全 文 ：表 5　对四氧嘧啶所致小鼠血糖升高的影响 ( x± s)
组　别 剂　量
( g生药 /kg)
动物数
(只 )
血糖浓度
( mmol /L)
对照 - 10 9. 31± 1. 39* *
模型 - 10 36. 67± 4. 65
黄精须根 20 10 32. 17± 5. 41
10 10 31. 48± 4. 64*
黄精 20 10 32. 54± 4. 39
　　与模型组比较: * P < 0. 05　* * P < 0. 01
动物 sc生理盐水外 ,其余各组动物 sc 5 mg /kg Iso
(以增加心肌耗氧 ) , 15 min后各组动物分别放置于
200 m L的密闭广口瓶中 (瓶底铺放 5 g钠石灰以吸
收水分和二氧化碳 ) ,观察小鼠呼吸停止的时间。结
果见表 6。
表 6　对小鼠常压缺氧能力的影响 ( x± s)
组　别 剂　量
( g生药 /kg)
动物数
(只 )
生存时间
( min)
模型 - 10 15. 33± 2. 44
黄精须根 20 10 18. 28± 3. 11*
10 10 18. 58± 1. 30*
黄精 20 10 17. 69± 2. 74*
　　与模型组比较: * P < 0. 05
2. 4　对离体心肌冠脉流量的影响: 选用 180～ 220
g的 Wista r大鼠 32只 ,雌雄各半 ,随机分成 4组 ,
分别为正常组、黄精须根药物大、小剂量组以及黄精
阳性对照组。受试药物以水提醇沉的方法去杂质 ,测
定提取液的 pH值为 7. 0～ 7. 5。击昏动物 ,颈动脉
放血 ,开胸 ,暴露心脏 ,剪开心包 ,取出心脏 ,置于冷
的洛氏液中 ,轻轻挤出心内的余血。迅速将插管插入
主动脉 ,结扎固定 ,打开灌流液的弹簧夹 ,使充氧、恒
温的洛氏液由冠状动脉经心肌流入右心房 ,从腔静
脉、肺动脉的断端流出。稳定 10 min后 ,收集 5 min
的冠脉流量 ,之后各组动物分别于灌流侧管内注入
生理盐水或药物 ,再次收集 5 min的冠脉流量 ,比较
给药前后冠脉流量的变化 ,计算冠脉流量增长率 ,结
果见表 7。
表 7　对大鼠冠脉流量的影响 (x± s )
组　别 剂　量
( g生药 /kg )
动物数
(只 )
冠脉流量增长率
(% )
对照 - 8 2. 06± 2. 88
黄精须根 1. 0 8 23. 22± 15. 32* *
0. 5 8 21. 50± 15. 05* *
黄精 1. 0 8 19. 52± 13. 22* *
　　与对照组比较: * * P < 0. 01
3　讨论
对免疫功能的影响: 黄精根茎及须根与模型组
比较皆有显著差异 ( P < 0. 05)。对糖代谢的影响: 对
肾上腺素所致小鼠血糖升高的影响 ,黄精根茎及须
根与模型组比较皆有显著差异 ( P < 0. 05) ,而对四
氧嘧啶所致小鼠血糖升高的影响 ,须根与模型组比
较有显著差异 ( P < 0. 05) ,根茎与模型组比较差异
不显著。对耐缺氧能力的影响:黄精根茎及须根与模
型组比较 ,皆有显著差异 ( P < 0. 05)。对离体心肌冠
脉流量的影响: 黄精根茎及须根与生理盐水组比较
皆有显著差异 ( P < 0. 01) ,须根对大鼠冠脉流量增
长率略高于根茎。由此可见 ,黄精须根有类同于根茎
的药理作用。
参考文献:
[1 ]　王曙东 ,宋炳生 ,金亚丽 ,等 . 黄精根茎及须根中微量元素及氨
基酸的分析 [ J] .中成药 , 2001, 23( 5): 369-370.
[ 2 ]　王曙东 ,吴晴斋 ,李汉保 . 黄精根茎、须根中营养成分的研究
[ J ]. 时珍国药研究 , 1995, 6( 4): 14-15.
土槿乙酸体外诱导 K562细胞凋亡的研究
张　敏 ,买　霞 ,陈小义 ,陈　莉 ,陈　虹 ,李灵芝
(武警医学院 生物教研室 ,天津　 300162)
摘　要: 目的　研究土槿乙酸体外对人白血病细胞 ( K562)凋亡的诱导作用 ,探讨其抗癌作用机制。方法　以不同
浓度土槿乙酸分别处理 K562细胞 ,用琼脂糖凝胶电泳、荧光显微镜和倒置光显微镜、 M TT 法观察 K562细胞
DN A带型、形态和抑制率的变化。结果　 1× 10- 5 mol /L土槿乙酸作用 30 h能有效诱导 K562细胞凋亡 ,凋亡细胞
有典型的形态学改变及 DNA梯形带形成。 M TT法测定不同浓度土槿乙酸明显抑制 K562细胞系的生长 ,其 IC50
值为 2× 10- 6 mol /L。 结论　土槿乙酸能成功诱导 K562细胞凋亡 ,此种诱导作用呈药物作用浓度及时间依赖性。
关键词: 土槿乙酸 ;人白血病细胞系 ;细胞凋亡 ;生长抑制率
中图分类号: R286. 91　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2002) 06 0533 03
·533·中草药　 Ch inese Tradi tional and Herbal Drugs　 2002年第 33卷第 6期
收稿日期: 2001-09-10
基金项目:天津市自然科学基金资助项目 ( No. 003805211)
作者简介:张　敏 ( 1969-) ,女 ,江苏启东人 , 1991年毕业于天津师范大学 ,理学学士学位 ,现任武警医学院生物教研室讲师 ,主要从事抗
癌药物作用机制的研究。 　 Tel: 022-60578063
Studies of apoptosis on K562 cell line induced by pseudolaric acid B in vitro
ZHANG Min, M AI Xia, CHEN Xiao-yi , CHEN Li , CHEN Hong , LI Ling-zhi
( Depar tment of Bio lo gy , Medical Colleg e of Chinese People s A rmed Po lice For ces, Tianjin 300162, China)
Key words: pseudo laric acid B; human leukemic K562 cell line; cell apoptosis; g row th inhibi to ry rate
　　土槿乙酸是从松科植物金钱松 Pseudolarix
amabilis ( Nelson) Rehd. 的树皮 (土槿皮 )中分离
出的一种主要成分 ,为 类化合物 ,是五元与七元合
并的芳环骨架 ,天然产物中许多具有此类结构的化
合物具有显著的抗肿瘤作用 [1 ]。在民间 ,土槿皮曾是
用于治疗肝癌的一种生药 [2 ]。 1988年马瑾瑜等人报
道 [4, 5 ]土槿乙酸苷具有抑制肝癌细胞的作用 [ 3～ 5] ,但
目前国内外尚未见土槿乙酸抗癌作用的报道。 本文
以人白血病细胞系 K562细胞为靶细胞研究土槿乙
酸对 K562细胞凋亡诱导作用 ,为探讨土槿乙酸的
抗癌作用提供实验依据。
1　材料
土槿乙酸 ( pH约为 5. 4,经中国药品生物制品
检定所检测纯度> 98% )由武警医学院药学教研室
提供 ,经二甲基亚砜 ( DM SO) 溶解 ,无血清培养基
稀释 ( DM SO终浓度 ≤ 0. 1% ) ,过滤除菌。 培养基
RPM I 1640均为 GIBCO公司产品 , Hoechst33342、
碘化丙啶 ( PI)、噻唑蓝 ( M T T)和 DMSO为 SIG-
M A公司产品。 胎牛血清为中国医学科学院血液学
研究所生产 ,琼脂糖和溴化乙锭 ( EB) 为 SIGM A
公司产品。
2　方法和结果
2. 1　细胞系培养: K562细胞系由协和医科大学基
础所馈赠 ,我室传代培养 ,常规培养于 RPM I 1640,
补充 10% 热灭活胎牛血清 , 2 mmol /L谷氨酰胺 ,
100 U /mL青霉素 , 100μg /mL链霉素 ,置 5% 体积
CO2孵育箱中培养。取对数生长期细胞用于实验。
2. 2　细胞抑制率测定 ( M TT法 ): K562细胞直接
调整浓度为 4× 104个 /mL接种于 96孔培养板 ,每
孔 200μL,培养 24 h,实验组分别加入 5种不同浓
度土槿乙酸 ,另设对照组 (不加药 )和空白组 (只有
培养基 ) ,每组处理都是 6个复孔 ,培养 72 h,加入
MT T ( 5 mg /mL) 20μL, 4 h后加入 DMSO 200
μL,避光振荡 10 min,用全自动酶标仪测定 570 nm
处吸光度 A值。 细胞抑制率按下列方法计算 [6 ]:
抑制率 (% )= 对照组 A-实验组 A对照组 A-空白组 A× 100%
结果见表 1,可见 1× 10- 6 mo l /L土槿乙酸作
用 72 h的细胞抑制率为 17. 3% ,随着浓度的增加 ,
抑制作用也明显增加 , 1× 10- 4 mol /L土槿乙酸作
用 72 h的细胞抑制率达 92. 4% ,半数抑制浓度
( IC50 )约为 2× 10- 6 mo l /L。说明土槿乙酸对 K562
细胞的生长有显著的抑制作用。
表 1　土槿乙酸对 K562细胞的生长抑制作用
组　别 浓度 ( mol /L) A 570 nm 抑制率 (% )
对照 - 1. 765± 0. 024
空白 - 0. 359± 0. 026
土槿乙酸 1× 10- 4 0. 461± 0. 065* 92. 4
1× 10- 5 0. 621± 0. 065* 81. 4
2× 10- 6 1. 074± 0. 035* 49. 2
1× 10- 6 1. 522± 0. 108 17. 3
1× 10- 7 1. 671± 0. 053 6. 7
　　与对照组比较: * P < 0. 01
2. 3　细胞形态学观察
2. 3. 1　倒置光显微镜下观察细胞形态变化: 对照组
细胞为圆形 ,核大而圆 ,位于细胞中央。 而实验组细
胞 1× 10- 5 mo l /L以下浓度组体积变小 ,细胞密度
下降 ,药物连续处理 48 h,可见许多膜包小体形成 ;
1× 10- 5 mol /L及以上浓度组 ,细胞变成蝌蚪形、哑
铃形等不规则形状 ,甚至变为长杆状细胞 ,药物连续
处理 30 h,可见许多膜包小体形成。
2. 3. 2　 Hoechst33342 /PI荧光双染法观察细胞形
态学变化: 1× 10- 4 mol /L土槿乙酸处理 28 h,将细
胞制成细胞悬液 ,每组取 200μL,加入荧光染料
Hoechst33342至终浓度 10μg /mL, PI 50μg /mL,
37℃ 染色 15 min后滴片观察。在荧光显微镜 (日
本 Nikon) 下可见对照组细胞核染色质均匀 ,胞浆
被 Hoechst33342染成蓝色荧光 ,经土槿乙酸处理
后 ,核染色质凝集 ,分布不均匀的蓝色凋亡细胞明显
增多 ,约占 70% 以上 ,而被 PI染成红色的坏死细
胞较少。
2. 4　 DN A琼脂糖凝胶电泳检测土槿乙酸诱导细
胞 DN A裂解: 收集 2× 106个细胞 , PBS洗涤 ,按常
规方法提取 DNA[7 ] ,样品溶于 30μL TE中 , 1% 琼
脂糖凝胶 (含 0. 5μg /mL溴化乙锭 ) , 50 V,电泳 4
h,紫外灯下拍照 ,凋亡细胞典型的生化改变之一是
核酸分子被核酸内切酶在核小体之间切成 180 bp
左右及其倍数的 DNA片段的 “ DNA ladder”。实验
结果可见: 土槿乙酸处理 K562细胞 30 h,在 1×
·534· 中草药　 Ch inese Tradi tional and Herbal Drugs　 2002年第 33卷第 6期
10
- 4和 1× 10- 5 mo l /L浓度下 ,电泳呈清晰的梯状
带 ;处理 48 h,在 1× 10- 5和 1× 10- 6 mol /L浓度
下 ,电泳出现清晰的梯状带 ,而 1× 10- 4 mo l /L浓度
下则显示出细胞坏死时表现的模糊的膜状带。
2. 5　统计学处理:样品均数的比较采用 t检验。
3　讨论
研究表明许多抗癌药物能够诱导肿瘤细胞发生
凋亡 ,且其疗效与诱导细胞凋亡的反应能力有关。本
实验表明 ,土槿乙酸能有效抑制 K562细胞系的增
殖 ,其抑制程度随土槿乙酸作用时间的延长和作用
浓度的增大而增强。在研究中作者发现 ,土槿乙酸在
抑制细胞系生长的同时 ,这些细胞表现出明显的形
态变化 , K562细胞 1× 10- 5 mol /L及以上浓度组 ,
细胞变形明显 ,成为蝌蚪、哑铃等形状 , 1× 10- 5
mol /L以下浓度组 ,细胞体积变小 ,并有膜包的圆
形小体出现。 这些形态变化随用药时间的延长而愈
加明显。据马瑾瑜等人报道 ,土槿皮及其提取物土槿
乙酸苷均对人体肝癌细胞 ( SMMC-7721)的增殖有
明显的抑制作用 ,并可引起细胞形态的变化 [2, 3] ,故
可推断土槿乙酸为其抑制作用的有效成分。
为进一步探讨土槿乙酸抑制细胞增殖的作用机
制 ,采用了荧光双染法观察 K562细胞内 DNA的
含量及对细胞核形态学的影响。在荧光显微镜下 ,可
见核染色质凝集和凋亡小体形成。 琼脂糖凝胶电泳
得到典型的梯状带 ,由此证实土槿乙酸能成功诱导
K562细胞凋亡 ,有力说明了土槿乙酸的有效抗癌
作用 ,也为该药用于临床治疗肿瘤提供了一定的实
验依据。 但不同浓度土槿乙酸作用于不同肿瘤细胞
株的凋亡效应以及其凋亡过程中抑癌基因的表达有
何改变有待进一步研究。
参考文献:
[ 1]　李珠莲 ,潘德济 ,胡蛙奇 ,等 . 土槿皮新二萜成分的研究 I. 土
槿甲酸和土槿乙酸的化学结构测定 [ J ] . 化学学报 , 1982, 40
( 5): 453-457.
[2 ]　竺叶青 ,马瑾瑜 ,陈明华 ,等 . 八种生药体外抗肝癌作用的实验
研究 [ J] .上海医科大学学报 , 1989, 16( 3): 240.
[3 ]　马瑾瑜 ,余竹元 ,竺叶青 ,等 . 土槿乙酸苷对培养人体肝癌细胞
的作用 [ J] .上海医科大学学报 , 1988, 15( 3): 208.
[ 4 ]　 Li E, Clark A M, Huf ford C D. Anti fu ngal evaluation of
ps eudolaric acid B, a major cons ti tuent of Pseudolarix
kaempferi [ J] . J Nat Prod, 1995, 58( 1): 57-67.
[5 ]　王伟成 ,顾芝萍 ,顾克仁 ,等 . 土荆皮乙酸对妊娠大鼠子宫内膜
及肌层血流量的影响 [ J] . 中国药理学报 , 1991, 12 ( 5): 423-
425.
[ 6 ]　张　敏 ,买　霞 ,陈小义 ,等 . PB230体外抗肿瘤活性的研究
[ J] .武警医学院学报 , 2000, 9( 4): 243-244.
[ 7]　买　霞 ,张　敏 ,陈小义 ,等 . PB231诱导 K562细胞凋亡的初
步研究 [ J ]. 武警医学 , 2001, 12( 1): 12-15.
络泰治疗激素性股骨头坏死的实验研究
李峻辉 ,宁亚功 ,彭仲杰 ,栾晓文 ,刘国光 ,王云华 ,吴亚玲 ,叶建红
(成都军区昆明总医院 中医科 ,云南 昆明　 650032)
摘　要: 目的　评价络泰对激素性股骨头坏死的治疗作用。方法　将 30只兔随机分为空白对照组、模型组、治疗
组 ,于实验后 8, 16周分别进行血液流变学、血脂测定 , 16周处死动物行组织形态学观察。 结果　治疗组动物血浆
和全血粘度、红细胞聚集指数、总胆固醇、甘油三酯均明显低于模型组 (P < 0. 05) ,股骨头空骨陷窝数虽没有达到
正常水平 ,但较模型组有明显改善 (P < 0. 05)。结论　 iv经股动脉穿刺介入给予大剂量络泰治疗股骨头坏死 ,可以
降低血脂 ,改善血液循环 ,改善股骨头的供血情况 ,从而促进坏死骨修复和新生骨再生。
关键词: 股骨头坏死 ;络泰 ;血液流变学 ;血脂 ;病理学
中图分类号: R285. 5　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2002) 06 0535 03
Experimental study on hormonal femoral head necrosis by LUOTAI INJECTION
*
LI Jun-hui , N IN G Ya-gong , PENG Zhong-jie, LU AN Xiao-w en, LIU Guo-guang ,
W ANG Yun-hua, WU Ya-ling , YE Jian-hong
( Depa rtment o f TCM , Kunming Genera l Hospita l o f Chengdu M ilita ry Region, Kunming Yunnan 650032, China )
Key words: femo ral head necrosis; LUO TAI IN JECTION; blood rheolo gy; serum lipid; patho logy
*
LUOT AI IN JECTION is made from to tal saponin of Panax pseudo-ginseng va r. notoginseng
·535·中草药　 Ch inese Tradi tional and Herbal Drugs　 2002年第 33卷第 6期
收稿日期: 2001-01-09
作者简介:李峻辉 ( 1972-) ,男 ,成都军区昆明总医院全军中医内科专科中心主治医师 ,主要从事骨关节疾病及股骨头坏死的临床和科研
工作。 Tel: ( 0871) 4074639