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土槿乙酸对人黑素瘤细胞增殖抑制作用研究
姜孟臣 ,陈　虹 ,张　敏 ,陈　莉
(武警医学院 药学教研室 ,天津　 300162)
摘　要: 目的　研究土槿乙酸 ( PAB)对人黑素瘤细胞 ( LiBr )生长的抑制效应 ,并探讨其作用机制。方法　用不同
浓度的 PAB加入体外培养 LiBr细胞中 ,观察加药后细胞生长数量及其形态的变化 ;用 M TT法检测 PAB的细胞
毒作用 ;用 Hoech est 33342和 PI双荧光染色法检测细胞凋亡。用免疫细胞化学方法 ,观察 Li Br细胞基因表达的变
化。 结果　 PAB明显抑制 LiBr细胞生长 ; IC50值为 2. 5× 10- 5 mo l /L;其抑制率与药物浓度呈剂量依赖关系 ;凋亡
细胞的比例与药物浓度及作用时间呈正相关。免疫细胞化学检测显示 p21W AF1表达增强。 结论　 PAB能有效抑制
LiBr细胞的增殖。
关键词: 土槿乙酸 ; Li Br细胞 ; 细胞增殖
中图分类号: R286. 91　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 06 0532 03
Effect of pseudolaric acid B on proliferation of human LiBr cell line in vitro
JIANG M eng-chen, CHEN Hong, ZHANG Min, CHEN Li
( Depar tment of Pha rmacy , Medical Co lleg e of Chinese People s A rmed Po lice For ces, Tianjin 300162, China)
Abstract: Object　 To study the inhibi to ry ef fects and mechanism of pseudolaric acid B ( PAB) on the
g row th o f LiBr cell line. Methods　 PAB in dif ferent concentrations was added into the medium in which
LiBr cells w ere cultured. The changes of cell mo rpholog y w ere observ ed by phase contrast microscope. Cy-
to toxicity of PAB was detected by M T T. The number of apopto tic cel l w as calculated by double fluo res-
cent staining. The lev el of p21W AF1 pro tein w as measured with immunocy tochemist ry. Results　 The g row th
o f LiBr cell line w as remarkably inhibited by PAB. The IC50 values of PAB for LiBr cells was 2. 5× 10- 5
mol /L. The inhibitory ra te and the apoptotic cell rate w ere related wi th the medicine concentration. The
level of p21WAF1 pro tein in LiBr cells treated wi th PAB was obviously increased. Conclusion　 PAB can ef-
fectiv ely inhibi t the pro li feration of LiBr cell line.
Key words: pseudo la ric acid B ( PAB) ; LiBr cell line; cell proli feration
·532· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 6期 2003年 6月
收稿日期: 2002-10-14基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 30171108) ; 天津市自然科学基金重点课题 ( 003805211)作者简介:姜孟臣 ( 1962— ) ,男 ,内蒙古赤峰市人 ,学士 ,毕业于内蒙古医学院 ,硕士学位在读 ,现在武警医学院药学教研室工作 ,研究方向:抗肿瘤药物作用机制研究。
　　土槿乙酸 ( pseudo la ric acid B, PAB)是松科植
物金钱松树皮 (土槿皮 ) 中提取的有效成分。 近年
来研究发现 PAB 具有较强的抗肿瘤作用 ,对
K562, M CF-7, MGC-803, HT1080等肿瘤细胞株有
抑制作用 [1, 2 ] ,而对人黑素瘤细胞 ( LiBr) 的作用研
究尚未见报道。我们以 LiBr细胞株为靶细胞观察了
不同浓度的 PAB在体外对该细胞增殖的影响及细
胞形态变化 ,并对其抗肿瘤作用机制进行研究。
1　材料与方法
1. 1　材料与仪器: PAB (含量 98% ,武警医学院药
学教研室提供 ) , DMEM 培养基 ( Gibco 公司产
品 ) , M T T、 Hoechst 33342、 PI (碘化丙啶 )、胰蛋白
酶 (均为 Sigma公司产品 ) , LiBr (由天津市肿瘤医
院生化室引进 ) ,胎牛血清 (中国医学科学院血液学
研究所提供 ) ,青霉素、链霉素 (华北制药厂生产 )。
550型全自动酶标仪 (美国 BIO RAD)。
1. 2　方法
1. 2. 1　细胞培养: LiBr细胞株体外培养于 DMEM
培养基中 ,培养基内含 10% 胎牛血清、 2 mmol /L
谷氨酰胺、 100 U /mL青霉素、 100μg /mL链霉素 ,
置 37℃ , 5% CO2孵育箱中进行体外培养。
1. 2. 2　细胞生长曲线的测定: 取对数生长期 LiBr
细胞 ,用 0. 125% 胰酶和 EDT A液消化细胞 ,制成
细胞混悬液 ,计数、调整细胞浓度为 3. 0× 105 /mL,
接种于 25 m L培养瓶内培养 24 h后 ,实验组加入
不同浓度的 PAB ( 5, 10, 50μmol /L) ,对照组加等
量培养基。以后每天随机从 4组细胞中 ,各取出 3
瓶细胞 ,用台盼蓝拒染法 ,在光镜下计活细胞数 ,取
平均值 ,以时间为横坐标 ,活细胞数为纵坐标 ,作图
得细胞生长曲线。
1. 2. 3　细胞形态学观察: 于加药后不同时间 ,在倒
置显微镜下 ,观察细胞形态变化 ,并摄像记录。
1. 2. 4　 PAB对 LiBr的细胞毒作用:按上述方法制
成细胞悬液 ,调整细胞浓度为 4× 104 /m L,接种于
96孔培养板上 ,每孔加 200μL细胞悬液 ,培养 24 h
后 ,加入不同浓度 PAB ( 3. 125× 10- 6～ 1× 10- 4
mol /L) ,倍比梯度稀释 ,另设对照组 (不加 PAB)
和空白对照组 (只加培养基 )。 每组设 8个复孔 ,加
药后 48 h,加 MT T ( 5 mg /mL) 20μL, 4 h后 ,加入
DMSO 200μL避光振荡 10 min,用全自动酶标仪
(波长 490 nm )测定各孔吸光度 ( A )值 ,按文献 [ 3]
方法计算细胞生长抑制率。
1. 2. 5　双荧光染色法检测细胞凋亡:取对数生长期细
胞加入不同浓度的 PAB ( 5× 10- 5 , 1× 10- 5 , 5× 10- 6
mo l /L ) 进行实验 ,于 24, 48, 72 h 取出细胞 ,按文
献 [4 ]方法 ,将细胞消化、离心、洗涤后制成细胞悬液 ,用
Hoechest 33342和 PI进行双荧光染色 ,在荧光显微
镜下观察细胞核形态变化 ,并计数和摄像记录。
1. 2. 6　 PAB对 LiBr细胞 p21W AF1表达的影响: 取
对数生长期的细胞 ,加入不同浓度的 PAB ( 5×
10- 5 , 1× 10- 5 , 5× 10- 6 mol /L) 继续培养 24 h,并
设对照组 ,将细胞消化、离心、洗涤后涂片 ,用丙酮固
定 ,免疫细胞化学染色步骤按博士德公司试剂盒说
明书进行。
1. 2. 7　统计学处理:实验结果用统计软件 SPSS分
析 ,组间进行 t检验。
2　结果
2. 1　 PAB对 LiBr细胞生长的抑制作用:由细胞计
数绘制的生长曲线可见 , LiBr细胞经 3种不同浓度
的 PAB处理后 ,细胞生长受到明显的抑制 ,其中
PAB 50μmo l /L组的抑制作用最强 ,见图 1。
1-对照 2-PAB 5μmol /L 3-PAB 10μmol /L 4-PAB 50μmol /L
1-cont rol 2-PAB 5μmol /L 3-PAB 10μmol /L 4-PAB 50μmol /L
图 1　 PAB对 LiBr细胞生长的抑制作用
Fig. 1　 Inhibitory eff ect of PAB on growen of LiBr cells
2. 2　 PAB对 LiBr细胞形态变化的影响:实验组细
胞在加药后 24 h,在倒置光学显微镜下观察 ,可见
大部分细胞由梭形变为圆形 ,胞体皱缩 ,细胞核边
移 ,核凝集 ,细胞周围出现大小不等的膜被小体 ,尤
以 PAB 50μmol /L组细胞形态变化最明显 ,细胞数
与对照组比较明显减少。
2. 3　 PAB对 LiBr 的细胞毒作用: LiBr细胞经
PAB处理 48 h后 ,经 M TT法检测 ,活细胞数明显
减少 , IC50值为 2. 5× 10- 5 mol /L ,与对照组有显著
性差异 ,见表 1。
2. 4　 PAB诱发 LiBr细胞凋亡: 经双荧光染色法染
色后 ,可见对照组细胞核均匀一致 ,被 Hoechest
33342染成蓝色荧光 ,经 PAB处理后 ,核染色质凝
集、碎裂、出现凋亡小体 ,凋亡细胞数目随药物浓度
增加及用药时间延长逐渐增多 ,其中 PAB 5× 10- 5
mo l /L作用最为明显 ,于加药后 24 h细胞凋亡比率
·533·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 6期 2003年 6月
表 1　 PAB对 LiBr的细胞毒作用
Table 1　 Cytotoxic ef fect of PAB on LiBr cells
组别 药物浓度 / ( mol· L- 1) A 490 抑制率 /%
空白 　　 - 0. 0890± 0. 0058 0
对照 　　 - 0. 4640± 0. 0257 0
PAB 3. 125× 10- 6 0. 3758± 0. 0295* 23. 52
6. 250× 10- 6 0. 3052± 0. 0276* * 42. 35
1. 250× 10- 5 0. 2922± 0. 0236* * 45. 82
2. 500× 10- 5 0. 2702± 0. 0249* * 51. 69
5. 000× 10- 5 0. 2343± 0. 0145* * 61. 25
1. 000× 10- 4 0. 1893± 0. 0065* * 73. 25
　　与对照组比较: * P < 0. 05　* * P < 0. 01
　　 * P < 0. 05　* * P < 0. 01 vs cont rol g roup
可达 50% 以上 ,加药后 48 h 细胞凋亡比率可达
80% 以上。
2. 5　 PAB增强 LiBr细胞 p21WAF1的表达:经免疫
细胞化学染色后 ,在光学显微镜下可见 p21WAF1表达
阳性产物位于细胞核和细胞浆中 ,其中核周区染色
较深 ,其余区域则较浅。实验组经 PAB处理后可见
阳性颗粒在细胞核区明显增强 ,以 5× 10- 5 mol /L
PAB处理后作用最为明显。在放大 200倍的视野下
计数 1 000个细胞 ,计算阳性细胞占总细胞的比率 ,
每种处理取 4个标本的均值 ,阳性细胞百分率由
( 4. 13± 1. 08)% 升高至 ( 43. 18± 4. 35)% ,有显著
性差异 (P < 0. 01,n= 4)。
3　讨论
　　实验结果表明 , PAB能有效地抑制 LiBr细胞
的体外增殖 ,并能诱导其凋亡。 50μmol /L PAB处
理 LiBr细胞 24 h后 ,活细胞数较对照组减少达
66% , 48 h达 89% ,并随时间延长对细胞的抑制率
也增加 ,细胞生长曲线测定及 M TT细胞毒实验检
测均证明 PAB对细胞有明显抑制作用 ,其抑制率
与药物浓度呈剂量依赖关系。 细胞形态观察与双荧
光染色法观察证明 , PAB可诱导 LiBr细胞凋亡 ,使
细胞核染色质凝集、边移、并发生碎裂、出现凋亡小
体 ,而且还观察到凋亡细胞的比例与药物浓度及作用
时间呈正相关。通过免疫细胞化学染色方法检测 Li-
Br细胞内的 p21WAF1基因表达 ,其表达明显增强 ,表
明 PAB能阻止 LiBr细胞进入 S期 ,抑制细胞增殖 ,
初步阐明了 PAB抑制肿瘤细胞生长的作用机制。
细胞凋亡是正常细胞发育过程中细胞清除的正
常途径 ,许多研究表明 ,肿瘤的发生与细胞凋亡的调
节紊乱密切相关 [5 ]。凋亡发生时有凋亡小体形成 ,并
被巨噬细胞吞噬 ,因此不会引起炎症反应 ,因此采用
外源性药物诱导肿瘤细胞凋亡是一种非常理想的方
法。 本实验证明 PAB在抑制人黑素瘤细胞增殖的
同时使细胞趋于凋亡 ,但作用机制尚不十分清楚 ,
PAB作为细胞外信号分子 ,作用于细胞后 ,其受体
和信号转导的过程 ,以及如何启动细胞凋亡基因表
达值得进一步研究。
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西红花酸对压力超负荷致心肌肥厚大鼠的 ATPase及胶原的影响
沈祥春 ,钱之玉
(中国药科大学 药理教研室 ,江苏 南京　 210009)
摘　要: 目的　研究西红花酸对压力超负荷所致心肌肥厚大鼠的 AT Pase及胶原含量的影响。 方法　采用腹主动
脉部分狭窄术致大鼠心肌肥厚模型 ,大鼠分为早期组和晚期组 ,又各自分为假手术对照组、模型组、卡托普利组、西
红花酸 100, 50 mg /kg组。 测定心脏重量参数 ,采用试剂盒测定 Na+ , K+ -ATPase; Ca2+ , Mg2+ -ATPase的活力及
羟脯氨酸的含量。结果　模型早期组 (术后 24 h) ATPase活性明显降低 ,模型晚期组 (术后 1个月 ) ATPase活性
降低更加明显 ,羟脯氨酸的含量明显增加。 西红花酸晚期组 (给药 1个月 )能显著提高心肌组织的 ATPase活力 ,
·534· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 6期 2003年 6月
收稿日期: 2002-10-28作者简介:沈祥春 ,男 ,山东郯城人 ,中国药科大学博士研究生 ,主要研究方向:生化药理。
* 通讯作者　 Tel: ( 025) 3271322