全 文 ：差异值得深入研究 ,连翘叶和花的药用价值也需要
进一步验证。
本实验采用 PDA 检测器对最佳检测波长进行
选择 ,经 H PL C2PDA 在 200～400 nm 下进行全波
长扫描 ,在 235 nm 处出峰最多且整体信号明显 ,故
选择 235 nm 为检测波长。
本实验比较了不同提取溶剂 (甲醇、75 %甲醇、
50 %甲醇、30 %甲醇)的水浴回流和超声提取的提取
效果 ,同时还考察了不同提取时间的提取效果。结
果表明 ,以 75 %甲醇为提取溶剂 ,当超声提取 45
min 时 ,各色谱峰响应值不再增加 ,且方法稳定 ,重
现性好。
参考文献 :
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高产绿原酸杜仲细胞悬浮培养体系优化研究
颜日明1 ,2 ,张志斌1 ,邱晓芳1 ,曾庆桂1 ,游 　海1 ,朱 　笃1 ,2 3
(11 江西师范大学生命科学学院 江西省亚热带植物资源保护与利用重点实验室 ,江西 南昌 　330022 ;
21 江西省天然药物活性成分研究重点实验室 ,江西 宜春 　336000)
摘 　要 :目的 　优化杜仲细胞悬浮培养及其产绿原酸的条件。方法 　研究基本培养基种类、激素质量浓度、碳源种
类及质量浓度、p H 值、接种量和摇床转速等因素对杜仲细胞生长和绿原酸产量的影响 ,建立了高产绿原酸的悬浮
细胞培养体系。结果 　B5 培养基 + 015 mg/ L NAA + 016 mg/ L 62BA、蔗糖 30 g/ L 、初始 p H 510～515、接种量 20
g ·FW/ L 以及摇床转速 110 r/ min 为杜仲细胞悬浮培养的适合条件。结论 　优化后的培养条件为杜仲细胞大规
模悬浮培养生产天然活性成分奠定了基础。
关键词 :杜仲 ;细胞悬浮培养 ;绿原酸
中图分类号 :R28211 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :0253 2670 (2010) 02 0301 04
　　杜仲 Eucom mi a ul moi des Olive 为杜仲科杜仲
属多年生落叶乔木 ,其干燥树皮为我国特有名贵中
药 ,具有补肾健腰、强筋壮骨、提高机体缺氧耐力、改
善提高机体免疫功能、降低血脂、平衡调节血压等功
效。其药用成分包括木脂素类、环烯醚萜类、苯丙素
类和黄酮类等。其中属于苯丙素类物质的绿原酸具
有广泛的抗菌、抗病毒、抗诱变、抗肿瘤作用[1 ] 。绿
原酸具有较强药理活性 ,对消化系统、血循环系统和
生殖系统均有作用[2 ] ,还可能作为抗 H IV 的先导化
合物 ,具有抗逆转录酶的活性[3 ] 。但是杜仲作为第
三纪孑遗的古老树种 ,其野生资源正在日益稀竭 ,同
时杜仲栽培周期长 ,商品药材的有效药用成分量极
低 ,产量质量都不稳定。运用细胞工程生产有用次
生代谢物质是目前全世界生物技术研究的三大潮流
之一 ,因此采用生物技术提高其活性成分的量势在
必行。目前 ,有关杜仲的组织培养、快繁及培养条件
对愈伤组织次生代谢产物合成影响的研究国内外已
有较多研究 ,但有关杜仲细胞悬浮培养研究仅有少
量报道[ 4 ,5 ] 。本实验通过对杜仲细胞悬浮培养及其
产绿原酸条件优化 ,为通过杜仲细胞大规模生产次
级代谢产物奠定基础。
1 　材料与方法
111 　材料 :杜仲种子 2005 年 11 月采于庐山 ,由南
昌大学生命科学学院黄兆祥教授鉴定。
112 　愈伤组织的诱导 :杜仲愈伤组织系由杜仲种子
萌发的无菌苗真叶诱导 ,诱导的培养基为含 110
mg/ L 2 , 42D + 11 0 mg/ L NAA (萘乙酸 ) + 110
mg/ L 62BA (62苄氨基嘌呤) 的 MS 培养基[ 6 ] 。置于
·103·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 2 期 2010 年 2 月
3 收稿日期 :2009204208　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :教育部重点科技项目资助 (地方 204078)
作者简介 :颜日明 (1979 —) ,男 ,在读博士研究生 ,研究方向为发酵工程。E2mail :yanriming @yahoo1com1cn3 通讯作者　朱　笃　Tel : (0795) 3200616 　E2mail :zhudu12 @1631com
PQX 多段人工气候箱中进行继代培养 ,温度为 25
℃,光照和黑暗均为 12 h/ d ,光照 1 000 lx ,愈伤组
织 8～10 d 继代一次 ,经过半年的驯化培养得到无
性细胞系[5 ,6 ] 。
113 　细胞悬浮培养体系的建立 :将生长旺盛、结构
疏松、易于分散的愈伤组织转移到液体培养基中 ,置
于摇床中进行悬浮培养 ,摇床转速 110 r/ min ,培养
温度 25 ℃,全天光照 ,光照强度为 1 000 lx ,培养 1
周后 ,培养液中即有悬浮单细胞或小细胞团出现。
继代培养时 ,加入等量的新鲜培养液 ,摇匀 ,稍静置 ,
待大细胞团沉降后分瓶 ,不需滤过 ,即可得到不含大
细胞团块的培养物。这样通过 3～4 次继代培养 ,即
可得到只含单细胞或小细胞团的培养物。
114 　细胞生长测定 :悬浮培养细胞经 400 目不锈钢
筛网滤过 ,蒸馏水洗涤 3 次 ,称得细胞鲜质量 ,50 ℃
烘干至恒重即得干质量 ,计算细胞生长率[细胞增长
率 = (收获细胞量 - 接种细胞量) / 接种细胞量 ×
100 %]。
115 　绿原酸的提取及测定 :见文献报道[7 ] 。
2 　结果与分析
211 　培养条件优化
21111 　基本培养基及激素浓度筛选 :由于液体环境
下 ,植物细胞的生长状态与固体培养中并不相同 ,因
此在悬浮细胞系建立后 ,对液体基本培养基和激素
进行 L 9 (34 ) 正交设计优化。正交试验数据和结果
分析分别见表 1、2。
表 1 　正交试验结果
Table 1 　Result of orthogonal test
试验号
因　素
基本培养基类型 萘乙酸/ (mg ·L - 1) 62苄氨基嘌呤/ (mg ·L - 1) 生物量/(g ·L - 1干质量) 绿原酸/(mg ·L - 1)
1 MS 015 013 3131 ±0114 141 44 ±01 52
2 MS 110 016 2195 ±0116 121 81 ±01 46
3 MS 115 110 3119 ±0124 131 58 ±01 42
4 B5 　 015 016 5195 ±0112 251 90 ±01 74
5 B5 　 110 110 5190 ±0107 261 04 ±01 82
6 B5 　 115 013 4163 ±0110 191 67 ±01 40
7 N6 　 015 110 3118 ±0118 141 28 ±01 44
8 N6 　 110 013 2127 ±0110 91 69 ±01 52
9 N6 　 115 016 3120 ±0118 141 30 ±01 62
　 K1 　 3115 (13161) 3 41 15 (18121) 3 3140 (14160) 3
　 K2 　 5149 (23187) 3 31 71 (16118) 3 4103 (17167) 3
　 K3 　 2188 (12176) 3 31 67 (15185) 3 4109 (17197) 3
R 2161 (11111) 3 01 48 (21 36) 3 　 0169 (31 37) 3 　
　　　　3 生物量 (g/ L)和绿原酸产量 (mg/ L) (括号内)
　　　　3 biomass (g/ L) and chlorogenic acid (mg/ L) (in parent hesis)
表 2 　方差分析
Table 2 　Analysis of variance
因　素 离差平方和 平均方差 F值 显著性
培养基类型 121 37 (2291 50) 3 61 19 (1141 75) 3 261 89 (201 33) 3 显著 (显著) 3 3 　　
萘乙酸 01 42 (91 77) 3 01 21 (41 89) 3 01 91 (0187) 3 不显著 (不显著) 3 3
62苄氨基嘌呤显著性 01 88 (21 85) 3 01 44 (101 42) 3 11 90 (1185) 3 不显著 (不显著) 3 3
　　　　3 生物量 (g/ L)和绿原酸产量 (mg/ L) (括号内) ; 　3 3 因子对生物量和绿原酸产量 (括号内)的显著性 (α= 0105)
　　　　3 biomass (g/ L) and chlorogenic acid (mg/ L) (in parent hesis)
　　　　3 3 significant degree of biomass and chlorogenic acid (in parent hesis) atα= 01 05
　　结果表明 ,培养基的种类对细胞生物量的增长
和绿原酸的合成起很大的作用。B5 培养基更有利
于杜仲细胞的生长和绿原酸的合成 ,同时通过对细
胞活力和褐化情况的观察和测定 ,发现虽然杜仲细
胞在 B5 培养基中有一定程度的褐化现象 ,但是收
获时细胞的活力仍然较高 ,说明细胞仍然有很大的
增长潜力 ;在 MS、N6 培养基中的悬浮细胞虽然褐
化程度很轻 ,但细胞增长缓慢 ,绿原酸合成量也相对
偏低 ,同时收获时细胞活力也较低。说明 B5 是杜
仲悬浮培养的一种比较优良的培养基。结果还表明
激素对细胞生物量的增长和绿原酸的合成影响均不
太明显 ,且 016 %、110 %的 62BA 对于杜仲的生长和
绿原酸合成几乎没有区别。通过综合分析 ,确定最
终的杜仲悬浮培养基为 B5 + 015 mg/ L NAA + 016
mg/ L 62BA。
21112 　碳源种类筛选及浓度优化 :碳源是细胞生长
·203· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 2 期 2010 年 2 月
的能量来源和构成细胞骨架的重要成分 ,不同的碳
源物质对于植物细胞的生长和此生代谢产物的合成
都有影响[8 ] 。本试验观察了葡萄糖、麦芽糖、乳糖、
蔗糖等不同碳源对悬浮培养细胞生长和绿原酸合成
的影响 ,选用不同碳源质量浓度均为 30 g/ L 。由图
1 可见 ,以果糖为碳源时 ,最适于细胞的生长 ,但以
蔗糖为碳源时 ,不仅有利于细胞的生长 ,同时绿原酸
产量最高 ,且蔗糖的来源相比果糖要丰富 ,因此选择
蔗糖作为碳源。
图 1 　不同碳源对杜仲悬浮细胞生长和
绿原酸合成的影响
Fig11 　Effects of different carbon soures on growth
of suspension cell and chlorogenic acid synthesis
in suspension cultures of E1 ulmoides
　　进一步研究发现 ,用蔗糖作碳源时 ,杜仲悬浮细
胞的生长和绿原酸的合成都受到蔗糖质量浓度的调
节。图 2 显示了不同蔗糖质量浓度对杜仲悬浮培养
细胞生长和绿原酸合成的影响。当蔗糖质量浓度较
低时 ,由于碳源供应不足 ,使得杜仲细胞的生长和绿
原酸的合成均受到限制。蔗糖 30 g/ L 时 ,细胞生长
量和绿原酸产量均比较高。同时可以看到 ,高质量
浓度的蔗糖由于高渗透压而对杜仲细胞的生长和产
绿原酸都有抑制作用。因此也表明蔗糖作为碳源也
能通过调节培养体系的渗透压而对植物细胞的生长
和产物合成起到一定的作用。
蔗糖/ (g ·L - 1)
图 2 　蔗糖质量浓度对杜仲悬浮生长和绿原酸合成的影响
Fig12 　Effects of sucrose concentration on cell growth
and chlorogenic acid synthesis in suspension
cultures of E1 ulmoides
21113 　培养 p H 值对杜仲细胞生长和绿原酸合成
的影响 :环境 p H 值对植物细胞 p H 值会产生诸多
影响 ,包括引起质膜通透性变化 ,影响植物细胞对激
素的吸收以及植物细胞的代谢情况等等[9 ] 。本实验
通过测定高温灭菌后不同 p H 值条件下杜仲悬浮细
胞干质量的增长量影响的研究发现 ,杜仲细胞 p H
值在 510～515 时生长和绿原酸合成最好 ,其干质量
最高达到 6168 g/ L ,绿原酸产量也达到 2614 mg/ L
(图 3) ,当 p H 值超过 6 时 ,杜仲细胞的生长明显受
到抑制。由此可见培养基的 p H 值对杜仲悬浮细胞
的生长影响很大 ,酸性环境更有利于其生长。
p H 值
图 3 　pH值对杜仲悬浮生长和绿原酸合成的影响
Fig13 　Effects of pH on cell growth and chlorogenic acid
synthesis in suspension cultures of E1 ulmoides
21114 　接种量对杜仲细胞生长和绿原酸合成的影
响 :在对接种量的考察中 ,发现接种量较小的时候 ,
悬浮细胞活力低 ,生长缓慢。而接种量过大时 ,虽然
生长迅速但很快出现褐化现象 ,使悬浮细胞生长后
期有大量细胞死亡 ,不利于进行继代培养。从图 4
可以看出在接种量为鲜质量 20 g/ L (干质量 116
g/ L) 时 ,悬浮细胞的生物量和绿原酸合成量最大 ,
且细胞活力更好 ,更有利于进一步继代培养 ,因此选
定鲜质量 20 g/ L 接种量为悬浮细胞培养体系建立
的最适接种量。
21115 　摇床转速对杜仲悬浮培养细胞生长和绿原
酸合成的影响 :摇床转速对杜仲悬浮培养细胞生长
和绿原酸合成影响很大 ,从图 5 可知 ,摇床转速为
70 r/ min 时 ,杜仲细胞生长速度较慢 ,生长量为
3137 g/ L ,绿原酸合成量也只有 12117 mg/ L ;当摇
床转速为 110 r/ min 时 ,两者分别达到 5143 g/ L 和
19198 mg/ L ;当摇床转速提到 130 r/ min 时 ,细胞生
长和产物合成较差。这可能是由于摇床转速高时 ,
剪切力较高 ,引起细胞破碎死亡 ,从而抑制了细胞的
生长和产物的合成。
21116 　优化条件下杜悬浮培养细胞生长和绿原酸
积累过程 :将杜仲悬浮细胞在上述各种优化条件下
·303·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 2 期 2010 年 2 月
接种量/ (g ·L - 1鲜质量)
图 4 　接种量对杜仲悬浮生长和绿原酸合成的影响
Fig14 　Effects of inoculums sizes on cell growth
and chlorogenic acid synthesis in suspension
cultures of E1 ulmoides
摇床转速/ ( r ·min - 1)
图 5 　摇床转速对杜仲悬浮培养细胞生长和
绿原酸合成的影响
Fig15 　Effects of rotation speed on cell growth
and chlorogenic acid synthesis in suspension
cultures of E1 ulmoides
进行培养 ,并考察它的生长和绿原酸积累情况。结
果发现杜仲细胞接入新鲜培养液后 ,细胞在经过一
个短暂的延滞后开始快速生长 ,总体呈现“S”型曲
线。同时还可以看到 ,培养物中绿原酸质量浓度随
着细胞的生长而不断积累 ,第 8 天达最大值 27116
mg/ L ,量也达到最高的 01404 2 %。随后细胞生长
进入稳定期 ,但此时绿原酸的质量浓度也迅速降低。
在细胞生长前 8 d 内 ,绿原酸 ( Y) 与细胞量 ( X) 呈正
相关性 , Y = 01004 8 X - 01004 6 , R2 = 0198。
3 　结论
培养条件对植物细胞培养物的生长量增长和次
级代谢物积累的影响是错综复杂的 ,往往一个因素
培养时间/ d
图 6 　杜仲悬浮培养细胞生长和绿原酸积累
Fig16 　Cell growth and chlorogenic acid accumulation
in suspension cultures of E1 ulmoides
的调整会影响其他因素的变化。同时 ,植物体是各
不相同而具有其本身特殊性的。因此 ,对一种植物
细胞或一种次级代谢物合适的条件 ,不一定对其他
的细胞或次级代谢作用也适合。本实验在悬浮系初
步建立后 ,通过正交设计对培养基组成和激素配比
进行了优化 ,并在此基础上考察了碳源种类与浓度、
培养基 p H 值、接种量和培养转速等因素对杜仲悬
浮细胞生长和绿原酸产量的影响 ,建立了适宜杜仲
细胞生长和产物合成的培养条件。这为利用杜仲悬
浮细胞培养大规模生产天然活性物质提供重要的物
质基础。
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