全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 7 期 2011 年 7 月 ·1317·
HPLC 法同时测定珍珠菜提取物中 5 种黄酮
陈韶华 1，邹意琼 1, 2，吴 威 1，李 夏 1，许琼明 1*，杨世林 1
1. 苏州大学药学院，江苏 苏州 215123
2. 西南药业股份有限公司，重庆 400038
摘 要：目的 建立同时测定珍珠菜提取物中芦丁、异鼠李素-3-O-芸香糖苷、江户樱花苷、槲皮素、山柰酚的 HPLC 方法。
方法 采用 Chromasil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm），柱温 35 ℃，以乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相，梯度洗脱，
双波长检测（λ1＝283 nm，λ2＝370 nm），体积流量 1.0 mL/min。结果 5 个成分均能达到基线分离，线性回归方程分别为芦
丁 Y＝14 958 X＋179.22（r＝0.999 3），异鼠李素-3-O-芸香糖苷 Y＝12 126 X＋3.14（r＝0.999 4），江户樱花苷 Y＝23 821 X＋
76.81（r＝0.999 4），槲皮素 Y＝35 761 X－20.30（r＝0.999 5），山柰酚 Y＝39 078 X＋1.81（r＝0.999 1），芦丁、异鼠李素-3-O-
芸香糖苷、江户樱花苷、槲皮素、山柰酚进样量分别在 228.60～1 143.00、99.60～498.00、232.20～1 161.00、22.08～110.40、
15.12～75.60 ng 与峰面积线性关系良好，平均回收率分别为 97.8%、98.9%、102.4%、98.4%、92.2%。结论 本检测方法简
便、准确，为珍珠菜提取物中黄酮类成分的质量控制提供了依据。
关键词：HPLC；珍珠菜提取物；芦丁；江户樱花苷；槲皮素；异鼠李素-3-O-芸香糖苷；山柰酚
中图分类号：R286.02 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2011)07 - 1317 - 04
Simultaneous determination of five flavonoids in extract of Lysimachia clethroides
by HPLC
CHEN Shao-hua1, ZOU Yi-qiong1, 2, WU Wei1, LI Xia1, XU Qiong-ming1, YANG Shi-lin1
1. College of Pharmacy, Soochow University, Suzhou 215123, China
2. The Southwest Pharmaceutical Co., Ltd., Chongqing 400038, China
Abstract: Objective To develop an HPLC method for determination of five flavonoids (rutin, isorhamnetin-3-O-rutinoside, prunin,
quercetin, and kaempferol) in extract of Lysimachia clethroides. Methods HPLC was performed on a Chromasil C18 analytical
column (250 mm × 4.6 mm, 5.0 μm) at 35 ℃ with acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution as the mobile phase by gradient elution.
The detection wavelengths were 283 and 370 nm and the flow rate was 1.0 mL/min. Results Five flavonoids were separated perfectly.
The equation linear regressions were rutin Y＝14 958 X＋179.22 (r＝0.999 3), isorhamnetin-3-O-rutinoside Y＝12 126 X＋3.14
(r＝0.999 4), prunin Y＝23 821 X＋76.81 (r＝0.999 4), quercetin Y＝35 761 X－20.30 (r＝0.999 5), and kaempferol Y＝39 078
X＋1.81 (r＝0.999 1). Linearities of rutin, isorhamnetin-3-O-rutinoside, prunin, quercetin, and kaempferol were good in ranges of
228.60―1143.00, 99.60―498.00, 232.20―1161.00, 22.08―110.40, and 15.10―75.60 ng, respectively. The average recoveries were
97.8%, 98.9%, 102.4%, 98.4%, and 92.2%, respectively. Conclusion The validated method is simple, accurate, and able to provide
the basis for the quality control of flavonols in active fraction of L. clethroides.
Key words: HPLC; extract of Lysimachia clethroides Duby; rutin; prunin; quercetin; isorhamnetin-3-O-rutinoside; kaempferol
珍珠菜为报春花科植物虎尾珍珠菜 Lysimachia
clethroides Duby 的根或全草，具有清热利湿，活血
散痪，解毒消痈的作用[1]。文献报道[2-4]其化学成分
主要为黄酮类和皂苷类，早期文献报道[5]珍珠菜黄
酮苷对腹水型网状细胞肉瘤细胞有显著破坏作用，
并对瘤细胞有丝分裂有较明显的抑制作用。本课题
组对珍珠菜抗肿瘤活性部位的化学成分进行了较系
统的研究，发现其中总黄酮苷具有较好的抗肿瘤作
用[6-9]。以芦丁作为对照品，采用紫外分光光度法[10]
测定了珍珠菜提取物中总黄酮的量约为 55.2%。珍
收稿日期：2010-09-09
基金项目：国家自然科学基金资助项目（30873362）；“重大新药创制”科技重大专项资助项目（2009ZX09102-135）
作者简介：陈韶华（1961—），女，高级实验师，研究方向为天然药物化学。Tel: (0512)65882070 E-mail: chenshaohua@suda.edu.cn
*通讯作者 许琼明 Tel: (0512)65882080 E-mail: xuqiongming@suda.edu.cn
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 7 期 2011 年 7 月 ·1318·
珠菜中含有丰富的二氢黄酮，但紫外分光光度法不
能准确测定，为了更好地控制珍珠菜提取物中黄酮
类成分的量，本实验建立了以 HPLC 双波长法同时
测定提取物中芦丁、异鼠李素-3-O-芸香糖苷、江户
樱花苷、槲皮素、山柰酚的方法。
1 仪器与材料
日本 Shimadzu LC—20A 高效液相色谱仪（日
本岛津公司），含 SPD—M20A 二极管阵列检测器，
CBM—20A 系统控制器，CTO—20A 柱温箱；EL—
204 十万分之一分析天平（上海梅特勒-托利多仪器
有限公司）；SE—93 自动双重蒸馏水蒸馏器（上海
亚荣生化仪器厂）；KQ—100DE 数控超声仪（昆山
市超声仪器有限公司）；N—1001 旋转蒸发仪（日本
东京理化器械株式会社）；C—605 中压制备色谱仪
（瑞士 Buchi 公司）。
芦丁、异鼠李素-3-O-芸香糖苷、江户樱花苷、
槲皮素、山柰酚对照品均由本实验室分离得到，经
MS、1H-NMR 和 13C-NMR 确定结构，HPLC 峰面
积归一化法分析质量分数均达到 98%以上。珍珠菜
药材采购于苏州雷允上药材采购站，经苏州大学药
学院生药教研室刘春宇教授鉴定为 Lysimachia
clethroides Duby 的全草；珍珠菜提取物样品由苏州
大学药学院唐丽华课题组提供（批号分别为
200801、200802、200803，以芦丁为对照品，UV
法测定提取物中总黄酮的质量分数大于 50%）。乙
腈为色谱纯，水为二次蒸馏水，其余试剂为分析纯；
色谱硅胶为青岛海洋化工厂生产。
2 方法与结果
2.1 珍珠菜提取物的制备
取珍珠菜干燥药材，用 10 倍量 80%乙醇提取 3
次，合并提取液，加水沉淀除去弱极性物质，上清
液浓缩至无醇味，滤过，滤液上 AB-8 大孔树脂，上
样后先用水洗脱至无色，再依次用 40%、95%乙醇
洗脱，将 40%乙醇洗脱部位浓缩、冷冻干燥成粉末，
即得珍珠菜提取物。
2.2 色谱条件
色谱柱为 Chromasil C18 柱（250 mm×4.6 mm，
5.0 μm）；流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），
梯度洗脱：0～20 min，13%～35% A；20～30 min，
35%～100% A；体积流量 1.0 mL/min；双波长检测
λ1＝283 nm（江户樱花苷），λ2＝370 nm（芦丁、异鼠
李素-3-O-芸香糖苷、槲皮素、山柰酚）；柱温 35 ℃。
色谱图见图 1。
2.3 对照品储备液的制备
1-芦丁 2-异鼠李素-3-O-芸香糖苷 3-江户樱花苷 4-槲皮素 5-山柰酚
1-rutin 2-isorhamnetin-3-O-rutinoside 3-prunin 4-quercetin 5-kaempferol
图 1 混合对照品（A：λ＝370 nm，B：λ＝283 nm）和珍珠菜提取物（C：λ＝370 nm，D：λ＝283 nm）的 HPLC 色谱图
Fig. 1 HPLC chromatograms of mixed reference substances (A: λ = 370 nm, B: λ = 283 nm) and L. clethroides extract
(C: λ = 370 nm, D: λ = 283 nm)
精密称取各对照品适量，用甲醇溶解并定容，
分别得到含芦丁 381.0 μg/mL、异鼠李素-3-O-芸香
糖苷 166.0 μg/mL、江户樱花苷 387.0 μg/mL、槲皮
素 55.2 μg/mL、山柰酚 25.2 μg/mL 的对照品储备液。
2.4 供试品溶液的制备
精密称取珍珠菜提取物样品 25.0 mg，置 25 mL
量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，过 0.45 μm 膜，
即得供试品溶液。
2.5 线性关系考察
分别精密量取芦丁、异鼠李素-3-O-芸香糖苷、
江户樱花苷和山柰酚对照品储备液各 15.0、12.0、
9.0、6.0、3.0 mL 及槲皮素对照品储备液 10.0、8.0、
6.0、4.0、2.0 mL，分别置 100 mL 量瓶中，甲醇稀
释并定容至刻度，摇匀，配制成一系列质量浓度的
混合对照品溶液，精密吸取各混合对照品溶液 20
μL，分别注入液相色谱仪，测定，以进样量为横坐
标，峰面积为纵坐标进行线性回归，得回归方程（表
1），各对照品与峰面积线性关系良好。
1
3
2 4 5 1
2
3
4 5
1
2
3
4
5
1 2
3
4 5
A B C D
0 10 20 30 0 10 20 30 0 10 20 30 0 10 20 30
t / min
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2.6 检测限
取上述对照品储备液，定量稀释成不同质量浓
度对照品溶液后，直接进样，直到某一进样量出峰
峰高为仪器噪音的 3 倍时，即为该对照品的检测限，
结果见表 1。
2.7 精密度试验
精确吸取上述 5 种混合对照品溶液 20 μL，重
复进样 6 次，计算峰面积的 RSD，即为日内精密度；
连续检测 3 d，每天检测 2 次，计算峰面积的 RSD，
即为日间精密度，结果见表 1。
2.8 稳定性试验
精确称取提取物样品，制备供试品溶液，每隔
4 h 进样测定，共进样 6 次，计算峰面积的 RSD，
结果见表 1，表明供试品溶液在 24 h 内稳定。
2.9 重现性试验
精确称取提取物样品 5 份，分别制备供试品溶
液，各精密吸取 20 μL 进样测定，计算各成分质量
分数的 RSD，结果见表 1。
表 1 线性关系考察及精密度、重现性和稳定性试验结果
Table 1 Results of linear relation and test of precision, repeatability, and stability
成 分 回归方程 r 线性范围/ng
检测限/
ng
日内精密度
RSD/%
日间精密度
RSD/%
稳定性
RSD/%
重现性
RSD/%
芦丁 Y＝14 958 X＋179.22 0.999 3 228.60～1 143.00 3.81 0.74 1.64 0.44 1.74
异鼠李素-3-O-芸香糖苷 Y＝12 126 X＋3.14 0.999 4 99.60～498.00 3.32 0.26 0.98 1.19 2.80
江户樱花苷 Y＝23 821 X＋76.81 0.999 4 232.20～1 161.00 5.36 0.23 1.34 1.60 1.78
山柰酚 Y＝39 078 X＋1.81 0.999 1 22.08～110.40 2.21 0.90 1.76 1.69 2.22
槲皮素 Y＝35 761 X－20.30 0.999 5 15.12～75.60 1.98 0.83 1.58 1.75 2.15
2.10 回收率试验
精密称取9份批号为200801的珍珠菜提取物样
品，每份约 4.0 mg，分别置 5.0 mL 量瓶中，平均分
成 3 组，按照样品中每种待测成分量的 80%、100%、
120%定量加入 5 种对照品，甲醇定容，分别取 20 μL
进样分析，外标法计算各成分平均回收率。结果芦
丁、异鼠李素-3-O-芸香糖苷、江户樱花苷、槲皮素、
山柰酚的平均回收率分别为 97.8%、98.9%、102.4%、
98.4%、92.2%，RSD 分别为 2.70%、1.71%、1.16%、
0.50%、3.81%。
2.11 样品测定
取 3 个批次的珍珠菜提取物样品，制备供试品
溶液，分别进样 20 μL，测定，外标法计算，结果
见表 2。
表 2 珍珠菜提取物各组分测定结果 (n＝3)
Table 2 Determination of five flavonoids in L. clethroides
extract (n = 3)
质量分数/(mg·g−1)
批号 芦丁 异鼠李素-3-
O-芸香糖苷
江户樱
花苷
山柰酚 槲皮素
200801 25.91 10.48 23.16 2.03 1.34
200802 24.16 9.89 21.68 2.14 1.06
200803 26.48 11.01 24.34 1.96 1.41
3 讨论
3.1 提取物中化学成分的分离纯化与结构鉴定
取珍珠菜提取物粉末，先利用中压液相色谱、
常压硅胶色谱柱，以不同比例氯仿-甲醇为洗脱溶剂
进行分离，得各组分，然后用 Sephadex-LH 20 除色
素，高效液相检测质量分数，并采用 UV、1H-NMR、
13C-NMR 等多种现代波谱手段及与文献对照，共鉴
定出 14 个化合物，均为黄酮类成分。后经抗肿瘤活
性筛选，并结合各成分在提取物中量的多少，选择
其中量较高的具有一定抗肿瘤活性的 5 种化合物，
即芦丁、异鼠李素-3-O-芸香糖苷、江户樱花苷、山
柰酚、槲皮素进行了定量测定方法研究。
3.2 色谱条件的优化
由于黄酮类和二氢黄酮类化合物紫外吸收峰差
别较大，故建立了双波长同时测定的方法，在 283
nm 下测定二氢黄酮类成分（江户樱花苷），在 370
nm 下测定黄酮类成分（芦丁、异鼠李素-3-O-芸香
糖苷、槲皮素、山柰酚）。
为了得到快速高效的 HPLC 条件，分别对流动
相、体积流量和柱温进行了优化。由于样品中既含
有黄酮类苷元，又含有黄酮苷，等度洗脱保留时间
相差较大，因此采用了梯度洗脱的方式。黄酮类为
酚酸类化合物，容易造成拖尾峰，在流动相中加入
0.1%磷酸，有效消除了峰的拖尾现象。较高的体积
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 7 期 2011 年 7 月 ·1320·
流量影响各峰的分离度，体积流量较慢又造成保留
时间延长，峰形展宽，综合考虑确定体积流量为 1.0
mL/min。柱温对一些峰的分离度有一定影响，在柱
温为 35 ℃时各峰得到了满意的分离，故以 35 ℃为
分析柱温。
3.3 测定结果
实验结果表明不同批次珍珠菜提取物样品间所
测化学成分的量相差不大。黄酮类化合物既是珍珠
菜提取物中的主要成分，又是主要的抗肿瘤活性成
分，通过测定发现芦丁、江户樱花苷等黄酮苷的量
较高，而槲皮素、山柰酚等苷元的量较低，故可用
芦丁、江户樱花苷为指标来控制提取物中黄酮类和
二氢黄酮类的量。本方法操作简便快捷，结果准确
可靠，重复性好，灵敏度高，可用于珍珠菜提取物
中黄酮类化合物的质量控制。
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