全 文 :2016
y
5
z À
41
ÁÀ
9
}
Vol41,No.9 May,2016
·
`;
·
[
gh)(
] 20151109
[
ijkR
]
«_`abtcSef
(81130066);
«_«
gúbüÀÁef
(Z151100003815015)
[
le?m
]
rj
,
mno
,
pqrst
,Tel:(010)64227163,Email:lp8675@163com
cdúef
db/db
:gRP×hiÖjkl
·_¡mno
çÖ
1,2,
]èé
2,
]ê
2,
ëì
2,
rj
1,2,3
(1.
ü«tbt
&
gYt mnr
,
g
100730;
2.
üOPQÞRtmn hhË
,
g
100029;
3.
STUVWgúg
,
g
100029)
[
pq
]
、
RP×hiâãPרq
,
pq|Õ!R÷
(NAFLD)
ûDX_¾GS
,
qB=ïy@2
,
Ò«
ÓI¾B§ç/½!¨q
[
。
ÚÑ_~cdúÏ
C57BLKS/Jdb/db(db/db)
:gRP×hiÖjkl·_¡
m¯f
。8
³!Mm!c¦q
db/db
:gÖ¦>¥mq
db/m
:g
,
Îf¡ÓÏÒ
(db/m)、
xmÒ
(db/db)、
cdúC,Ò
(db/db+TSF),
JK
12
ÿä¨
,
3Ò¸ëõX¯
。
äò
O
ßí¶º´R°E
,
c£Ò
¸_û¶º´jkl·_¡mëj¨
CD68,F4/80
N_
;
Å_`
PCR
û¶ºöíR÷Ò¸jkl·_ëj¨
Mrc1,Arg1,TNFαÉmRNA 。mÝÖÏÒâ,xmÒ:gÒ¸R
°E@Z,TSFõÿR
°EV¹*
F
;db/db
:g´Ò¸
CD68
#
F4/80
@2
,TSF
õÿ?V¹M Jþ
;
Ù+
,
ÖÏÒâ
,db/db
:g
öíR÷Ò¸jkl·_ëj¨
Mrc1,Arg1
#
TNFαmRNA @2,TSFõÿTNFαV¹ST,vMrc1,Arg1=V¹
E
。
á ¡$,cdú?*
db/db
:g´R÷N
,
eftRE
,
f?Ö»Ájkl·_Bã
。
[
rst
]
cdú
;
|Õ!R÷
;
´R÷N
;
jkl·_
ExperimentalstudyofTangshenformulainimprovedlipidmetabolismand
phenotypicswitchofmacrophageindb/dbmice
KONGQin1,2,ZHANGBingxuan2,ZHANGHaojun2,YANMeihua2,LIPing1,2,3
(1.GraduateSchoolofPekingUnionMedicalColege,ChineseAcademyofMedicalSciences&Peking
UnionMedicalColege,Beijing100730,China;
2.DepartmentofPharmacology,InstituteofClinicalMedicalSciences,ChinaJapanFriendshipHospital,Beijing100029,China;
3.BeijingKeyLabforImmuneMediatedInflammatoryDiseases,Beijing100029,China)
[Abstract] Obesityanditsassociatedmetabolicdisorders,includingnonalcoholicfatyliverdisease(NAFLD),havebecomemajor
chronicdiseasesthreateningpublichealthNAFLDisachronicliverdisorderthatisstronglyassociatedwithtype2diabetesandobesi
tyInthisstudy,weinvestigatedtheefectsandmechanismofTangshenformula(TSF)onhepaticdyslipidemiaandphenotypicswitch
ofmacrophageindb/dbmiceEightweekoldmaleC57BLKS/Jdb/mcontrolanddb/dbmiceweredividedinto3groups(namelydb/
m,db/db,db/db+TSF),andfedwithTSFordistiledwaterfor12weeksItwasfoundthataftertreatmentwithTSF,thetriglycer
idesaccumulationindb/dbmicewasdecreasedonthebasisofoilredOstainingwithcryosectionsoflivertissuesAndproteinexpres
sionsofmacrophageactivationmarkersCD68andF4/80weredecreasedaccordingtoimmunohistochemicalanalysisofhepaticsections
·3961·
2016
y
5
z À
41
ÁÀ
9
}
Vol41,No.9 May,2016
ThemRNAlevelofTNFα(M1marker)wassignificantlydecreasedbyTSFindb/dbmice,butwithnosignificantdiferenceinMrc1
andArg1(M2marker)Accordingtotheresults,TSFatenuatedhepaticsteatosisandrelieveddyslipidemia,itsmechanismmaybe
corelatedwiththeregulationofmacrophageactivationandphenotypicswitch
[Keywords] Tangshenformula;nonalcoholicfatyliverdisease(NAFLD);hepaticsteatosis;macrophageactivation
doi:10.4268/cjcmm20160920
|Õ!R÷q
(nonalcoholicfatyliverdis
ease,NAFLD)
û[§ÂäLþÓÑR
¤
´Ò¸$E¡EÓq}eN¨q
(
|#
¤Ò¡\¥¦S
),
û.Ó[§½!
´¨q
,
ååo%qªmÓ
15% ~30%[1]。
m©mpqR¹!R÷
、
R÷!ÿ
、
_#
¥
4
Cßé
。
BVÄuBÆ$c¦q
、
tRE$
NAFLD
qªV¹@2
,
m
Ó
35%~80%[1]。
ÆKååÏ
NAFLD
Xôuä
uù
,
v
NAFLD
q#mqfÓf-
,
åå
[bêw¡â
。
ãy¡
NAFLD
m©m
Ö
、
¸S
,
、
ÿ§jkl·_BÏ]d
>ô
。
BmÝ
,
jkl·_¡m¤
Ò¸ÿ§#¸S
,$mEÏ_¯
,
Ïê
NAFLD
m©mBÏV¹»Á¯
,
·ú(Â>
(activated,M1)
Ö÷ø!
(alterna
tivelyactivated,M2)
·ú(ÂÖÙm©m
[2]。
cdúû²þÛܶ¼M$Ao¶
fuá&¯ú
,
ÂB¡$,fúcdú
¨?V¹*c¦qdqwgd¥¦qT«t
äLþ#u+CJþ
[3]。
õ@ʯ
NAFLD
xm
db/db
:gcdúÏR
P×
ØÙq~jkl¥¦¡m¤
NAFLD
$
¯
,
ÓcdúS[:®¯ö¯2ð&ñò
。
1
Ü#Öúû
11
òíÖß´
TRIzol
òí
(Invitrogen,
°%
);
õlmòíä
(ThermoFisher,
°%
);UltraSYBR
Mixture(
/Ó¹kDE
,
$%
);
äò
O
ß>
(Sigma,
°%
);CD68
,ó
[Abcam(1∶400),
°%
];F4/80
,
ó
[Abcam(1∶200),
°%
];
_Vî}
(Olympus
BX43
m_Vî}
,
{õ
);ABI7500
Å_`
PCR
ß
(ABI,
°%
)。
12
¨
Mm!
2
mc¦q
C57BLKS/J
db/db
:g
(
ÂSQX
db/db
:g
),
!
,8
³
,
ó
(35±5)g;
¦ZW`;
C57BLKS/Jdb/+
:g
(
ÂSQX
db/m
:g
),
ó
(20±2)g,
Âf
¨§M23wno¨$S
,
¨©-?v
<
SCXK(
3
)20110001。
ºB:gê${ú
Aþ
SPF
Jno¨ðîMÄ
,
�v<
SYXK(
3
)20100011。
^
(23±3)℃,
âÏ$^
(55±15)%,
_
12h
¡Gb¥
,
MwJ#Å
,
d@#
。
õ}noºBÍÆIJéno
¨ }âãª`n
。
13
Yò,¨
cdúÖú¨
(
*ð*,È
BCDEí
),
©<
1206346,
ªJ
8g/´ 。
Ò«
:
(.
、
©F
、
w(
、¸
、
klt
、
Lk
、
w
7
ö$
,
。
no¨§ù?ö!
2
,
Xqn
¶ÞÃý
,
Îf¡ÒOP
1。
no¨êÀ
10
rmÕC,
,
|{
1
}
,
|X
,
JKC,
12
。
cdúíÂüå}®¯qéëì
¨íÍt
[4]。
1
no¨¡ÒC,
(n=9)
Table1 Subgroupingandadministration(n=9)
Ò^ õZ¼ í
Ï
(db/m)
|}J óE¦cdúÒ
xm
(db/db)
|}J óE¦cdúÒ
cdú
(db/db+TSF)
cdú 24g·kg-1·d-1
14
ëõw³
Å
12h,
Û83t
,
vS²³
f
,-20℃
íµX¯
。
wM©_߶ºtu
+C
(totalcholesterol,TC)
#äLþ
(triglycer
ide,TG)。
no¨êÀ
22
ä
,
²³´#Ë
SöíR÷Ò¸
,
»¼3J¡
,
X
,
d31¡
4%
Z}£$C`
1h,
3Ö½ù
30%
ÍcÎ>$
ÒJè
,OCT
p
,-80℃
ìà
,
ªìàd
5
μm,-80℃íµX¯;n$!£$C`,Ì~
p
,
XÌ~d¯
。
15
äò
O
ßíq}ý
,´ìàdW
ìZ$3Ö
,
ðSþE
15min,60%
Eg9·d
,
äò
O
ß>ßí
15min,60%
Eg·:Zn
ß>
,
MäJ©·
2min,
+ASfßlp
1min,
MäJ©·ËÞ
5min,
äµ
,
Vî}Sýq
·4961·
Y
ùÉ
:
cdúef
db/db
:gRP×hiÖjkl·_¡mno
}eNqï¯
ImageProPlus
rø©s¡¢
。
16
c£Ò¸_¶º
3D5´Ò¸
,10%
$
!£C`
,
Ì~p
,
d
(5μm)。ªÒ~¬
J
,TBST
·
3
}
,3% H2O2[15min,æ,^
f
,TBST
·
3
}
,
2
CD68(1∶400)
î
F4/80
(1∶200)
,ó
,
Þ
4℃
ìZè
;
3Ö
,
ð½Þ
30
min,TBST
·
3
}
,
2,
,37℃
[
30min,
DAB
VííVí
(1∶150),
|}J©·
,
+ASfß
,
ªÀ^ÒJ
,
7Ì¡
,
$!µ
。
}{Vî
}Sýqï¯
ImageProPlus
rø©s¡¢á
。
17
nOÅ_`
PCR(quantitativerealtime
PCR)
,Ò¸W>$3Ö½ù
15mL
vSK
$
,
2ù`
TRIzol
ÿÞêìf
,
UÆ
fïÒ
¸~¡/Ýÿ
,
2ù
100μL.,+640s,=
Þ
2min
ïMÌ¡â
;4℃,13000r·min-1
vS
15min,¯
îÉ>´:S3.fL>óÉùD
EP
K$
;
|CK$2ùÉóEEg
,
Ü
î
,
ð=Þ
10min
ï
RNA
°I
;4℃,13000r·
min-1
vS
10min,
Í:f
,
2ù
75%
(DEPC
JÖ
)1mL
·:Egq_}
4℃,13000r·
min-1
vS
5min;
½ù×g3$MÌ
,
2ù
30μLRNasefreeJÎÝ;º`RNA^,éò
íäúûlmÿnÅ_`
PCR。
¢¨ª«
w
Invitrogen
BCDEê«
。
¢¨ÆO
2。
2
nOÅ_`
PCR
¢¨ÆO
Table2 ListofprimersusedforquantitativerealtimePCR
좨
(5′3′)
õ좨
(5′3′) PCR
w:
/bp
Ucp2 ATGGTTGGTTTCAAGGCCACA CGGTATCCAGAGGGAAAGTGAT 109
TNFα CAGGCGGTGCCTATGTCTC CGATCACCCCGAAGTTCAGTAG 89
Ccl2 TTAAAAACCTGGATCGGAACCAA GCATTAGCTTCAGATTTACGGGT 121
F4/80 CTGCACCTGTAAACGAGGCTT GCAGACTGAGTTAGGACCACAA 127
CD68 TGTCTGATCTTGCTAGGACCG GAGAGTAACGGCCTTTTTGTGA 75
Mrc1 CTCTGTTCAGCTATTGGACGC TGGCACTCCCAAACATAATTTGA 190
Arg1 CTCCAAGCCAAAGTCCTTAGAG AGGAGCTGTCATTAGGGACATC 184
18
=ò©s}
ºBs=òÆÄÓ
珋x±s,w¯GraphPadPrism60røn©s¡¢,
¶oúûw¯
OnewayANOVA
¡¢#
Dunnett
¶
o
,P<005
ÓEB©sd
。
2
á
21
Ò¸ôÃý
ÏÒ
db/m
:g
´ôÃ
,
íDòÒ
,
Fr
。db/db
:g
Ò¸óEE@w
,
íD(
,
F
,
Dä
ÎV¹
,
2ÄÚÒ:g´R÷NI
;
CÄcd
úÿ
,
íD
FÆBV¹ef
,
q
=¡VäÎ
,
óEV¹*:
,
q
1。
Adb/m
:g
;Bdb/db
:g
;Cdb/db+TSF
:g
。
q
1
xÒ:g´+
Fig1 Morphologicalstudyofthelivers
22
cdúÏ
db/db
:gó#ØÙ
db/
db
:g
db/m
:gó@2V¹
;
JKC,
12
ÿ
,
Ö
db/db
Òâ
,
cdú?V¹*F
db/db
:
gó@2#´
,
q
2。
23
cdúÏ
db/db
:gtR´R
°E
ØÙ
Ö
db/m
:gâ
,db/db
:gt$
TC
#
TG
áV¹f
,
¡:gó8ÖÝR÷P×E
,
CÄcdúÿ?V¹T«
db/db
:gt
TC
#
TG
Jþ
;
Ù+
,
äò
O
ßíVÄ
db/m
:gl
\Ç=R÷
,
l@$ýQ
,
Í
db/db
:g
´Ò¸¡$wR÷#ø8
,
R÷N!^I
,
äò
O
Ú!ÏíDEV¹@2
,
CÄcdú
:gR
°EV¹ST
,
ø8*F
,
q
3。
24
cdúÏ
db/db
:g´Ò¸jkl·_
ØÙ
nOÅ_`
PCR
á VÄ
,
Ö
db/
m
:g
,db/db
:g´Ò¸jklëj¨
CD68
#
F4/80
V¹f»
,
CÄcdúÿ
ÆBV¹ST
;
c£Ò¸_á ¦
vncdú
?V¹T«
CD68
#
F4/80
,
q
4。
25
cdúÏ
db/db
:göíR÷Ò¸jkl
·5961·
2016
y
5
z À
41
ÁÀ
9
}
Vol41,No.9 May,2016
Ö
db/m
:gâ
P<0001;
Ö
db/db
:gâ
#P<001,##P<0001。
q
2
xÒ:góN_Ö
Fig2 Changesinbodyweightgainandtheliverweight
Ö
db/m
:gâ
P<005,P<0001;
Ö
db/db
:gâ
#P<005(
q
4
¦
)。
q
3
xÒ:gt$
TC,TG
Jþ´äò
O
ßí
(×400)
Fig3 QuantificationofTCandTGinserumandhepaticOilRedOanalysis(×400)
¸_¡mØÙ
Ö´Ò¸$jkl·_OP
â¦
,db/db
:göíR÷Ò¸
(whiteadiposetissue,
WAT)CD68
#
F4/80
mRNA
JþV¹ê
db/m
:g
,
Ícdú?V¹M
CD68
#
F4/80
mRNA
Jþ
;
Ù+
,
Ö
db/m
:gâ
,db/db
:g
öíR÷Ò¸jkl
M1
·_ëj¨¢£Fä
¶α(tumornecrosisfactorα,TNFα)mRNAJþV
¹
,
CÄcdúÿ?V¹T«
;M2
m·
_ëj¨c
C
mYó
1(mannosereceptorC
type1,Mrc1)
#Õ¡
(arginase,Arg1)
¦
V¹
f»
,
vcdúõÿqbM
mRNA
Jþ
;
Ö
Ù¦O
,
è_¶
(chemokineligand2,Ccl2)
#Ýc
>Ãö
2(uncouplingprotein2,Ucp2)mRNA
Jþ
db/m
:gV¹f»
,
cdúõÿV¹M
,
q
5。
3
s
C57BLKS/Jdb/db
:gû
Leptin
YóG¾
þMmm
2
mÖc¦q:g
,
¼BtR
、
tcE
,
ó@2ÉÝ
,
NB´R÷
NÖ
Ý
,
û/R÷¨xm
[
,
£õnoʯ
db/db
:gÓnoÏcäcdú¤»ÁRP
×hi$¯âãf
。
NAFLD
mqfÓf-
,
w
Day
#
James
¤
1998
y2Ö
“
}]
”
HûååÓDX
mqf
[5]。
¼0wê
、
c¦qÉþ¸S
,¢ÏRP×E
,
~vR÷ÖäLþ
,
·6961·
Y
ùÉ
:
cdúef
db/db
:gRP×hiÖjkl·_¡mno
q
4
xÒ:g´Ò¸$
CD68,F4/80
N_
(×400)
Fig4 RTPCRandimmunohistologicalstainingofhepaticCD68andF4/80(×400)
Ö
db/m
:gâ
P<005,P<001,P<0001;
Ö
db/db
:gâ
#P<005,##P<001,ns
=V¹!E
。
q
5
xÒ:göíR÷Ò¸jklëj¨ N_
Fig5 ThemRNAlevelsofmarkersofmacrophageactivation
E·°E¤´ÉÒ¸e«R÷N
;
À}]
wêfó8-_þE¯»þ-_ö
,
Î
Ö
ÝRï!Öÿ§¶½½þïlY¥
。
ãyäuäuZãëW´jklr
c£õöû
NAFLD
mqfÌÍÏ
Wâ_»Á¯
[68]。
jklÓ[ÆE
!
wl
,
ä>êÈ÷lq¡_Ó«ºR
plù+t
,
ÌÿùxÒ¸ÿ¡_Ójk
l
,
´$
Kufer
l
,
¤¥¦©}q}#
ÖOPSjkl+B¥¦·¬
,
mEx
M©¨Ä
。
´ûBó_c£´µ
,
R
÷Ò¸-©Z±l¶è_¶
、
¢£Fä
¶¢+Ï´Ò¸8MÄ-©ØÙ
,
Ò
¸-©·!-
,
ÍþR÷m©m
。
Ù+
,
R
E°E¤´Ò¸+Ö
Kufer
l·
W͢ϩKÿ§õö
,
[ôOá ,+
·7ÞlÍ¢m_m©
[9]。
w¡
,
jklÏR÷ÿ§õöB
·7961·
2016
y
5
z À
41
ÁÀ
9
}
Vol41,No.9 May,2016
ÏÖ¯
,
~Mÿ#,ÿ¯
,
-©
á û
w·_§mª`
[10]。
öíR÷Ò¸¡¤
TNFα,IL6Él¶jkl·_?þ
¡V¸S
,ÖqB´¥¦
[1112]。
õá VÄ
,
cdúJKC,
12
ÿ?V¹T
«täLþ
、
u+CJþq*´R÷N
^
;
Ù+
,
cdúV¹M´Ò¸#öíR÷Ò
¸$
CD68
Ö
F4/80
,
2ÄcdúÏR÷
:gó8jkl·B[`M¯
;
[
:¡¢mÝcdú?MöíR÷Ò¸
M1
·_ë
j¨
TNFαmRNA ,Í M2m·_ëj¨
Mrc1
#
Arg1
Ø=V¹T«
,
gº?ûR÷Ò
¸8MÄeN[±íª!f
。
ã}Bm
Ý
,
jkl¤
NAFLD
ÿ§mmßé#ÿ}w
$!¨l
、
y@lRÒBÏ]d>ô
,
õ
ÖÙ䢡âjkl·_¤
NAFLD
m©mÏÏ_¯
[1314]。
vjkl
¡mw<±¡¶Öfª`
,
ååq¥$¡
@
。
<ëdû
,
Ö
db/m
:gâ
,db/db
:
göíR÷Ò¸$
Ucp2
#
Ccl2
,
cdú
¦
?ÂM Jþ
,
¡cdúefRP×
hi?Ö»ÁR
-_#Mÿ!lRÒ
Bã
。
B¡
,
ÿ§¥¦ûþ
NAFLD
m©
Ãz¾GS
,
q?Â@´R÷lÃ
ö
CD36
ÍïMô©$wR÷ù´ª
«ZR
WÍ
NAFLD
m©m
[15]。
w
Ù?
,
ÿ§MÄsû´#öíR÷Ò¸$w
jklRÒÂÖâ
NAFLD
。
bf
,
c
dú?ÂV¹ef
db/db
:gRP×ER÷
N
,
f?ÖMjkl
M1
m·_
,
ef
´#R÷Ò¸8MÄÿ§ÞÃBã
。
[
uv=w
]
[1] LoombaR,SanyalAJ.TheglobalNAFLDepidemic[J].Nat
RevGastroenterolHepatol,2013,10(11):686.
[2] GordonS,MartinezFO.Alternativeactivationofmacrophages:
mechanismandfunctions[J].Immunity,2010,32(5):593.
[3]
S
,
!wY
,
$¹+
,
É
.
cdúÏMm!
2
mc¦qx
mwgRP×´RNØÙ
[J].
$$A,-.
,
2010,25(11):1778.
[4] LiP,ChenY,LiuJ,etal.Eficacyandsafetyoftangshenfor
mulaonpatientswithtype2diabetickidneydisease:amulti
centerdoubleblindedrandomizedplacebocontroledtrial[J].
PLoSONE,2015,10(5):e0126027.
[5] DayCP,JamesOF.Steatohepatitis:ataleoftwo"hits"?
[J].Gastroenterology,1998,114(4):842.
[6] YaoJ,ZhouCS,MaX,etal,FXRagonistGW4064aleviates
endotoxininducedhepaticinflammationbyrepressingmacrophage
activation[J].WorldJGastroenterol,2014,20(39):14430.
[7] WehrA,BaeckC,UlmerF,etal.Pharmacologicalinhibitionof
thechemokineCXCL16diminisheslivermacrophageinfiltration
andsteatohepatitisinchronichepaticinjury[J].PLoSONE,
2014,9(11):e112327.
[8] Lastra,G,ManriqueC,JiaG,etal.TheVASProadtoNAFLD:a
macrophagedetour[J].Diabetes,2015,64(8):2711.
[9] BrowningJD,HortonJD.Molecularmediatorsofhepaticsteato
sisandliverinjury[J].JClinInvest,2004,114(2):147.
[10] DiehlAM.NonalcoholicsteatosisandsteatohepatitisIV.Nonal
coholicfatyliverdiseaseabnormalitiesinmacrophagefunction
andcytokines[J].Am JPhysiolGastrointestLiverPhysiol,
2002,282(1):G1.
[11] KernPA,RanganathanS,LiC,etal.Adiposetissuetumor
necrosisfactorandinterleukin6expressioninhumanobesityand
insulinresistance[J].AmJPhysiolEndocrinolMetab,2001,
280(5):E745.
[12] CanceloR,TordjmanJ,PoitouC,etal.Increasedinfiltrationof
macrophagesinomentaladiposetissueisassociatedwithmarked
hepaticlesionsinmorbidhumanobesity[J].Diabetes,2006,55
(6):1554.
[13] GaddVL,SkoienR,PowelEE,etal.Theportalinflammatory
infiltrateandductularreactioninhumannonalcoholicfatyliver
disease[J].Hepatology,2014,59(4):1393.
[14] KitadeH,SawamotoK,NagashimadaM,etal.CCR5playsa
criticalroleinobesityinducedadiposetissueinflammationand
insulinresistancebyregulatingbothmacrophagerecruitmentand
M1/M2status[J].Diabetes,2012,61(7):1680.
[15] WangC,HuL,ZhaoL,etal.Inflammatorystressincreaseshe
paticCD36translationaleficiencyviaactivationofthemTOR
signalingpathway[J].PLoSONE,2014,9(7):e103071.
[
xy-0
]
·8961·