全 文 :第 32 卷第 3 期
2013 年 6 月
中 国 野 生 植 物 资 源
Chinese Wild Plant Resources
Vol. 32 No. 3
Jun. 2013
收稿日期:2012 - 12 - 28
基金项目:国家自然科学基金(81073039) ;江苏省自然科学基金(BK2011627) ;中央高校基本科研业务费专项基金
(JKQ2009008) ;中央高校基本科研业务费专项基金(JKY2011074) ;天然药物活性组分与药效国家重点实验室资助
项目(JKGQ201117) ;江苏省优势学科资助项目(PAPD)
作者简介:崔伟曦(1988 -) ,女,从事中药及制剂分析。
* 通讯作者:王强。E - mail:qwang49@ 163. com
doi:10. 3969 / j. issn. 1006 - 9690. 2013. 03. 008
山绿茶有效部位抗大鼠非酒精性脂肪肝药效研究
崔伟曦1,杨 杰1,陈筱清2,毛 茜1,闻晓东1,王 强1*
(1.中国药科大学 中药学院中药分析教研室,江苏 南京 210009;2.首都医科大学 中药学院,北京 100069)
摘 要 采用 80%乙醇加热回流和大孔树脂吸附法从山绿茶中提取分离得到总酚酸和总黄酮两个有效部位,分别
对两部位中总酚酸和总黄酮及其中主要成分的含量进行了测定,并对山绿茶两个有效部位抗大鼠非酒精性脂肪肝
药效作用进行了考察,结果显示,两个有效部位对非酒精性脂肪肝大鼠的肝指数、血脂、转氨酶和肝脏脂肪变性程
度均有显著的改善作用。
关键词 山绿茶;总酚酸;总黄酮;非酒精性脂肪肝
中图分类号:S481 + . 9 文献标识码:A 文章编号:1006 - 9690(2013)03 - 0028 - 04
Flavonoid-rich Fraction and Phenolic Acid-rich Fraction from Ilex
hainanensis Merr. Attenuate Non-alcoholic Fatty Liver Disease in Rats
Cui Weixi1,Yang Jie1,Chen Xiaoqing2,Mao Qian1,Wen Xiaodong1,Wang Qiang1*
(1. Department of Chinese Materia Medica Analysis,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009,
China;2. School of Traditional Chinese Medicine,Capital Medical University,Beijing 100069,China)
Abstract The flavonoid-rich fraction and phenolic acid-rich fraction were extracted from Ilex hainanensis
Merr. by reflux with 80% ethanol and then isolated by HPD-400 resin. The contents of total flavonoid,
total phenolic acid and the main constituents in the two fractions were measured using UV-Vis and HPLC
methods. The effects of the two fractions on non-alcoholic fatty liver disease in rats were investigated and
the results revealed that both the two fractions showed significant effects in reducing liver index,plasma
levels of cholesterol,triglyceride and transaminase,and attenuating steatosis in rats with non-alcoholic
fatty liver disease.
Key words Ilex hainanensis Merr.;flavonoid-rich fraction;phenolic acid-rich fraction;non-alcoholic
fatty liver disease.
山绿茶为冬青科冬青属植物海南冬青(Ilex
hainanensis Merr.)的干燥叶,主产于广西、海南等
地,全年可采,资源丰富,具有悠久的民间药用历史,
多泡茶饮,具有清热解毒,消肿止痛,活血通脉的功
效,主要用于降血压,降血脂,降胆固醇,冠心病,脑
血管意外所致的偏瘫等疾病[1]。本实验室前期研
究表明,山绿茶对高脂饲料诱导的大鼠非酒精性脂
肪肝(Non-alcoholic Fatty Liver Disease,NAFLD)疗
效显著,但其有效部位和活性成分尚不明确。化学
研究表明,山绿茶中富含酚酸和黄酮类成分[2 - 3],故
本文对山绿茶中总酚酸和总黄酮两个有效部位抗大
鼠非酒精性脂肪肝的药效作用进行了研究,以期对山
绿茶资源的开发与有效利用及药效学研究提供依据。
1 材 料
1. 1 植物来源
山绿茶采自广西,由中国药科大学王强教授鉴
定为冬青科冬青属植物海南冬青(Ilex hainanensis
—82—
第 3 期 崔伟曦,等:山绿茶有效部位抗大鼠非酒精性脂肪肝药效研究
Merr.)的叶,标本(No. 20080201)存放于中国药科
大学中药分析教研室。
1. 2 主要试剂与仪器
甘油三酯(TG)试剂盒,总胆固醇(TC)试剂盒,
低密度脂蛋白胆固醇(LDL - c)试剂盒,高密度脂蛋
白胆固醇(HDL - c)试剂盒,血浆谷丙转氨酶(ALT)
测定试剂盒,血浆谷草转氨酶(AST)测定试剂盒均
购自南京建成生物工程研究所;乙腈和甲酸购自
Merck公司(色谱纯,Merck,Darmstadt,Germany) ;
其它试剂均为分析纯。
紫外 - 可见分光光度计(UV - 2501PC,Shi-
madzu) ;高效液相色谱仪(Agilent 1100 Series)、DAD
检测器、Agilent ChemStation 色谱工作站;色谱柱
(Kromasil,4. 6 × 150 mm) ;酶标仪(Epoch,BioTek,
USA) ;匀浆机(IKA,T10 basic Ultra - TURRAX,
Germany)。
1. 3 动物及饲料
清洁级雄性 SD大鼠(120 ~ 150 g) ,由江苏大学
实验动物中心提供(许可证号 SCXK(苏)2000 -
0002)。
高脂饲料配方 基础饲料 858 g /kg,猪油 100 g /
kg,胆固醇 10 g /kg,胆酸钠 2 g /kg,蔗糖 30 g /kg;普
通饲料及高脂饲料均由江苏省南京市青龙山动物繁
殖厂提供。
2 方 法
2. 1 山绿茶总酚酸和总黄酮的制备
取山绿茶药材 5 kg,以 80 %乙醇溶液浸泡过
夜,加热回流提取 2 次,每次 2 h。提取液减压回收
溶剂,浓缩得稠浸膏,以 4 000 r·min -1离心 10 min,
分离得到上清液和沉淀部分。上清液经 HPD - 400
大孔树脂吸附分离,先以水洗脱 3 倍柱体积,弃去,
再分别以 10%、30%和 50%乙醇洗脱,合并 10%和
30%乙醇洗脱液,减压回收溶剂,浓缩得浸膏,自然
晾干,粉碎,过 60 目筛,得到山绿茶总酚酸有效部
位,得率 1. 62%;取 50%乙醇洗脱液,减压回收溶
剂,浓缩得浸膏,自然晾干,粉碎,过 60 目筛,得到山
绿茶总黄酮有效部位,得率 1. 52%。实验时,一定
量总酚酸和总黄酮粉末用 0. 5%羧甲基纤维素钠
(CMC - Na)制成混悬溶液用于给药。
2. 2 山绿茶总酚酸和总黄酮的测定
2. 2. 1 山绿茶总酚酸的测定
精确称取总酚酸粉末约 4 mg,置棕色量瓶中,
精密加入 50%乙醇 20 mL,称重,超声提取 30 min,
用 50%乙醇补足原重,过滤,续滤液即为供试品溶
液。精密量取供试品溶液 1. 0 mL,置于 25 mL棕色
量瓶中,加 50%乙醇至 5 mL,再分别精密加入0. 3%
十二烷基硫酸钠硫酸钠溶液 2 mL 和 0. 5%铁氰化
钾 - 1%三氯化铁(1∶ 1)混合溶液 1 mL,摇匀,暗处
放置 5 min,加 0. 1 moL /L盐酸溶液至 25 mL,摇匀,
暗处放置 20 min,在 729 nm波长处测定吸收值。以
绿原酸为对照品,制备标准曲线,得回归方程,计算
总酚酸含量。
2. 2. 2 山绿茶总黄酮的测定
精密称总黄酮粉末约 10 mg,置锥形瓶中,加入
20 mL甲醇,称重,超声提取 30 min,用甲醇补足原
重,过滤,取续滤液即为供试品溶液。精密量取供试
品溶液 1. 0 mL,置于 10 mL量瓶中,加甲醇至 3 mL,
加 5%亚硝酸钠溶液 0. 3 mL,摇匀,静置 6 min,加
10%硝酸铝溶液 0. 3 mL,摇匀,静置 6 min,加 4%氢
氧化钠试液 4 mL,在再加甲醇至刻度,摇匀,放置 15
min,在 500. 5 nm 波长处测定吸收值。以芦丁为对
照品,制备标准曲线,得回归方程,计算总黄酮含量。
2. 3 总酚酸和总黄酮中主要成分含量测定
2. 3. 1 总酚酸中绿原酸的含量测定
取总酚酸粉末约 2 mg,精密称定,置 1 mL棕色
量瓶中,精密加入甲醇 0. 8 mL,超声处理 30 min,放
冷,甲醇定容至 1 mL,用 0. 45 μm的微孔滤膜过滤,
取续滤液,即得供试品溶液。在下述色谱条件下,以
绿原酸为对照品,标准曲线法进行检测定量。色谱
条件:色谱柱:Kromasil C18 柱(4. 6 mm × 150 mm) ;
柱温:25 ℃;流速:1 mL /min。流动相:A:0. 1%甲酸
-水,B:0. 1%乙腈;进样量:10 μL。梯度洗脱程序
见表 1;检测波长:326 nm。
表 1 总酚酸中绿原酸测定梯度洗脱程序
时间(min) 0 ~ 30 30 ~ 55 55 ~ 60
A(%) 93 ~ 91 91 ~ 65 65
B(%) 7 ~ 9 9 ~ 35 35
2. 3. 2 总黄酮中芦丁和华中冬青黄酮 - 7 - O - β
- D -吡喃葡萄糖苷的含量测定
精密称取总黄酮粉末约 2 mg,置于 1 mL 量瓶
中,精密加入 0. 8 mL 甲醇,超声 30 min,放冷,甲醇
定容至 1 mL,用 0. 45 μm 的微孔滤膜过滤,取续滤
液,即得供试品溶液。在下述色谱条件下,以芦丁和
华中冬青黄酮 - 7 - O - β - D -吡喃葡萄糖苷制备
混合对照品,标准曲线法进行检测定量。色谱条件:
色谱柱:Kromasil C18柱(4. 6 mm × 150 mm) ;柱温:
25 ℃;流速:1 mL /min。流动相:A:0. 1%甲酸 -水,
—92—
中 国 野 生 植 物 资 源 第 32 卷
B:0. 1%乙腈;进样量:10 μL。梯度洗脱程序见表
2;检测波长:256 nm、285 nm。
表 2 总黄酮中芦丁和华中冬青黄酮测定梯度洗脱程序
时间(min) 0 ~ 25 25 ~ 40
A(%) 90 ~ 65 65 ~ 50
B(%) 10 ~ 35 35 ~ 50
2. 4 大鼠非酒精性脂肪肝模型的建立
34 只雄性 SD 大鼠适应性饲养 1 周之后,随机
分为正常组(n = 11)和模型组(n = 23) ,正常组大鼠
给以普通饲料,模型组大鼠给以高脂饲料。饲养室
内温度控制在 20 ± 2 ℃,相对湿度 60% ~ 70%,明
暗各 12 h,自由饮水、进食。3 周后,隔夜禁食 12 h,
眼眶静脉取血,分离血浆,测定各大鼠血浆甘油三酯
(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL
- c)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL - c)、谷丙转氨酶
(ALT)和谷草转氨酶(AST)。另外,随机抽取各组
5 只大鼠,脱颈椎处死,分离肝脏并称重,计算肝指
数(肝湿重 /大鼠体重 × 100%) ,并取肝脏相同部位
用 4%中性多聚甲醛固定,进行肝脏病理学检查。测
定结果(表 3)显示,与正常组相比,模型组大鼠体重
和肝指数均显著升高(P < 0. 05,P < 0. 01) ,血浆 TG、
TC、LDL - c、ALT 和 AST 也较正常组明显升高(P <
0. 01) ,HDL - c较正常组降低(P < 0. 01) ;H&E 染色
结果显示(图 1A和 B) ,正常组大鼠肝脏肝小叶结构
清晰,肝细胞排列呈索状,肝窦无扩张充血,未见明
显的脂肪变性;模型组大鼠肝脏肝小叶结构尚可见,
但部分肝细胞体积变大变圆、胞浆内有许多小的脂
肪空泡或融合成较大的脂滴,肝窦受压变窄,出现明
显的脂肪变性,由此表明,NAFLD模型建立成功。
2. 5 给药方法
造模成功后,模型组大鼠随机分为模型对照组
(n = 6)、酚酸给药组(n = 6)和黄酮给药组(n = 6)。
以上 3 组大鼠给以高脂饲料,正常组大鼠(n = 6)给
以普通饲料,所有大鼠均自由进食和饮水。此外,酚
酸给药组灌胃给以 105 mg /(kg·d)总黄酮 - 0. 5%
CMC - Na混悬液,黄酮给药组给以 100 mg /(kg·d)
总酚酸 - 0. 5% CMC - Na 混悬液,即相当于生药量
6. 5 g /(kg·d) ;正常组和模型对照组给以 10 mL /
(kg·d)0. 5% CMC - Na。给药周期为 2 周。
2. 6 肝指数和血液指标的检测
给药 2 周后,大鼠隔夜禁食 12 h,称量体重,眼
眶静脉取血,分离血浆,并分离出肝脏,预冷生理盐
水洗净,吸水纸吸干,称取肝脏湿重,计算肝指数。
血浆 TG、TC、LDL - c、HDL - c、ALT 和 AST 的
含量按照相应试剂盒的说明书进行测定。
2. 7 肝脏中 TG和 TC的测定
剪取相同部位肝组织,用无水乙醇制成 10%肝
匀浆(肝组织重量∶无水乙醇体积 = 1∶ 9)。肝组织中
TG和 TC含量按照相应试剂盒的说明书进行测定。
2. 8 肝脏病理学检查
取相同部位肝组织,4%中性多聚甲醛溶液固
定,脱水,石蜡包埋,制片(4μm 厚) ,苏木素 -伊红
(Hematoxylin - Eosin,HE)染色,由病理专业人员在
光学显微镜下阅片,观察组织的病理学改变,并按照
肝细胞脂肪变的程度进行评分(计分:0,无;计分:
1,< 1 /4;计分:2,1 /4 ~ 1 /2;计分:3,1 /2 ~ 3 /4;计
分:4,> 3 /4)[4 - 5]。
2. 9 统计学处理
采用 SPSS11. 5 统计软件进行统计学分析。计
量资料以 x ± SEM 表示。P < 0. 05 为有统计学差
异,P < 0. 01 为有显著统计学差异。
3 结 果
3. 1 山绿茶总酚酸和总酚酸及其主要成分的含量
紫外 -可见分光光度法结果显示,总酚酸的含
量为 78. 33% ±0. 29%,总黄酮的含量为 75. 32% ±
0. 35%。高效液相法结果显示,山绿茶总酚酸中绿
原酸的含量为 3. 70% ± 0. 12%;总黄酮中芦丁的含
量为 1. 27% ±0. 05%,华中冬青黄酮 - 7 - O - β -
D -吡喃葡萄糖苷的含量为 1. 78% ±0. 03%。
3. 2 各组大鼠体重、肝指数及血液指标的变化
各组大鼠体重、肝指数及各血液指标的结果见
表 3。喂食 5 周后,模型组大鼠体重和肝指数均较
正常组显著升高(P < 0. 05,P < 0. 01) ,血浆 TG、
TC、LDL - c、ALT和 AST也较正常组明显升高(P <
0. 05 或 P < 0. 01) ,HDL - c 较正常组降低(P <
0. 01)。与模型组相比,酚酸给药组和黄酮给药组
大鼠体重和肝重均有降低的趋势,酚酸给药组大鼠
体重和肝重分别较模型组降低 3. 72%和 9. 57%,黄
酮给药组降低 8. 09%和 12. 57%,但未呈现显著性
差异(P > 0. 05) ;酚酸给药组和黄酮给药组大鼠肝
指数分别较模型组降低 6. 44%和 5. 71%,且存在显
著性差异(P < 0. 05) ;血脂各项指标的检测结果显
示,酚酸给药组和黄酮给药组大鼠血浆 TG、TC 和
LDL - c分别较模型组降低 41. 58%和 35. 70%(P <
0. 05)、37. 44%和 33. 60%(P < 0. 05)、43. 09%(P
< 0. 05)和 64. 43%(P < 0. 01) ,HDL - c 分别较模
型组升高 32. 65%和 22. 45%(P < 0. 05) ;转氨酶检
—03—
第 3 期 崔伟曦,等:山绿茶有效部位抗大鼠非酒精性脂肪肝药效研究
测结果显示,酚酸给药组和黄酮给药组大鼠血浆
ALT分别较模型组降低 33. 20% (P < 0. 01)和
21. 50%(P < 0. 05)、AST 分别较模型组降低
27. 75%(P < 0. 01)和 14. 30%(P < 0. 05)。由以上
结果可以看出,总黄酮在降低 NAFLD大鼠体重和肝
重方面略优于总酚酸;而总酚酸在改善血脂和转氨
酶方面略优于总黄酮,但差异并不显著,提示山绿茶
抗 NAFLD是通过多种成分共同作用实现的。
表 3 各组大鼠体重、肝指数及各血液指标的比较
指标
三周
正常组 模型组
五周
正常组 模型组 酚酸给药组 黄酮给药组
体重(g) 252. 33 ± 9. 72 287. 82 ± 7. 16* 295. 40 ± 10. 37 338. 60 ± 19. 33# 326. 00 ± 5. 88 311. 20 ± 13. 67
肝重(g) 6. 53 ± 0. 17 9. 43 ± 0. 15** 7. 97 ± 0. 54 12. 02 ± 0. 63## 10. 87 ± 0. 19 10. 51 ± 0. 63
肝指数(%) 2. 53 ± 0. 08 3. 54 ± 0. 25** 2. 64 ± 0. 06 3. 57 ± 0. 08## 3. 34 ± 0. 09※ 3. 37 ± 0. 07※
TG(mg /dL) 52. 85 ± 3. 35 106. 11 ± 8. 79** 42. 79 ± 5. 81 98. 11 ± 15. 67# 57. 31 ± 6. 69※ 63. 08 ± 7. 70※
TC(mg /dL) 59. 49 ± 2. 81 89. 97 ± 2. 52** 57. 41 ± 1. 95 91. 61 ± 13. 61# 56. 48 ± 1. 86※ 60. 83 ± 5. 06※
LDL - c(mg /dL) 8. 67 ± 1. 39 19. 46 ± 1. 27** 11. 21 ± 3. 70 31. 68 ± 4. 38## 18. 03 ± 2. 07※ 11. 27 ± 2. 54※※
HDL - c(mg /dL) 45. 61 ± 5. 04 27. 09 ± 0. 87** 36. 05 ± 2. 12 24. 20 ± 0. 84## 32. 10 ± 2. 87※ 29. 63 ± 2. 38※
ALT(U /L) 8. 48 ± 0. 14 10. 65 ± 0. 23** 8. 64 ± 0. 49 11. 88 ± 0. 65## 7. 93 ± 1. 08※※ 9. 32 ± 0. 86※
AST(U /L) 11. 40 ± 0. 74 14. 30 ± 0. 52** 10. 32 ± 2. 27 15. 46 ± 0. 54# 11. 17 ± 0. 69※※ 13. 25 ± 0. 90※
*P < 0. 05,**P < 0. 01,与正常组 3 周相比较;#P < 0. 05,##P < 0. 01,与正常组 5 周相比较;※P < 0. 05,※※P < 0. 01,与模型组 5 周相比较.
3. 3 各组大鼠肝组织中 TG和 TC的含量变化
各组大鼠肝脂质 TG、TC 含量见表 4。与正常
组相比,模型组大鼠 10%肝组织匀浆中 TG和 TC含
量均显著升高(P < 0. 01)。酚酸给药组大鼠肝匀浆
中 TG含量较模型组降低 5. 72%,但两组间不存在
显著性差异,TC 含量较模型组降低 18. 55%(P <
0. 01) ;黄酮给药组大鼠肝匀浆中 TG 和 TC 含量分
别较模型组降低 20. 71%和 26. 62%(P < 0. 01) ,在
降低 NAFLD大鼠肝脂质含量方面略优于酚酸组。
表 4 各组大鼠肝脏中甘油三酯和胆固醇的含量
指标
五周
正常组 模型组 酚酸给药组 黄酮给药组
TG(mg /g liver) 5. 36 ± 0. 44 13. 47 ± 0. 55## 12. 70 ± 0. 76 10. 68 ± 0. 51※※
TC(mg /g liver) 2. 11 ± 0. 16 4. 83 ± 0. 14## 3. 93 ± 0. 27※※ 3. 54 ± 0. 08※※
#P < 0. 05,## P < 0. 01,与正常组 5 周相比较;※ P < 0. 05,※※ P <
0. 01,与模型组 5 周相比较.
3. 4 各组大鼠肝脏组织形态学变化
光镜下观察各组大鼠肝组织 HE 染色切片,结
果如图 1 所示,3 周时正常组大鼠肝组织肝小叶结
构清晰,肝细胞排列呈索状,肝窦无扩张充血,未见
明显的脂肪变性(图 1A) ;模型组大鼠肝组织肝小
叶结构尚可见,但部分肝细胞体积变大变圆、胞浆内
有许多小的脂肪空泡或融合成较大的脂滴,肝窦受
压变窄,出现明显的脂肪变性(图 1B)。5 周时正常
组大鼠肝组织形态基本与 3 周时相同,未见异常病
理变化(图 1C) ;模型组大鼠肝组织脂变程度较 3 周
时明显加重,呈弥漫性脂肪变性(图 1D) ;酚酸给药
组大鼠(图 1E)和黄酮给药组大鼠(图 1F)肝组织脂
肪变性程度均明显减轻,脂变积分如图 1G 所示,与
模型组相比,酚酸给药组和黄酮给药组大鼠肝组织
脂变积分均显著降低(分别为 P < 0. 05 和 P <
0. 01) ,黄酮的改善效果略优于酚酸,但 2 组的脂变
积分之间不存在显著性差异。
图 1 肝组织病理切片(HE染色,× 200)
各组大鼠肝组织切片代表图:(A)正常组 3 周,(B)模型组 3 周,(C)
正常组 5 周,(D)模型组 5 周,(E)酚酸给药组,(F)黄酮给药组;
(G)肝细胞脂肪变性积分,其中正常组 3 周和正常组 5 周时大鼠肝
组织脂变积分为 0. 00 ± 0. 00. * P < 0. 05,**P < 0. 01,与正常组 3 周
相比较;#P < 0. 05,## P < 0. 01,与正常组 5 周相比较;※ P < 0. 05,
※※P < 0. 01,与模型组 5 周相比较。 ( 下转第 46 页)
—13—
中 国 野 生 植 物 资 源 第 32 卷
五味子的红斑点大小和分布没有规律性,且这种植
株极少发现,因此推断除控制五味子果色深浅的三
对基因 Aa、Bb 和 Cc 外,还有一对与控制果色深浅
基因连锁较为紧密的基因 Dd,这个基因控制红色分
布的均匀性,当控制果色分布的基因突变或者缺失
导致红色分布不均匀,成斑点状分布,类似嵌镶遗
传。
3 果实与果梗颜色组合
在调查中发现果实颜色与果梗颜色也具有不同
组合,有白果白梗,白果红梗,粉白果白梗,粉红果红
梗,红果红梗几种组合,未发现红果白梗,说明果实
与果梗颜受不同基因控制,其组合具有不完全自由
性。
参考文献:
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4 结 论
山绿茶总黄酮在降低非酒精性脂肪肝大鼠体
重、肝重,肝脂质 TG 和 TC 含量以及改善肝脏组织
形态和脂肪变性方面略优于总酚酸;而总酚酸在改
善血脂和转氨酶方面略优于总黄酮,但两有效部位
抗非酒精性脂肪肝药效作用差异并不显著,提示山
绿茶抗非酒精性脂肪肝是通过多种成分共同作用实
现的。
山绿茶为常绿植物,其叶四季均可采,资源丰
富。目前山绿茶主要作为生产山绿茶降压制剂的原
料药材,疗效显著,此外,药理研究表明,山绿茶对于
高血脂症也具有较好的防治作用[6],本实验研究结
果表明,山绿茶总酚酸和总黄酮对非酒精性脂肪肝
也有较好的治疗作用。鉴于其较高的药用价值及丰
富的资源,山绿茶值得进一步开发利用。
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