全 文 ：书收稿日期:2016 － 03 － 03
基金项目:沈阳市科技局计划项目(F13 － 316 － 1 － 63);辽宁省教育厅一般项目(L2015201)
作者简介:王秋雨(1961 －)，男，汉族，辽宁沈阳人，博士，教授，从事细胞分子生物学研究．
* 通讯作者:王丹(1981 －)，女，汉族，辽宁沈阳人，博士，实验师，从事分子药理学研究，E-mail:wangdan@ lnu. edu. cn．
辽宁大学学报
自然科学版
第 43 卷 第 3 期 2016 年
JOUＲNAL OF LIAONING UNIVEＲSITY
Natural Sciences Edition
Vol． 43 No． 3 2016
土槿皮提取物抗菌及抗肿瘤活性的初步研究
王秋雨1，田艳秋1，刘洋成2，骆芙瑶2，赵明义3，王 丹2*
(1. 辽宁大学 生命科学院，辽宁 沈阳 110036;2. 辽宁大学 药学院，辽宁 沈阳 110036;
3. 辽宁省沈阳市儿童医院 输血科，辽宁 沈阳 110032 )
摘 要:选取土槿皮中活性成分土槿甲酸和土槿乙酸为研究对象，采用牛津杯法检测其对革兰氏阳性细菌金
黄色葡萄球菌和革兰氏阴性细菌大肠杆菌的抗菌活性，并采用 MTT 法检测土槿甲酸和土槿乙酸对人胃癌
BGC － 823 细胞及人肝癌 HepG － 2 细胞的抗肿瘤活性．结果:土槿甲酸和土槿乙酸对人胃癌 BGC － 823 细胞
及人肝癌 HepG － 2 细胞均有显著的体外抑制增殖作用．其中土槿甲酸对革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌有
显著的抑菌活性，对大肠杆菌无抑制作用．土槿乙酸对两种细菌均无抑制作用．
关键词:土槿甲酸;土槿乙酸;抗菌活性;抗肿瘤活性
中图分类号:Ｒ 966 文献标志码:A 文章编号:1000-5846(2016)03-0258-04
The Study of Cytotoxicity and Bacteriostasis of the
Extract of Pseudolaricis
WANG Qiu-yu1，TIAN Yan-qiu1，LIU Yang-cheng2，LUO Fu-yao2，ZHAO Ming-yi3，WANG Dan2*
(1． College of Life Science，Liaoning University，Shenyang 110036，China;
2． College of Pharmaceutical Science，Liaoning University，Shenyang 110036，China;
3． Department of blood transfusion，Liaoning Childrens Hospital，Shenyang 110032，China)
Abstract: Aim:Biological activities of Pseudolaric acid A(PAA)and Pseudolaric acid B(PAB)
were studied． Methods:Oxford cup method was used to evaluate the anti-bacteria acitivity of gram
positive bacteria Staphylococcus aureus and gram negative bacteria Escherichia coli． MTT assay was
used to evaluate the anti-tumor activity of BGC-823 and HepG-2． Ｒesults:PAA and PAB both had
obvious inhibitory effects to BGC-823 and HepG-2 tumor cells． PAA only had inhibitory effect to gram
positive bacteria Staphylococcus aureus，but not to gram negative bacteria Escherichia coli． While PAB
had no inhibitory effect to both Staphylococcus aureus and Escherichia coli．
Key words: pseudolaric acid A;pseudolaric acid B;anti-bacteria acitivity;anti-tumor activity
DOI:10.16197/j.cnki.lnunse.2016.03.013
0 引言
土槿皮，又名土荆皮．来源于松科植物金钱松的根皮和近根树皮．最早见于清代赵学敏所著《本
草纲目拾遗》，性辛、温、有毒、止痒杀虫，用于治疗癣症［1］．临床外用药物土槿皮酊，主要成分为土槿
皮浸提物，用于治疗真菌引起的藓症［2］． 1960 年研究者从土槿皮中分离出土槿酸，并证明其有抑制
我国常见致病真菌作用．经进一步研究，土槿酸并非单体，经硅胶层析进一步分离得土槿甲酸和土槿
乙酸［3］．为全面了解土槿皮提取物的活性，本文分别选取革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和革兰氏阴
性菌大肠杆菌研究土槿甲酸和土槿乙酸的抗菌活性，同时选取人胃癌 BGC － 823 细胞和人肝癌
HepG －2 细胞研究土槿甲酸和土槿乙酸对肿瘤细胞体外增殖的影响．
1 实验材料
土槿甲酸和土槿乙酸均购自中国标准物质检定所．
Escherichia coli 和 Staphylococcus aureus :辽宁大学生命科学院微生物实验室保存．
人胃癌 BGC －823 细胞和人肝癌 HepG －2 细胞:辽宁大学药学院分子药理学实验室保存．
2 实验方法
2. 1 细菌培养
选取革兰氏阳性菌株金黄色葡萄球菌及革兰氏阴性菌株大肠杆菌为实验菌株．分别将两种菌株
复苏培养至生长状态良好，接种至 LB 液体培养基后于 37 ℃摇床过夜培养，调整菌株状态至对数生
长期．
2. 2 牛津杯法检测土槿甲酸和土槿乙酸的抗菌活性
取对数生长期金黄色葡萄球菌和大肠杆菌菌液各 100 μL(1 × 105 个 CFU /mL)，分别取菌液
100 μL 涂平板，采用牛津杯法［4］检测不同浓度土槿甲酸和土槿乙酸(5、2. 5、1. 25 mg /mL)的抗菌活
性，于 37 ℃恒温培养箱过夜培养，观察抑菌结果．
2. 3 细胞培养
取 － 80 ℃冻存的人胃癌 BGC －823 和人肝癌 HepG －2 细胞于 25 cm2 细胞培养瓶中复苏培养，
待细胞长至 80% ～90%满后，传代培养．
2. 4 MTT法检测土槿甲酸和土槿乙酸的抗肿瘤活性
采用 MTT 方法［5］检测土槿甲酸和土槿乙酸对人肿瘤细胞的抗肿瘤活性．取生长状态良好、处于
对数生长期的人胃癌 BGC －823 和人肝癌 HepG －2 细胞各一瓶，弃去培养基，用 PBS 洗去多余的培
养基，加 0. 25%胰酶消化，于倒置显微镜下观察细胞变圆后，终止消化．加 3 mL ＲPMI － 1640 培养液
吹打成单细胞悬液．血球计数板计数后，以每孔 200 μL(1 × 104 cells /well)接种于 96 孔培养板．培养
24 h后，弃上清，加入不同浓度土槿甲酸、土槿乙酸(20、10、5、1 μM)．每组设置3个复孔，同时设置调零
孔(只加入 ＲPMI －1640培养液、MTT 和 DMSO)． 5%CO2，37 ℃孵育 24 h后，每孔加入 20 μL MTT 溶
液，37 ℃继续培养 4 h后，1 000 g 离心 5 min，弃上清，每孔加入 200 μL DMSO，置摇床上低速避光振荡
15 min，使结晶物充分溶解．酶标仪于 570 nm 波长下检测各孔吸光度值(OD 值)，绘制量效曲线．
细胞抑制率(%)=(1 －加药组平均 OD 值 /对照组平均 OD 值)× 100% ．
952第 3 期 王秋雨，等:土槿皮提取物抗菌及抗肿瘤活性的初步研究
3 实验结果
3. 1 土槿甲酸显著抑制金黄色葡萄球菌生长
实验结果表明(图 1)，不同浓度土槿皮提取物活性成分土槿甲酸(5、2. 5、1. 25 mg /mL)对革兰
氏阴性细菌大肠杆菌无抑菌活性，对革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌有明显的抑菌活性(出现明显
抑菌圈)，且抑菌圈直径与土槿甲酸药物浓度呈正相关．提示土槿甲酸可能对革兰氏阳性细菌金黄色
葡萄球菌的细胞壁有一定的特异性．
图 1 不同浓度土槿甲酸对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性
3. 2 土槿乙酸对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均无抑菌作用
实验结果表明(图 2)，通过牛津杯法检测不同浓度土槿皮提取物活性成分土槿乙酸(5、2. 5、
1. 25 mg /mL)对革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性细菌大肠杆菌抑菌作用，未出现明显
抑菌圈．说明土槿乙酸对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长无明显抑制作用．
图 2 不同浓度土槿乙酸对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性
3. 3 土槿甲酸和土槿乙酸可以显著抑制肿瘤细胞生长
实验结果表明(表 1 ～ 4)，经不同浓度土槿甲酸和土槿乙酸(20、10、5、1 μM)对人胃癌 BGC －
823 及人肝癌 HepG －2 细胞作用 24 h后，两种细胞株的体外增殖均受到显著抑制(图 3)，且抑制率
与药物浓度呈正相关．
062 辽宁大学学报 自然科学版 2016 年
表 1 不同浓度土槿甲酸对人肝癌 HepG －2 细胞抑制率
Groups
HepG － 2
Cell Growth Inhibition(珔X ± SD)
24 h(%)
PAA:0 μMa 100
PAA:1 μMb 65. 71 ± 2. 14
PAA:5 μMc 64. 87 ± 5. 48
PAA:10 μMd 48. 18 ± 2. 29
PAA:20 μMe 36. 32 ± 3. 27
a vsb = 0. 000
P值
a vs c = 0. 000
a vsd = 0. 000
a vs e = 0. 000
表 2 不同浓度土槿甲酸对人胃癌 BGC －823细胞抑制率
Groups
BGC － 823
Cell Growth(珔X ± SD)
24 h(%)
PAA:0 μMa 100
PAA:1 μMb 94. 77 ± 1. 27
PAA:5 μMc 87. 49 ± 1. 29
PAA:10 μMd 33. 37 ± 7. 10
PAA:20 μMe 32. 05 ± 6. 41
a vsb = 0. 173
P值
a vsc = 0. 006
a vsd = 0. 000
a vs e = 0. 000
表 3 不同浓度土槿乙酸对人肝癌 HepG －2 细胞抑制率
Groups
HepG － 2
Cell Growth(珔X ± SD)
24 h(%)
PAB:0 μMa 100
PAB:1 μMb 72. 65 ± 1. 07
PAB:5 μMc 65. 72 ± 1. 61
PAB:10 μMd 63. 61 ± 2. 07
PAB:20 μMe 51. 15 ± 3. 11
a vsb = 0. 000
P值
a vsc = 0. 000
a vsd = 0. 000
a vs e = 0. 000
表 4 不同浓度土槿乙酸对胃癌 BGC －823 细胞抑制率
Groups
BGC － 823
Cell Growth(珔X ± SD)
24 h(%)
PAB:0 μMa 100
PAB:1 μMb 98. 82 ± 0. 72
PAB:5 μMc 77. 43 ± 12. 00
PAB:10 μMd 74. 21 ± 15. 50
PAB:20 μMe 36. 75 ± 4. 32
a vsb P = 0. 129
P值
a vs c P = 0. 029
a vsd P = 0. 017
a vs e P = 0. 003
图 3 土槿甲酸和土槿乙酸对人胃癌 BGC －823 细胞及人肝癌 HepG －2 细胞体外增殖的影响
4 结论
土槿皮中活性成分土槿甲酸和土槿乙酸对人胃癌 BGC － 823 细胞及人肝癌 HepG － 2 细胞均有
显著的体外抑制增殖作用．其中土槿甲酸对革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌有显著的抑菌活性，对
大肠杆菌无抑制作用．土槿乙酸对两种细菌均无抑制作用．全面了解土槿皮提取物中活性成分土槿
甲酸和土槿乙酸的抗菌活性和抗肿瘤活性，有助于进一步研究土槿皮活性成分作用机制，为开发土
槿皮活性成分应用于临床药物提供数据支持和理论依据．
参 考 文 献 :
［1］ 宋永峰，陈虹，李灵芝．土槿皮的研究进展［J］．天津药学，2001，13(6):9 － 12．
［2］ 陶翠祥．复方土槿皮酊的制备及质量控制和临床应用［J］．工艺与制备，2003(1):137．
［3］ 陈科，李珠莲，潘德济，等．土槿皮三萜成分的研究［J］．化学学报，1990，48:519．
［4］ 孙欣，武红梅，陈尔凝，等． 4种天然产物提取物的细胞毒性和抑菌性比较［J］．生命科学仪器，2012，10(6):29 －32．
［5］ Wu W Y，Guo H Z，Qu G Q，et al． Mechanisms of pseudolaric acid B-induced apoptosis in Bel-7402 cell lines［J］．
The American journal of Chinese medicine，2006(34) :887 － 899． (责任编辑 李 超)
162第 3 期 王秋雨，等:土槿皮提取物抗菌及抗肿瘤活性的初步研究