全 文 ：4　讨论
4.1　用 LC/MSn方法分析鉴定咖啡酸在大鼠体内
代谢产物 ,并推测其代谢规律已有文献报道[ 6 , 7 , 10] ,
但根据 LC/MSn质谱数据只能推测代谢产物的结
构 ,一般要通过与化学合成或生物转化等方法得到
的纯物质进行色谱及质谱特征对照确定其结构 ,或
者通过化学分离手段获得代谢产物 ,并通过光谱学
方法确证其结构 。本研究从尿样中分离并通过
NMR 法确证了两个葡萄糖醛酸结合物的结构 ,与
文献推测的结果是一致的[ 6 , 7] 。
4.2　实验过程中发现代谢物 Ⅰ ～ Ⅳ室温放置容易
变化 ,须放至冰箱中冷冻保存 ,否则降解为原形药咖
啡酸。
4.3　进行大孔树脂处理时 ,尿样调节 pH 3 不会对
尿样中代谢产物产生影响。
4.4　代谢物 Ⅰ和 Ⅱ为国内首次分离得到的化合物 ,
国外作者[ 11] 以咖啡酸甲酯为底物合成了这两个代
谢物。
参考文献:
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1214.
土槿乙酸联合 9-顺式维甲酸促进白血病细胞凋亡的机制研究
郭　赟1 ,徐瑞成2① ,何　滔3
(1.武警医学院附属医院 内分泌血液科 ,天津　300162;2.武警医学院 科研部 ,天津　300162;
3.武警医学院附属医院 病理科 ,天津　300162)
摘　要:目的　观察过氧化物酶体激活物活化受体γ(PPARγ)的配体土槿乙酸 (PLAB)联合维甲类 X 受体α
(RXRα)的配体 9-顺式维甲酸(9-cis RA)促进白血病细胞凋亡的作用 , 探讨其作用机制。方法　应用透射电子显
微镜 、琼脂糖凝胶电泳分析 H L-60 细胞凋亡 , RT-PCR 检测 H L-60 细胞 Cyclin D1 和 CDK4 mRNA 表达。结果
H L-60 细胞经配体联合作用后 ,电镜下可见明显细胞凋亡的形态学变化 , 琼脂糖凝胶电泳出现 DNA Ladde r , Cyc-
lin D1 及 CDK4 mRNA 的表达均降低 ,且联合用药组下降程度明显较单独作用组大(P<0.05)。结论　PLAB 联
合 9-cis RA 抑制 HL-60 细胞生长 ,其机制与凋亡诱导效应相关。
关键词:土槿乙酸;9-顺式维甲酸;白血病;细胞凋亡;Cyclin D1;CDK4
中图分类号:R286.91　　　文献标识码:A　　　文章编号:0253-2670(2010)06-0952-04
　　土槿乙酸 (pseudo laric acid B , PLAB)是从土
槿皮中分离出的主要成分之一 ,是过氧化物酶体激
活物活化受体γ(pe ro xisome pro liferato rs activated
receptor gamma , PPA Rγ)激动剂 ,可介导肿瘤细
胞生长抑制和凋亡[ 1 ～ 3] 。9-顺式维甲酸 (9-cis RA)
是改变多烯侧链结构合成的第 3代维甲酸 ,是维甲
·952· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs　第 41 卷第 6 期 2010年 6月
①收稿日期:2009-10-14　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　基金项目:国家自然科学基金资助项目(30901985)作者简介:郭　赟(1982—),女 ,硕士 ,医师 ,主要从事恶性血液病的防治研究。 E-mail:1982guoyun@163.com＊通讯作者　徐瑞成　E-m ail:xu rc@sohu.com
类 X受体α(retinoid X recepto r alpha , RXRα)的
配体 ,可诱导多种肿瘤细胞分化[ 4 ～ 8] 。本实验在前
期研究[ 9] 的基础上 ,探讨 PLAB 联合 9-cis RA 促进
白血病 H L-60细胞凋亡及相关的作用机制。
1　材料与方法
1.1　药品与试剂:PLAB (质量分数>98%)为武警
医学院生药教研室陈虹教授提供 ,用无水乙醇溶解
成保存液 ,浓度为 0.01 mol/L , -20 ℃避光保存 ,
实验时用无血清培养基稀释 (乙醇终体积分数控制
在<0.1 %);9-cis RA 、琼脂糖 、溴化乙锭 (EB)、
Proteinase K 、RNaseA 、DEPC 水为 Sigma 公司产
品;RPM I 1640 培养基为 Gibco 公司产品;Trizo l
为美国 Promega 公司产品。引物由大连宝生物公
司合成 ,RT-PCR试剂盒为大连宝生物公司产品。
1.2　细胞培养:H L-60 细胞系购自中国医学科学
院血液学研究所 ,自行传代培养 ,常规培养于 RPM I
1640 培养基 ,补充 10%胎牛血清 ,置于 37 ℃、5%
CO 2混合气体的孵箱中培养 ,取对数生长期细胞进
行实验 。
1.3　透射电子显微镜观察细胞超微结构的变化:将
H L-60细胞常规传代 、分为实验组及对照组 。0.1
μmo l/ L PLAB 联合 10 μmo l/L 9-cis RA 作用 96 h
后(实验组)常规收集细胞 2 ×106个 , 1 000×g 离
心 10 min , 弃上清 , 立即小心地加入 PBS 配制的
2.5%戊二醛 1 mL 固定细胞团 ,用滴管轻吹 ,使细
胞团浮起 ,前固定 30 min 后 , 1%锇酸后固定 2 h ,
乙醇逐级脱水 ,环氧树脂包埋 ,超薄切片 ,铀铅染色。
在透射电镜下观察并摄影记录。对照组细胞不加药
物处理 ,其余操作同实验组 。
1.4　PLA B 联合 9-cis RA 对 HL-60 细胞染色体
DNA 断裂的影响:取对数生长期细胞 ,按上述方法
传代分组。药物作用 96 h 后分别收集 2 ×106个细
胞 ,将待测细胞用 PBS 洗一次后移入 1.5 mL 离心
管中 ,再用 PBS 洗涤一次 ,离心去除上清。向细胞
沉淀中加入细胞裂解液 50 μL 悬浮细胞 ,混匀后于
37 ℃水浴保温 24 h ,细胞充分裂解。在台式高速
离心机中 ,以室温 12 000 ×g 离心 10 min ,去除细
胞碎片 ,吸上清至另一离心管中 。在上清中加 1/10
体积的醋酸钠 ,混匀 ,加入 2.5 倍体积的冷无水乙
醇 ,混匀 , -20 ℃ 沉淀 DNA 4 h 以上。 4 ℃
12 000×g 离心 10 min ,收集沉淀。TE 缓冲液 20
μL 悬浮 DNA ,加 RNase A 5 μL (终质量浓度 0.6
mg/mL),37 ℃水浴保温 1 h ,灭活 RNA 。吸取溶解
的 DNA 溶液 40 μL ,加入样品缓冲液 5 μL ,混匀 ,加
入 2%琼脂糖凝胶样品孔中 ,室温恒流 75 mA ,于
0.5×TBE 电泳缓冲液中电泳 ,50 V 电泳 4 h ,紫外灯
下观察并于凝胶自动成像系统摄影记录实验结果 。
1.5　RT-PCR检测 Cyclin D1和 CDK4 mRNA 表
达:RNA 提取和逆转录 ,用 Trizol 法提取细胞总
RNA 。以 1×104/mL 接种于培养瓶中 ,设溶剂对
照组和给药组 (终浓度分别为 9-cis RA 10 μmol/
L , PLAB 0.1 μmol/ L ,9-cis-RA 10 μmol/ L+PLAB
0.1 μmo l/L),于加药 96 h 后分别收集细胞 ,根据
RNA 在 260 nm 和 280 nm 的吸光度比值(≥2.0)
鉴定 RNA 纯度和完整性。取 1 μg 总 RNA 为模
板逆转录为 cDNA 。
应用 Omiga 2.0设计 Cyclin D1 、CDK4 和 GAD-
PH 引物序列。CDK4 5′-CATGTAGACCAGGAC-
CTAAGG -3′, 5′-AACTGGCGCATCAGATCCTAG -
3′,片段长度 206 bp;Cyclin D1 5′-CTGTCGCTG-
GAGCCCGTGAAAAAG-3′, 5′-GAAGTTG TTGGG-
GCTCCTCAGGTT-3′,片段长度 405 bp;GAPDH 5′-
CT TTGGTATCGTGGAA -GGAC-3′, 5′-GAAATGA-
GCTTGACAAAGTG-3′,片段长度 434 bp。按 RT-
PCR 试剂盒操作说明 ,设循环条件:预变性 94 ℃、5
min ,变性 94 ℃、1 min ,退火 55 ℃、1 min , 延伸
72 ℃、1 min ,35个循环后 72 ℃延伸 10 min。PCR
产物经 2 %琼脂糖凝胶电泳 ,结果用凝胶自动成像
2000系统扫描 ,并以内参对照 GAPDH 校正进行相
对量分析 ,以 3次实验结果的均值进行统计学分析 。
1.6　统计学处理:实验数据以 x ±s 表示 ,两组间
的比较用 t 检验 ,用 SPSS 11.0 统计软件进行统计
学分析处理。
2　结果
2.1　透射电子显微镜观察细胞超微结构的变化:对
照组 HL-60 细胞细胞核大 ,呈异型核 ,多位于细胞
一侧 。核/质比大 ,核基质电子密度均匀一致 ,线粒
体多分布于核周区 ,高尔基体和溶酶体较少 ,内质网
不甚发达 , 核糖体遍布整个胞浆。 0.1 μmol/ L
PLAB 联合 10 μmo l/L 9-cis RA 组胞浆电子密度
增高 ,基质密度增加 ,细胞体积缩小 ,胞膜完整 ,细胞
浆浓缩 ,核固缩 ,染色质致密聚集于细胞核核膜 ,呈
境界分明的环形或新月形小体 。见图 1。
2.2　PLAB 联合 9-cis RA 对 LH-60 细胞染色体
DNA 断裂的影响:0.1 μmo l/L PLAB 联合 10
μmol/L 9-cis RA 作用 96 h , HL-60 细胞 DNA 广
泛断裂 ,形成大小不一的 DNA 片段 ,甚至单聚或寡
聚核小体 ,从而在琼脂糖凝胶电泳上呈现规则的 、间
·953·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs　第 41 卷第 6 期 2010年 6月
隔 180 ～ 200 bp 的阶梯状条带(DNA Ladder)。而
对照组只可见基因组 DNA 。见图 2 。
图 1　透射电子显微镜观察 PLAB联合 9-cis RA 作用
96 h HL-60 细胞超微结构的变化
Fig.1　Microstructure changes of HL-60 cells treated 　
by combining PLAB and 9-cis RA for 96 h
by transmission electron microscopy detection
图 2　PLAB联合 9-cis RA 对 HL-60 细胞染色体
DNA 断裂的影响
Fig.2　Confirmation of DNA fragmentation in HL-60 cells
treated by combining PLAB and 9-cis RA
2.3　PLA B 和 9-cis RA 对 HL-60 细胞 Cyclin D1
和 CDK4 mRNA 表达的影响:HL-60 细胞有 Cyc-
lin D1 及 CDK4 mRNA 表达 ,药物作用 96 h后 ,其
表达强度下调 ,联合用药组与对照组 、单独使用 9-
cis RA 组 、单独使用 PLAB 组比较 , Cyclin D1 及
CDK4 在 mRNA 水平表达差异有统计学意义(P<
0.05),见图 3。
3　讨论
　　本研究结合多种细胞检测方法 ,均证明 PLAB
联合 9-cis RA 可促进 HL-60 细胞凋亡 ,且联合用
药作用远大于单独用药 ,这也再次证明本课题组的
前期实验的科学性[ 10 , 11] 。
细胞增殖是通过细胞周期来实现的 ,准确 、有序
地出入各个周期时相成为细胞正常生长 、代谢的关
键;细胞周期的不同时相存在着关键的调控点 ,其中
1-对照组　2-10 μmol· L -1 9-cis RA 组
3-0.1 μm ol· L -1 PLAB 联合 10 μmol· L- 9-cis RA 组
4-0.1 μmol· L -1 PLAB组
1-cont rol group　2-10 μmol· L -1 9-cis RA group
3-0.1 μmol· L-1 PLAB combinated 10 μmol· L -1　9-cis RA group
4-0.1 μmol · L -1 PLAB g rou p
图 3　9-cis RA 和 PLAB对 HL-60 细胞 Cyclin D1
和 CDK4 mRNA 表达的影响
Fig.3　Ef fects of 9-cis RA and PLAB on Cyclin D1
and CDK4 mRNA expression in HL-60 cells
以 G1 ※S 期调控点最为重要 , Cyclin D1 和 CDK4
被认为在细胞 G 1 ※S 期的转换过程中发挥重要作
用。细胞生长和分化的调节与细胞周期中的诸多因
素密切相关 ,随着对细胞周期调控认识的不断深入 ,
出现了“癌症可能是一类细胞周期疾病”的观点[ 12] 。
研究显示 ,对细胞周期调控的核心机制是 CDK s 的
时相性激活 ,它主要依赖于 Cyclins 的细胞周期特
异性或时相性表达 、累积与分解 。这一系统中的调
节基因及蛋白的改变和肿瘤发生 、发展 、治疗及预后
的关系是目前国内外肿瘤研究的热点。本课题组前
期研究发现 ,9-cis RA 可促使胃癌细胞株 MGC80-3
细胞凋亡且细胞周期调控因子 Cyclin D1 和 CDK4
表达明显下降[ 8] 。本研究显示 , HL-60 细胞 Cyclin
D1 和 CKD4有较高水平表达 , PLAB 、9-cis RA 作
用 96 h ,发现 Cyclin D1和 CDK4 表达强度下调 ,其
中联合用药组下调程度大于单独用药组 ,这与本课
题组前期研究中发现联合用药组细胞抑制率远大于
单独用药组[ 9] 的结论相互呼应 。本研究对 PLAB 、
9-cis RA 联合用药抑制 HL-60 生长的作用机制进
行了进一步的研究 ,为今后的实验和临床研究提供
了初步依据。
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黄芪苷Ⅳ通过 PI3K/Akt 信号通路抗 H2O2诱导的
H9c2 细胞氧化损伤
张　琦 ,彭　洋 ,宋君秋 ,吴艳娜 ,刘艳霞①
(天津医科大学基础医学院 药理学教研室 , 天津　300070)
摘　要:目的　研究黄芪苷Ⅳ对 H2O2诱导的 H 9c2 细胞氧化损伤的保护作用及其作用机制。方法　建立 H2O2诱
导的 H 9c2 细胞氧化损伤模型 , MT T 法检测细胞存活率 , DNA 抽提及琼脂糖凝胶电泳 、Hoechst 33258 染色 、
caspase-3 活性检测细胞凋亡 ,Western blotting 检测 t-Akt 和 p-Akt 蛋白的表达。结果　与 H2O 2组比较 , 10、20
mg/ L 的黄芪苷Ⅳ均显著提高细胞存活率 , 降低 ca spase-3 活性 ,减轻细胞凋亡;且均显著上调 p-Akt 蛋白的表达;
PI3K/ Akt 抑制剂 LY294002 部分阻断 10 、20 mg/ L 黄芪苷Ⅳ的保护作用。结论　黄芪苷Ⅳ部分通过 P I3K/ Akt
通路发挥对 H 2O2诱导的 H 9c2 细胞氧化损伤的保护作用。
关键词:黄芪苷Ⅳ;H 2O 2 ;H9c2;细胞凋亡;PI3K/ Akt;LY294002
中图分类号:R285.5　　　文献标识码:A　　　文章编号:0253-2670(2010)06-0955-05
　　氧化应激是机体在遭受各种有害刺激时 ,体内
活性氧(reactive oxygen species , ROS)产生过多 ,
氧化程度超出抗氧化物的清除能力 ,氧化系统和抗
氧化系统失衡而导致组织损伤的过程 。近年来大量
研究表明 ,氧化应激与多种心血管疾病如高血压 、动
脉粥样硬化 、心肌肥大 、心力衰竭等密切相关[ 1] 。黄
芪苷Ⅳ(A stragaloside Ⅳ, AST)是黄芪总苷中的
主要有效成分 ,研究发现 AST 可以有效改善心功
能 ,对心肌受抑制大鼠的心肌收缩及舒张功能都有
改善作用[ 2 ～ 4] ,具有明显的抗氧化损伤作用[ 5] 。有
研究发现黄芪提取物能够促进缺氧/复氧损伤的神
经元细胞磷酸化 Akt 蛋白表达增加[ 6] 。现已证实 ,
PI3K/Akt 信号通路在心肌保护作用中具有重要作
用[ 7] ,活化的 PI3K 可激活下游信号蛋白 A kt ,进而
发挥抗凋亡作用 ,促进 DNA 损伤修复 。本研究以
H 2O2诱导 H9c2 细胞氧化损伤为模型 , 在研究
AST 细胞保护作用的同时探讨其保护作用与
PI3K/Akt 信号通路的关系 。
1　材料
1.1　细胞株:H9c2 细胞 ,购于中国医学科学院基
础医学研究所细胞中心。
1.2　药物与试剂:黄芪苷Ⅳ(AST ,上海医科大学
天然药物化学教研室提供 ,质量分数>98 %);高糖
DMEM (Gibco 公司);胎牛血清 (Hyclone 公司);
30% H2O 2 、DMSO (分析纯);MT T (Amresco 公
司);PI3K/A kt 抑制剂 LY294002 (Sigma 公司);
考马斯亮蓝蛋白质定量试剂盒 (南京建成生物工程
研究所);DNA Ladder 抽提试剂盒 (碧云天生物技
·955·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs　第 41 卷第 6 期 2010年 6月
①收稿日期:2009-11-23　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　作者简介:张　琦(1985—),女 ,天津人 ,硕士生 ,研究方向:心血管药理学及分子药理学。
Tel:(022)23542523　E-mai l:zhangqi8501@126.com＊通讯作者　刘艳霞　Tel:(022)23542523　E-mail:liu yanxia@yahoo.com