再灌注神经系统损
伤的保护机制尚需进一步研究。
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六味地黄汤对糖尿病肾病大鼠肾功能及细胞凋亡的影响
邓 红1 , 王 新2 , 徐 芳3 ,唐 方1 *
( 1 天津医科大学总医院 中医科,天津 300072; 2 山西省大同市中医医院,山西 大同 037004;
3 天津中新药业公司,天津 300031)
摘 要:目的 探讨六味地黄汤对糖尿病肾病 ( DN) 大鼠肾脏功能保护作用的量效关系及对细胞凋亡的影响。
方法 采用单侧肾脏结扎术+ 腹腔注射链脲佐菌素 ( ST Z) 的方法建立 DN 模型, 2 周实验结束时测定大鼠血糖、
肌酐清除率、尿蛋白定量; 2、4、8 周实验结束时分析大鼠肾皮质细胞 DNA 降解的琼脂糖凝胶电泳, T UNEL 法观察
#1679#中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 10 期 2010 年 10月
收稿日期: 20100319 作者简介:邓 红( 1973 ∀ ) ,女,天津市人,主治医师,硕士,博士在读,研究方向为老年病及眼科疾病治疗。
T el : ( 022) 26769221 Em ail: hdeng5588@ 163. com
* 通讯作者 唐 方 T el: ( 022) 60362762 Email: zhongyi3599@ 126. com