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多维液相色谱及其在中药研究中的应用
吴剑威1, 2 ,赵润怀2 , 陈 波2 ,杨美华1!
( 1 中国医学科学院 北京协和医学院药用植物研究所,北京 100193;
2 中国药材集团公司 科技研发部, 北京 102600)
摘 要:多维高效液相色谱以其快速、高效、自动化程度以及易与质谱等其他技术联用等优势成为研究应用的热
点。对近年来多维液相色谱技术及其在中药研究中的应用进行了综述,并对多维液相色谱的发展趋势和前景进行
了展望。
关键词: 多维液相色谱;中药; 应用
中图分类号: R286 02 文献标识码: A 文章编号: 0253- 2670( 2010) 06- 1020- 04
Multidimensional liquid chromatography and its application in Chinese materia medica
WU Jianwei1, 2 , ZHAO Runhuai2 , CHEN Bo2 , YAN G Meihua1
( 1 Inst itute of Medicinal P lant Development, Chinese Academy o f Medical Sciences and Peking Union Medical College,
Beijing 100193, China; 2 Techno lo gy Development Center , China National Group Corp
of T raditiona l and H erbal M edicine, Beijing 102600, China)
Key words: multidimensional liquid chr omatography ( MDLC) ; Chinese materia medica; applicat ion
中药活性成分的分离、分析一直是中药研究的热点问
题。近 10年来, 色谱填料粒径的降低以及固定相表面理化
特性的改变极大地提高了液相色谱柱的分辨能力, 在一定程
度上, 较好地实现了对目标物质的分析研究。但是, 中药是
复杂的体系, 通常一个样品中包含了几十甚至几百种组
分[1] ,而各组分之间的量差别通常又很大。因此, 如何更好
地解决单柱、单检测器色谱分析方法的局限性迫在眉睫。多
维液 相 色 谱 ( multidimensional liquid chromato gr aphy ,
∀1020∀ 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 6 期 2010 年 6 月
!收稿日期: 20091222 基金项目:北京市自然科学基金资助项目( 7082060)作者简介:吴剑威( 1982 # ) ,男,硕士研究生,主要从事中药材质量标准及新药开发研究。
* 通讯作者 杨美华 Tel& Fax: ( 010) 62899730 Em ail: yangmeihua15@ hotmail. com
MDLC)是在高效液相色谱( H PLC)基础上发展起来的一项
技术[ 2] , 它通过在技术上及设备上的改进, 组合不同的分离
模式构建多维系统, 为中药成分分析提供了较好的分辨率,
有效地解决了复杂体系样品的分析问题。目前, MDLC 已在
中药化学、聚合物分析[ 3]、生命科学[ 4~ 12]、环境科学[ 13~ 15] 等
诸多领域有着广泛的应用。
1 MDLC的原理
MDLC 利用两个或更多的色谱柱对复杂样品中的待分
析组分进行分离, 在柱与柱之间利用切换阀将经过初次分离
的全部或部分组分选择性地转入另一根或多根不同类型的
色谱柱中做进一步分离。MDLC 具有对样品进行分离富集
的功能, 可显示提高色谱系统的分离能力和选择性, 缩短分
析时间; 并且能从复杂的多种组分中排除干扰物质, 再选择
性地针对感兴趣的组分进行分析[ 16]。20 世纪 80 年代, Gid
ding s [17, 18]建立了多维分离系统的数学模型, 指出在满足一
定的条件下, 多维分离系统的峰容量应为各单维分离模式峰
容量的乘积, 即如果联用的 n 维分离模式的峰容量分别为
N 1 , N 2 ∃Nn , 则总峰容量为 N 1 % N 2 % ∃ % Nn。该方面的研
究工作起步较早的是 Jo rg enson 课题组。1990年 , Jor genson
等[ 19]在研究& 中心切割∋技术 ( hea rtcut ting) 的基础上第一
次实现了& 全二维切割∋, 即用两个定量管和一个八通阀实现
了离子交换色谱 ( IE)和体积排阻色谱( SEC)的在线连接。
自此,以八通阀[ 20]、四通阀[21]、十通阀[ 22]为代表的接口模式
偶联的全二维或多维色谱模式纷纷被设计运用。
2 MDLC的分类
从不同角度, MDLC 可以有不同的分类。根据对进样样
品中完成分析的组分数量可以把 MDLC 分为部分模式和整
体模式[ 23, 24]。部分模式是指将第一维洗脱流分中感兴趣的
部分注入后继续进行分离, 即&中心切割法∋。很明显, & 中心
切割法∋并不能得到样品的全部组分信息,不利于对未知样
品组分进行操作。另一方面, 为了判断感兴趣组分的切割时
机,还需要在各个分离模式下测量单一组分标准品的保留时
间, 增大了工作量。整体模式即全多维液相色谱 ( compre
hensiv e MDLC) ,是对注入第一维色谱柱的全部样品或者是
能够代表所有组分的部分样品进行后续的分离。因此,全多
维液相色谱能得到全部组分的保留信息, 可以对复杂体系中
的未知样品进行分析。
MDLC 还可以根据对一维洗脱流分进行后续分离的连续
性分为离线操作 ( offline mode)和在线操作 ( online mode)。
离线操作是将前一根色谱柱分离的流分依次收集起来, 然后
再分别注入第二根色谱柱进行分离。在线操作是将第一维洗
脱流分中感兴趣的部分直接切换注入后续柱上, 或者是利用
收集切换装置交替地收集适量的第一维流分, 并按照特定时
间间隔进行后续柱分离,使样品在第一维与最后维的分离几
乎同时结束。显而易见, 与离线操作相比, 在线操作具有分辨
率高,无样品损失,快速,易于实现自动化等优点[19]。
3 MDLC的接口切换技术
将第一维分离的样品组分有效地转移到后续柱中需要
适当的接口切换技术来实现。由此可见, 接口切换技术在
MDLC 分析中的重要性。常用的接口切换技术有样品环储
存切换技术、捕集柱切换技术以及平行柱交替技术等。针对
不同的色谱柱系统, 需选择合适的切换接口形式。另外, 为
了达到更好的切换与分离效果,不同的切换技术也可以组合
使用[25]。不管是哪种接口形式, 接口中选用的阀一般有 4、
6、8、10、12 通道等。
3. 1 样品环储存切换技术: 一维洗脱产物可使用两个样品
环交替地储存转移到随后维度系统中,通过改变样品环的体
积可以改变随后维度的进样体积,常用于整体模式的微柱二
维液相色谱系统中。样品环的体积由第一维色谱柱的流速
和随后维度色谱柱的运行及平衡时间决定。Opiteck 等[ 20]
及 Stro ink 等[26]分别采用配两个样品环的 8 通及 6 通阀组
合阳离子交换和反相色谱两种模式构建二维液相色谱分离
系统。当其中一个样品环储阳离子柱的洗脱产物时, 另一个
样品环内的分析物被转移到反相柱中。
3. 2 捕集柱切换技术:捕集柱切换技术利用捕集柱预先捕集
第一维洗脱产物, 可以方便地控制其中感兴趣的组分进入第
二维系统中,常用于部分模式。Sweeney 等[24] 在二维液相色
谱中,采用低温捕集柱连接第一和第二维色谱柱,实现中心切
割, 用低分子质量的聚苯乙烯聚合物评价了捕集与分离效果,
结果显示从一维切割的 32 个连续的部分可被很好地捕集,回
收率很高。Chen 等[ 27]用毛细管等电聚集和毛细管反相液相
组成二维分离系统,接口采用两个 6通阀,在两个阀之间连接
6 个填充 5!m 多孔 C18填料的反相柱, 以捕集 12 个等电点不
同的组分,并将其进一步洗脱到第二维 C18毛细管柱中。此方
法表现出了良好的富集效果和分离能力, 对低丰度物质的分
离效果更为明显。Davis等[ 28]以强阳离子交换和反相色谱构
建二维系统,接口 6通阀中外接捕集柱,进样20 min 后捕集物
被有机溶剂梯度洗脱到第二维分析柱中。
3. 3 平行柱交替切换技术: 平行柱交替分析切换技术在第
二维中使用两支或多支色谱柱, 当其中的一支色谱柱进样
时,第二支色谱柱正在洗脱。相比以上两种切换技术而言,
平行柱交替分析技术更适用于由常规柱组成的多维液相色
谱系统。Unger等[ 29]以 35 mm % 4. 6 mm 离子交换柱作第
一维分离系统,两个平行的 14 mm % 4. 6 mm 反相柱作为第
二维分离系统,通过一个 10 通阀完成切换,两支反相柱如同
样品环一样交替地储存一维洗脱产物。使用该系统分离蛋
白质样品,在一维中不能被分离的蛋白质在二维中大部分可
得到分离, 总峰容量可达 600, 保留时间的 RSD 小于 1%
( n= 5) ,峰面积的 RSD 小于 15% ( n= 15) , 蛋白质的平均检
出限为 300 ng, 总分析时间小于 20 min。此外, Opiteck
等[21]及 Unger等[ 22]同样采用平行柱交替切换技术,实现了
高速率进样和高分辨率的样品分析目的。
4 MDLC在中药研究中的应用
同一维液相色谱系统相比, MDLC 主要的优势在于提
供了不同寻常的峰容量,这使得大多数目标化合物和化合物
组可基线分离。同时,组分峰多维分离空间中被多重定位,
∀1021∀中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 6 期 2010 年 6 月
减少了干扰, 定性可靠。另外,相对于同族的其他成员来说,
每个峰在每次运动中其位置是稳定的, 容易识别[ 30]。因此,
MDLC 已经广泛地应用于中药这种包含了从无机到有机,
从极性到非极性复杂体系的分析研究中。
郭菲等[ 31]采用二维液相色谱质谱联用方法分离中药
复方葛根芩连汤的成分。以 Hyper sil BDS CN 柱作第一维
色谱柱, 水和甲醇梯度洗脱分离; 以 C18柱作第二维色谱柱,
乙酸铵缓冲液和乙腈梯度洗脱分离; 电喷雾电离/大气压化
学电离( ESI/ APCI)作为质谱检测复合离子源。研究发现,
搭建的二维液相色谱的峰容量显著高于一维色谱, 分离效果
得到了明显的提高。
唐涛等[ 32]以 1 个常规 6 通阀直接连接两支常规尺寸的
色谱柱, 构建了简单的阳离子交换色谱/反相色谱 ( SCX/
RP )在线二维液相色谱系统, 并对中成药六味地黄丸组分进
行了优化分离。样品经过第一维阳离子交换色谱( H ypersil
SCX)洗脱分离后, 通过六通阀直接富集到反相色谱柱( C18 )
顶端, 被转移到第二维色谱柱上继续进行分离。经过 11 步
不连续的线性梯度洗脱, 二维分离系统出峰数量达到 550 多
个, 峰容量达到 2 266。
脂质体色谱柱和 C18反相色谱柱通过一个 8 通阀进行耦
联, 同样也可以组成一个二维分析色谱系统。脂质体色谱柱
上的流分在反相色谱柱上分离后, 直接进入紫外检测器, 然
后经分流器分流后可进入大气压电离质谱。将该体系用于
银杏叶提取物的组成研究, 可以检测到包括银杏内酯 B、银
杏内酯 C、白果内酯等在内的 41 个组分[ 33]。
盛龙生等[ 34]以苦参作为分析对象, 采用强酸性阳离子
交换柱作为预分离柱, 柱后流动相修饰, 使其包含的生物碱
在富集柱上浓缩, 然后切换至分析柱系统,以反相柱、碱性流
动相分离生物碱。结果从苦参中检测出包括氧化苦参碱等
在内的 5 个生物碱, 并建立了二维液相色谱质谱联用分析
天然药物的技术平台。
H u 等[35]将氰基柱和反相柱作为二维分析色谱柱,建立
了川芎的二维液相色谱质谱联用分析系统, 从中分离了 52
种化合物, 其中 11 种得到了定性鉴定。采用多维或二维液
相色谱系统还对白芷[ 36]、龙胆泻肝汤[37]、清开灵注射液[ 38]
等中药及其制剂的化学成分进行分析研究, 同样取得了应用
传统一维液相色谱无法比拟的分离效果。
除此之外, 基于生物样品中药物浓度较低, 多维液相色
谱可用于中药(复方)药物动力学研究的成分测定[ 2]。
5 展望
MDLC 已经在成分复杂的中药研究中发挥了重要作
用。相信随着色谱填料的改进以及色谱仪器技术的进步,
MDLC 在动态分析范围、分离能力、分析通量和检测灵敏度
等方面还会有更大的发展, 为解决复杂中药分析体系的一些
关键问题发挥不可替代的作用。
由于 M DLC 采用柱结合模式, 柱间切换接口的设计对
样品的分离效果及整个系统的性能都有较大影响, 因此设计
和优化切换模式是今后 MDLC研究的一个热点问题。不同
分离模式之间的匹配组合、与质谱的联用和自动化分析等同
样也是 MDLC 研究的重要内容和方向。
此外,在仪器硬件方面, 商品化的色谱仪器日益完整, 但
目前仍以进口为主, 如何研制我国自主知识产权的关键设
备,同时开发相应的分离分析方法已成为当下关注的另一焦
点,也是提高我国科技能力的一个重要方面。相信随着人们
不断探索以及科学技术的进一步发展, MDLC 将为中药研
究贡献更大的力量。
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207213
竹节参化学成分及药理活性研究进展
欧阳丽娜1, 2 ,向大位1, 2 ,吴 雪1, 2 , 向大雄1, 2!
( 1 中南大学湘雅二医院 中药与天然药物研究室, 湖南 长沙 410011; 2 中南大学药学院, 湖南 长沙 410013)
摘 要:竹节参在土家族苗族聚居区民间医疗中被誉为& 草药之王∋ , 属珍稀濒危的名贵& 七类∋中草药。由于其兼
具北药人参滋补强壮和南药三七活血化瘀之功效, 近年来受到了广泛的关注。就竹节参的化学成分与药理活性研
究概况进行综述, 以期为竹节参的全面开发利用提供参考。
关键词: 竹节参;化学成分; 药理活性
中图分类号: R284 1 文献标识码: A 文章编号: 0253- 2670( 2010) 06- 1023- 05
竹节参为五加科 ( A raliaceae ) 植物竹节参 P anax
j aponicus C AM ey 的干燥根茎, 又名竹节人参、竹节七
等,其根茎横卧,呈竹鞭状, 肉质肥厚,白色, 结节间具凹陷茎
痕, 有羽叶三七、狭叶竹节参及珠子参等变种[ 1] , 广泛分布于
日本及中国西南至中部地区[ 2]。竹节参性温, 味甘、微苦, 归
肝、脾、肺经, 具有滋补强壮、散瘀止痛、止血、祛痰等功效。
现代药理学研究表明竹节参具有多种生物活性, 如对消化系
统、中枢神经系统、心血管系统、免疫系统、炎症、糖尿病、肥
胖、慢性疲乏综合症、肿瘤等均有不同程度的药理作用。随
着各国研究者对其研究的深入, 竹节参在食品保健及化妆
品、美容美颜等领域也得到了广泛的应用。本文就近年来竹
节参化学成分及药理活性的研究进展进行综述,以期为竹节
参的进一步研究提供参考。
1 化学成分
竹节参最主要的成分为皂苷[3] ,其量因产地不同而有所
变化,日本报道其根茎含粗皂苷约 23. 6% , 而我国文献报道
∀1023∀中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 6 期 2010 年 6 月
!收稿日期: 20090827 基金项目:湖南省中医药科研计划项目( 2009062)作者简介:欧阳丽娜( 1984# ) ,女,湖南岳阳人,在读硕士研究生,主要从事中药新资源的研究及中药新剂型的开发。
Tel: ( 0731) 5292093 Email : ou yangl ina410@ 126. com
* 通讯作者 向大雄 Tel: ( 0731) 5292093 Em ail: x iangdaxiong@ 163. com