全 文 ：第 36 卷 第 1 期 暨南大学学报(自然科学与医学版) Vol． 36 No． 1
2015 年 2 月 Journal of Jinan University(Natural Science ＆ Medicine Edition) Feb． 2015
［收稿日期］ 2014 － 06 － 19
［基金项目］ 国家自然科学基金青年项目(81400990) ;湖北省协同创新中心创新团队项目子课题(2011JH － 2013CXTT08) ;南方医科大学“科
研启动计划”青年科技培育项目(B1012158)
［作者简介］ 顾民华(1980 －) ，女，研究方向:中医药脑保护
通信作者:顾 勇，男，副研究员，医学博士;Tel:020 － 61641964;E-mail:yonggu@ smu． edu． cn
芒柄花素保护前脑缺血再灌注损伤中的
血脑屏障并抑制神经炎症
顾民华1， 洪 文1， 唐传其1， 李 伟2， 顾 勇2
(1．广州市东升医院 中医科，广东 广州 510120;2． 南方医科大学 南方医院 神经内科，广东 广州 510515)
［摘 要］ 目的:观察黄芪在脑缺血再灌注损伤模型中异黄酮成分“芒柄花素”对前脑缺血再灌注损伤大鼠血脑
屏障(BBB)的作用及抗神经炎症的效果．方法:大脑中动脉阻塞建立大鼠脑缺血模型，伊文思蓝渗透实验计算 BBB
通透性，原位明胶酶谱检测基质金属蛋白酶(MMPs)活性以及荧光定量 PCＲ检测炎症因子 mＲNA表达．结果:芒柄
花素可显著改善脑缺血再灌大鼠的神经功能缺损和 BBB通透性，降低 MMP-9 的表达、脑内 MMPs活性并减少诱导
型一氧化氮合酶(iNOS)、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)和白介素(IL-1β)等炎症因子的 mＲNA 在缺血脑片上的表达．
结论:芒柄花素具有降低脑缺血再灌注损伤中的 BBB通透性和抑制神经炎症的作用．
［关键词］ 芒柄花素; 黄芪; 血脑屏障; 神经炎症; 脑缺血再灌注
［中图分类号］ Ｒ743． 3 ［文献标志码］ A ［文章编号］ 1000 － 9965(2015)01 － 0034 － 06
doi:10． 11778 / j． jdxb． 2015． 01． 006
Formononetin protects blood-brain barrier and inhibits neuroinflammation
during focal cerebral ischemia and reperfusion
GU Minhua1， HONG Wen1， TANG Chuanqi1， LI Wei2， GU Yong2
(1． Department of Chinese Medicine，Dongsheng Hospital，Guangzhou 510120，China;
2． Department of Neurology，Nanfang Hospital，Southern Medical University，Guangzhou 510515，China)
［Abstract］ Aim:To investigate the effect of formononetin (FMN)on blood-brain barrier (BBB)per-
meability and neuroinflammation in a rat model of focal brain ischemia-reperfusion． Methods:Middle
cerebral artery occlusion was employed to establish a brain ischemia model． Evans blue leakage assay was
used to determine the BBB permeability． MMPs activity in brain sections was observed by in situ zymog-
raphy． The expression of inflammatory factors was determined by fluorescent quantitative PCＲ． Ｒesults:
FMN significantly ameliorated neurological deficits and reduced BBB permeability in the model of brain
ischemia-reperfusion． Furthermore，FMN remarkably reduced MMP-9 expression，MMPs activity in the
ischemic brain and decreased the mＲNA expression of inflammatory factors，including inducible nitric ox-
ide synthase，tumor necrotic factor-α and interleukin-1β． Conclusion:These results，when taken togeth-
er，suggest that FMN has the effect of protecting BBB and inhibiting neuroinflammation during ischemia
and reperfusion．
［Key words］ formononetin; Astragali Ｒadix; blood-brain barrier; neuroinflammation; cerebral
ischemia and reperfusion
第 3 次中国死亡原因调查显示，脑血管病已经
超过了心血管疾病和恶性肿瘤成为中国第一死亡疾
病，每年死亡人数超过 200 万，死亡率是欧美国家的
4 ～ 5 倍，是日本的 3. 5 倍［1］，具高发病率、高致残
率、高死亡率和高复发率等特点，严重威胁着国民的
健康．急性脑卒中构成中，大约 3 /4 属于缺血性脑卒
中即脑梗死．随着人口老龄化的到来，预防和治疗脑
梗死并试图提高脑梗死的医疗质量是整个医学界迫
切需要解决的问题［2］．
脑梗死治疗在临床上收效甚微，主要原因之一
便是在脑梗死的不同发展阶段具有不同的分子、细
胞病理变化并引起更多加重病情发展的继发性损
伤，发生血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)开放、
脑水肿等． 缺血的早期阶段 BBB 轻微开放，随着病
情发展，BBB 损伤更严重，血液中的白蛋白等成分
入脑实质继发神经元死亡以及血管源性脑水
肿［3 － 4］．因此，保护脑梗死病人的 BBB 损伤是治疗
的一个重要策略．
基质金属蛋白酶(matrix，metalloproteinases，
MMPs)的激活破坏血管周边基质和内皮细胞间的
紧密连接，引起 BBB开放进而发生出血转化和神经
元死亡．包围在缺血中心外面的缺血半暗带接受相
对低的血流灌注．低灌注诱发的剪应力、电子传递链
干扰所形成的氧化应激以及低氧等因素共同启动早
期的炎症反应，包括血小板聚集、小胶质细胞激活、
白细胞粘附和浸润等［5］． 而在亚急性期，缺血中心
区组织受损后释放一类“危险相关分子模式”的细
胞内含物大分子，结合相应的受体并激活炎症细胞
释放多种炎性细胞因子如白介素 1β(interleukin-
1β，IL-1β)，肿瘤坏死因子 α (tumor necrosis factor-
α，TNF-α)以及诱导型一氧化氮合酶(inducible ni-
tric oxide synthases，iNOS) ，从而启动继发的炎症反
应［6］．脑缺血再灌注过程中的早期与继发的炎症反
应可以显著地提高血脑屏障通透性，加剧神经血管
单元的损伤［7］． 因此，以脑梗死过程中产生的炎症
反应作为治疗靶点保护血脑屏障从而改善其症状是
脑梗死治疗的一个热点方向［8］．
中药黄芪来源于豆科植物黄芪(Astragalus
membranaceus)的干燥块根，有增强机体免疫功能、
保肝、利尿、抗衰老、抗应激、降压和较广泛的抗菌作
用．芒柄花素又称芒柄花黄素(formononetin，FMN)
是其中一种活性成分，是异黄酮之一． 有研究证实
FMN具有清除自由基的作用［9］，对小鼠全脑缺血具
有脑保护作用并降低脑水肿和脑内炎症［10］，体外研
究表明 FMN 可以保护谷氨酸诱导的神经元损
伤［11］．本研究探讨芒柄花素对缺血大鼠的神经功能
评分、BBB通透性、MMPs表达与活性以及神经炎症
等的影响．
1 材料与方法
1． 1 材料
芒柄花素购买自上海永恒生物制品有限公司;
单股尼龙线栓购自美国强生公司;伊文思蓝、二甲酰
胺、DMSO、ＲIPA 购自美国 Sigma 公司;EnzCheck 胶
原酶试剂盒、TＲIzol 购自美国 Invitrogen;MMP-9 购
自 Merck公司;β-actin 抗体、羊抗鼠二抗购自 Santa
Cruz;ECL显影液购自 GE Healthcare;IL-1β、TNF-α、
iNOS和 β-actin的引物从华大基因公司购买．
1． 2 方法
(1)动物分组、大鼠脑缺血与再灌注模型与给
药 雄性 Sprague-Daweley (SD)大鼠，体质量 250 ～
270 g，购自南方医科大学实验动物中心，动物证号:
SYXK(粤)2020 － 0056．实验大鼠 30 只，动物分组遵
循随机原则，分为两部分:神经功能评分和伊文思蓝
渗透实验的实验大鼠为 15 只，分别为假手术组(n
= 3)，溶剂对照组(n = 6) ，给药组(n = 6) ;另外 15
只实验大鼠进行同样分组，用于检测 MMPs 活性和
炎症因子表达实验．给药、造模后分别取不同冠状切
面组织进行原位明胶酶谱、免疫印迹和荧光定量
PCＲ实验(图 1)．采用大脑中动脉阻塞(middle cere-
bral artery occlusion，MCAO)作为脑缺血与再灌注
模型［7］:大鼠经苯巴比妥麻醉后仰卧固定于手术台
上，消毒，沿颈中部切开暴露颈总、颈内与颈外动脉;
3 /0 的单股尼龙线栓从左侧颈外切口插入，经颈内
53第 1 期 顾民华，等:芒柄花素保护前脑缺血再灌注损伤中的血脑屏障并抑制神经炎症
动脉和前脑动脉直达底部以阻塞中动脉． 假手术组
除了线栓插入深度外其余与模型组一致;大鼠缺血
1. 5 h 拔出线栓以引导血流再灌注． 用药组则将
FMN 溶解于 20 μL DMSO并在 1 mL花生油中稀释．
溶剂对照组含有芒柄花素外的其他等量溶剂，即 20
μL DMSO于 1 mL花生油中稀释，分别于缺血前 15
min腹腔注射入大鼠体内质量分数为 30 mg /kg．
大鼠在脑缺血前 15 min给药，缺血 1. 5 h、再灌注 22. 5 h后分别检测
神经功能评分、BBB通透性、MMPs活性和炎症因子表达
图 1 实验方案
Fig． 1 Experimental protocol
(2)神经功能评分 在神经功能分别在 1. 5 与
24 h进行，标准如下:无神经缺血，0 分;完全伸展左
前肢较困难，1 分;不能伸展左前肢，2 分;轻微向左
转圈，3 分;严重左转圈，4 分;向左倾倒，5 分．
(3)BBB通透性检测 通过伊文思蓝渗透实验
检测 BBB通透性［12］．大鼠在处死前 30 min 按每 kg
静脉注射体积分数为 2% 伊文思蓝 2 mL，然后心脏
灌注生理盐水直到流出液无颜色为止． 分离缺血侧
半球与二甲酰胺在 60 ℃水浴箱中孵育 24 h．用分光
光度计检测上清以检测伊文思蓝的浓度从而计算
BBB漏出情况．
(4)原位明胶酶谱 MMP-2 和 MMP-9 的活性
可以通过在脑组织冰冻切片上利用 EnzCheck 胶原
酶试剂盒原位检测． 前囟后 0 ～ 2 mm 取材切片，行
原位明胶酶谱实验． 冠状冰冻切片与含有质量浓度
为 40 μg /mL FITC-标记的 DQ 明胶的反应缓冲液
37℃孵育 2 h，明胶酶酶切 DQ-gelatin 而产生的肽具
有自发荧光，其荧光强度即明胶酶的活性，用荧光显
微镜(Zeiss，Germany)来检测所产生的荧光信号．
(5)免疫印迹(Western blotting)与定量 前囟
后 2 ～ 4 mm取材提取蛋白和 mＲNA，选取的位置包
括整个缺血区、半暗带区和正常组织区，行免疫印迹
和荧光定量 PCＲ 实验．脑组织蛋白经 ＲIPA 提取后
定量，并在体积分数为 10% SDS-PAGE 中分离，转
膜至 PVDF、封闭后，与抗 MMP-9 (1∶500)或者 β-ac-
tin (1∶5 000)的一抗孵育过夜． 洗膜、二抗孵育(羊
抗鼠，1∶2 000)、再次洗膜，然后用 ECL显影液显影．
所获取条带采用 ImageJ软件定量．
(6)荧光定量 PCＲ (Q-PCＲ) 获取脑组织后用
TＲIzol提取总 ＲNA，定量、反转录获取 cDNA．以 cD-
NA为模板，加入 IL-1β、TNF-α、iNOS和 β-actin的引
物、荧光染料等在 ABI7500 中进行 PCＲ反应以对炎
症因子 mＲNA进行定量．
(7)统计分析 数据以(均数 ±标准差)表示，两
组数据的比较采用 t 检验，统计分析在 SPSS 18. 0 统
计软件中进行，P ＜ 0. 05 具有统计学差异．散点图和
柱状图分别由 GraphPad Prism 5、OriginPro 8. 5制作．
2 结果
2． 1 FMN 降低脑缺血大鼠的神经功能评分和
BBB通透性
为了检测 FMN的保护作用，首先检测了缺血再
灌大鼠在给药情况下的神经功能改善情况． 排除个
体差异与实验误差，同时在缺血 1. 5 与 24 h 两个时
间点检测．假手术组(Sham)没有任何神经功能缺陷
(图 2A);在缺血 1. 5 h 后，FMN 给药组和溶剂对照
组(Vehicle)之间神经功能无显著差异(P ＞ 0. 05) ;
在缺血 /再灌后 24 h 后，FMN 给药组的神经功能评
分低于溶剂对照组(P ＜ 0. 05) ，提示 FMN 具有显著
的神经保护作用．
为了检测 FMN 对 BBB 通透性影响，用伊文思
蓝渗透实验检测 FMN 给药情况下的 BBB 通透性．
Sham组无伊文思蓝的渗漏(图 2B)，而缺血 /再灌可
以引起约质量分数为 10 μg /g 的漏出;相比之下，
FMN给药质量浓度降低至 4 ～ 8 μg /g 范围内，与溶
剂对照组比较具有显著差异(P ＜ 0. 01)．
2． 2 FMN降低MMPs的表达活性
MMPs的激活是引起紧密连接和 BBB破坏的主
要蛋白酶［13］． 为了探讨 FMN 保护 BBB 的分子机
制，用原位明胶酶谱检测 MMPs的活性以及 Western
blotting检测脑内 MMP-9 的表达． FMN 显著地降低
了 MMPs激活所引起的酶切底物荧光强度(图 3A) ，
FMN可降低 MMP-9 的表达(图 3B、C，P ＜ 0. 05) ，提
示 FMN 给药可显著地抑制缺血再灌大鼠脑内的
MMPs的活性与表达水平．
2． 3 FMN降低炎症因子的 mＲNA表达
缺血再灌注过程中的炎症因子大量表达与释放
是引起 BBB破坏与 MMPs激活的关键因素．用定量
PCＲ技术检测脑内的炎症因子的表达水平，脑缺血
63 暨南大学学报(自然科学与医学版) 第 36 卷
与再灌损伤可明显增加 iNOS、IL-1β 和 TNF-α 的
mＲNA的表达，而 FMN显著地降低缺血再灌大鼠脑
内 iNOS、IL-1β 和 TNF-α 的 mＲNA 水平(图 4，P ＜
0. 01)．
A:神经功能评分，分别在缺血后(1. 5 h)和再灌注结束(24 h)检测;B:伊文思蓝渗透实验检测 BBB 通透性;与溶剂对照组(Vehicle)比较，1)P
＜ 0. 05;2)P ＜ 0. 01．
图 2 FMN对脑缺血再灌大鼠神经功能评分和伊文思蓝渗漏的影响
Fig． 2 The effects of FMN on the neurology score and Evans blue leakage in brain ischemia-reperfused rats
A:原位明胶酶谱实验检测对照组和给药组大鼠冰冻切片上原位检测 MMPs活性;B:Western blotting检测各组 MMP-9 表达，Actin 为上样对照;
C:MMP-9 的蛋白表达定量结果，将 Sham组定义为 1，其他各组为相对表达量，1)与溶剂对照组(Vehicle)比较，P ＜ 0. 05．
图 3 FMN对脑缺血再灌大鼠 MMPs的活性和表达的影响
Fig． 3 The effects of FMN on the MMPs activity and expression in brain ischemia-reperfused rats
73第 1 期 顾民华，等:芒柄花素保护前脑缺血再灌注损伤中的血脑屏障并抑制神经炎症
A:iNOS的 mＲNA相对表达;B:IL-1β的 mＲNA相对表达;C:TNF-α的 mＲNA相对表达;与溶剂对照组(Vehicle)比较，1)P ＜ 0. 01;2)P ＜ 0. 01;
3)P ＜ 0. 01．
图 4 FMN对缺血再灌大鼠脑内 iNOS、IL-1β和 TNF-α的 mＲNA表达的影响
Fig． 4 The effects of FMN on the mＲNA expression of iNOS，IL － 1β and TNF － α in brain ischemia-reperfused rats
3 讨论
缺血再灌注损伤过程中的神经炎症是引起血脑
屏障破坏、脑水肿及神经损伤的关键因素，降低炎症
反应的多种措施可以显著地保护 BBB、阻止脑水肿
和神经损伤．本研究结果显示，黄芪的主要成分芒柄
花素非常显著地减少炎症因子 iNOS、IL-1β 和 TNF-
α的表达、降低 MMPs 活性和 BBB 通透性、改善神
经功能损伤，具有明显的神经保护作用．
研究表明黄芪提取物具有良好的神经保护作
用［14］，黄芪含有上百种活性成分包括皂苷、多糖和
异黄酮等［15 － 16］． 而黄芪甲苷 IV可以缩小缺血大鼠
的梗塞面积和并保护 BBB完整性，其作用机制与抗
氧化和抗神经炎症有关［17 － 20］．毛蕊异黄酮和芒柄花
素是黄芪中的异黄酮，二者仅相差一个羟基．毛蕊异
黄酮显著地改善神经缺陷并降低梗死面积［21］．已经
证实 FMN 对小鼠全脑缺血具有脑保护作用并可降
低水肿和脑内炎症［10］． 本研究结果提示，FMN 可以
清除显著降低 iNOS、IL-1β 和 TNF-α 炎症因子的表
达并且改善神经缺损症状，FMN 降低 BBB 通透性
和 MMPs活性的作用． 在脑缺血再灌损伤过程中，
BBB破坏可引起毒性物质从血液进入脑实质，扩大
梗死面积;还可介导血管源性的脑水肿［4 － 6］． 因此，
保护 BBB是阻止脑缺血再灌进一步损伤的关键治
疗策略．通过伊文思蓝渗透实验，FMN 可明显地降
低脑卒中大鼠模型的 BBB通透性． BBB 开放依赖于
MMPs即一组锌离子依赖的蛋白酶，在脑缺血再灌
损伤中其表达和活性显著增加，降解紧密连接蛋白
和环绕在内皮细胞与星形胶质细胞足板周边的基
质，从而引起 BBB 开放［22］． 本研究中 Western blot-
ting和原位明胶酶谱实验显示 FMN 既减少 MMP-9
的表达又降低 MMPs 的明胶酶活性，进一步证实
FMN对 BBB的保护作用．
总之，本研究提示 FMN在脑缺血再灌损伤中的
脑保护与减弱神经炎症功能，具有保护 BBB 的作
用，为充分理解黄芪的药理活性与 FMN潜在的在脑
梗死治疗方面的运用提供了实验依据．
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［责任编辑:朱颖嫄］
93第 1 期 顾民华，等:芒柄花素保护前脑缺血再灌注损伤中的血脑屏障并抑制神经炎症