全 文 ：马蓝叶中 葡萄糖苷酶的提取及酶学性质的研究
刘泽玉1 ,苏柘僮1 ,杨 明1* , 邹文铨2
( 1 成都中医药大学, 四川 成都 610000; 2 四川大学, 四川 成都 610000)
摘 要:目的 建立 pNPG法测定马蓝叶中葡萄糖苷酶的活性, 研究马蓝叶中葡萄糖苷酶的基本酶学性质, 为进
一步阐明青黛炮制原理提供依据。方法 采用 pNPG法考察马蓝叶中 葡萄糖苷酶活性测定的最佳条件。结果
最适反应条件为总反应体积 1 mL,反应时间 45 min, 底物pNPG 体积 0 2 mL ,浓度 25 mmo l/ L ,缓冲液 pH 值 6, 反应
温度 55 。在此条件下研究马蓝叶的粗酶液中葡萄糖苷酶的基本酶学性质, 结果表明该酶在 30~ 60 热稳定
性较差。该酶在 pH 5 0~ 7 0 比较稳定, 而在酸性条件下酶活下降较快, 酶的 pH 值稳定性范围较窄。酶在 4
下的保存稳定性较好。结论 确定了测定马蓝叶中葡萄糖苷酶活性的最佳条件, 探索了马蓝叶中 葡萄糖苷酶
的酶学性质,该酶的热稳定性、pH 值稳定性和保存稳定性的研究为青黛炮制原理的研究奠定了理论依据。
关键词:马蓝叶; pNPG法; 最适反应条件;葡萄糖苷酶活性
中图分类号: R286 02 文献标识码: A 文章编号: 02532670( 2010) 09146104
Extraction and enzymatic properties of glucosidase in leaves of Bap hicacanthus cusia
LIU Zeyu1 , SU Zhetong1 , YANG M ing1 , ZOU Wenquan2
( 1 Chengdu Univer sity o f T r aditional Chinese Medicine, Chengdu 610000, China; 2 Sichuan Universit y,
Chengdu 610000, China)
Abstract: Objective T o establish pNPG method for act ivity study of g lucosidase in Baphicacanthus
cusia and invest igate the basic enzymatic pr opert ies, then prov ide accordance for further study on pro cess
ing principle of I ndigo N atur ali s Methods pNPG Method w as adopted to invest igate the opt imum condi
t ions for activity study of glucosidase Results T he opt imum condit ions w ere as follow ing: the react ion
volume w as 1 mL, the react ion t ime w as 45 min, the volume of subst rate pNPG was 0 2 mL, the concen
t rat ion w as 25 mmo l/ L , the pH value o f buf fer solut ion w as 6, and the react ion temperature w as 55
Besides this, w e invest igated basic enzymatic propert ies of gluco sidase in B. cusia It indicated that
gluco sidase w as unstable under 30- 60 , w hile it w as stable under 4 It w as stable under pH 5 0-
7 0 and its act ivity decline rapidly acidic condit ion w hich manifested that the pH stability scope w as nar
r ow Conclusion T hrough researching for opt imum condit ions of act ivity and enzymat ic proper ties of
gluco sidase, w e dr aw the conclusion of thermal stability, pH stability, and stability in sto rag e T hen this
lay the foundat ion o f further study on processing principle of I ndig N aturalus
Key words: the leaves of Bap hicacanthus cusia Bremek. ; pNPG method; opt imum condit ions of reac
t ion; glucosidase act ivity
葡萄糖苷酶( EC3, 2, 1, 21)又称为 D葡萄糖
苷酶,属于纤维素酶类,存在于自然界许多植物体、酵
母、曲霉菌、木霉菌属及细菌内 [1] 。目前国内对植物
来源的葡萄糖苷酶的研究主要集中在茶叶、栀子
花、茉莉花等方面, 主要研究其在植物醇系香气的形
成中所起的重要作用[ 25]。传统饮片青黛的炮制工艺
中,马蓝叶浸泡过程即吲哚苷在葡萄糖苷酶的作用
下水解为吲哚酚的过程。本实验采用 pNPG法对马
蓝叶中细胞外酶葡萄糖苷酶的提取和活性测定条
件进行了探讨,并且对葡萄糖苷酶酶学特性进行了
相关研究,为阐明马蓝叶浸泡环节水解机制、工艺及
青黛炮制原理研究提供了理论基础。
1 仪器与试药
UV 1700紫外可见分光光度计 (日本岛津) ;
!1461!中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 9 期 2010 年 9 月
* 收稿日期: 20100115 基金项目:国家自然科学基金资助项目( 30772784)作者简介:刘泽玉( 1986 ) ,女,河北石家庄人,硕士研究生,研究方向为中药新制剂、新技术。
T el : (028) 61800127 Email: 409192399@ qq com
* 通讯作者 杨 明 Emai l: yangm ing16@ 126 com
BP211D 型电子分析天平 (德国 Sartor ius, 0 01
mg) ; SZ 93型自动双重纯水蒸馏器(上海亚荣生
化仪器厂) ; T GL 16G冷冻离心机(上海安亭科学
仪器厂)。
马蓝叶由四川江油恒源药业提供, 经成都中医
药大学生药教研室郭晓恒博士鉴定。对硝基苯
D葡萄糖苷( pNPG)、对硝基苯酚( ∀98% ) , Sigma
公司产品;柠檬酸、磷酸二氢钠、碳酸钠、氢氧化钠均
为 AR级,水为双重蒸馏水。
2 方法与结果
2 1 对硝基苯酚标准曲线的绘制: 在一定条件下,
葡萄糖苷酶能够水解对硝基苯D葡萄糖苷中的
糖苷键,生成对硝基苯酚, 在碱性条件下显黄色, 可
以通过比色法测定该黄色物质,进而计算出 葡萄
糖苷酶的活力。以 1 mol/ L 碳酸钠溶液作为溶剂,
配成 1 73、3 46、4 33、5 12、6 93、10 39 g / mL 对
硝基苯酚标准溶液。以 1 mol/ L 碳酸钠溶液为空白,
在紫外可见区扫描其最大吸收峰,以对硝基苯酚质量
浓度为横坐标,最大吸收峰处的吸光度为纵坐标,绘
制标准曲线。可以得出回归方程为 Y= 0 127 6X+
0 024 4, r2 ∀0 999 5。
2 2 葡萄糖苷酶粗酶提取液的制备[ 67] : 将马蓝
鲜叶剪碎,称取 2 5 g , 加入适量的预冷的 pH 6 0
0 2 mo l/ L 磷酸氢二钠0 1 mol/ L 柠檬酸缓冲液,
冰浴上充分研磨成匀浆。将匀浆移入离心管中,
4 , 15 000 r/ m in离心 10 min。将上清液移入一
量瓶中,用缓冲液( pH 6 0)定容至 25 mL, 得粗酶
提取液, 4 贮存备用。
2 3 葡萄糖苷酶粗酶活性测定: 在试管中加入
0 6 mL pH 6 0 的磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液,
25 0 mmo l/ L pNPG0 2 mL 和 0 2 mL 粗酶提取
液。将试管置于 55 恒温水浴中反应 45 m in。反
应结束后,向反应体系中加入 1 mol/ L 碳酸钠溶液
2 5 mL 终止反应[ 8] ,经适当稀释后在 402 nm 波长
下比色。
酶活性= (YV 2VN ) / (K V 1Mt)
式中 Y 为酶促反应的吸光度; V 为酶液的提取体积; V 1 为反
应体系中酶液体积; V 2 为总反应液体积; K 为对硝基苯酚标
准曲线的斜率; M 为试样质量 ; t为反应时间; N 为稀释倍数
葡萄糖苷酶活力国际单位定义为以 pNPG(对
硝基苯D葡萄糖苷)为底物,在一定的分析条件下,
每分钟释放出1 mol对硝基苯酚所需要的酶量。
2 4 影响 葡萄糖苷酶的提取与活力的因素考察
2 4 1 葡萄糖苷酶提取液的 pH 对酶活力的影
响:按照 2 2项下方法, 其他条件不变, 不同的 pH
缓冲液( pH 值分别为 3 5、4 0、4 5、5 0、5 5、6 0、
6 5、7 0、7 5、8 0)用于研磨、定容及稀释粗酶提取
液,以考察提取过程中 pH 值对酶活的影响。结果
见表 1。可见在提取马蓝叶中 葡萄糖苷酶时, 提
取粗酶液所加的缓冲液 pH 值会对酶活力产生较大
影响。当提取液 pH 值为 6 0的 0 2 mol/ L 磷酸氢
二钠0 1 mo l/ L 柠檬酸缓冲液时效果较好,酶活力
达到最大。
表 1 葡萄糖苷酶提取液 pH对酶活力测定的影响
Table 1 Effects of pH value in extract solution
of glucosidase on enzymatic activity
提取液 pH 值 酶活力/ ( U ! g- 1 ) 提取液 pH值 酶活力/ ( U ! g- 1)
3 5 17 81 6 0 29 65
4 0 25 01 6 5 28 54
4 5 26 65 7 0 28 41
5 0 27 82 7 5 27 95
5 5 28 21 8 0 26 97
2 4 2 酶促反应环境 pH 值对酶活力的影响:按照
2 3项下方法,其他条件不变,仅改变反应体系 pH 值
( 3 5、4 0、4 5、50、5 5、6 0、6 5、7 0、7 5、80) ,以测
定反应体系 pH 值对酶活力的影响。结果见图 1。可
见当反应体系 pH 值为 6时,测得的马蓝叶中的葡
萄糖苷酶活力最高,故反应体系最适 pH 值为 6。
图 1 pH值对酶活力测定的影响
Fig 1 Effect of pH value on enzymatic activity
2 4 3 底物浓度对酶促反应的影响:按照 2 3项下
方法,其他条件不变, 仅改变反应体系 pNPG 浓度
( 5 0、8 0、10 0、12 5、15 0、20 0、25 0、30 0
mmol/ L ) , 以测定反应体系 pNPG浓度对酶活力的
影响。结果见图 2。可见底物浓度由 5 mmol/ L 增
加到 25 mmo l/ L 时酶活力逐渐增大, 当达到 30
mmol/ L 时, 酶活力基本保持不变,故测定马蓝叶中的
葡萄糖苷酶活力的最适底物浓度为 25 mmol/ L。
2 4 4 反应温度对酶促反应的影响:按照 2 3项下
方法,其他条件不变, 仅改变反应体系的反应温度
( 35、40、45、50、55、60、70、80 ) , 以测定反应体系
的反应温度对酶活力的影响。结果见图 3。可见当
!1462! 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 9 期 2010 年 9 月
图 2 底物浓度对酶活力测定的影响
Fig 2 Effect of matrix concentrations
on enzymatic activity
图 3 反应温度对酶活力测定的影响
Fig 3 Effect of reaction temperatures
on enzymatic activity
温度由35 升高到 55 时酶活力呈现逐渐增大的
趋势,当升至 65 后酶活力急剧下降, 当达到70
时几乎测不出酶活, 可能已经失活,故测定马蓝叶中
的葡萄糖苷酶活力的最适温度为 55 。
2 4 5 反应时间对酶促反应的影响:按照 2 3项下
方法,其他条件不变, 仅改变反应体系的反应时间
( 15、30、45、60、75、90、105、120、135、150、180
min) ,以测定反应体系的反应时间对酶活力的影
响,结果见图 4。可见初始随着反应时间的延长酶
活力增大, 但当反应 45 m in 后酶活力有逐步下降的
趋势,故测定马蓝叶中的 葡萄糖苷酶活力的最适
反应时间为 45 min。
图 4 反应时间对酶活力测定的影响
Fig 4 Effect of reaction time on enzymatic activity
综上所述, 在葡萄糖苷酶活性分析时, 最大吸
收波长、反应时间、温度、pH 值和底物浓度都会对
葡萄糖苷酶的活性的测定产生一定的影响。单因素
试验结果表明,酶促反应的最适 pH 值为 6 0,最适温
度55 ,底物浓度 25 mmol/ L ,反应时间 45 min。
2 5 马蓝叶中 葡萄糖苷酶的基本酶学性质
2 5 1 酶的热稳定性研究:将粗酶液在不同温度下
保温一段时间后,再测其酶活,以判断其在不同温度
下的热稳定性,以新制酶液酶活力为 100%, 绘制热
稳定性曲线, 见图 5。可见酶在 30~ 60 时,随着
温度的升高,相对酶活有下降的趋势,而且随着时间
的延长下降的越多,其热稳定性较差,为青黛炮制过
程中温度的控制提供了依据。
图 5 酶的热稳定性
Fig 5 Thermal stability of enzyme
2 5 2 酶的 pH 值稳定性的研究:将粗酶液加入不
同 pH 值缓冲液后, 在 4 下静置 24 h, 测定酶活
力。以酶液在相应 pH 值条件下(未静置)的酶活力
为 100%, 绘制 pH 值稳定性曲线, 结果见图 6。
葡萄糖苷酶的稳定性范围较窄,在 pH 5 0~ 7 0比
较稳定,相对酶活性均在 90%以上,而 pH 值低于 4
时酶的稳定性较差, 尤其是在酸性条件下酶活下降
较快。此研究为青黛炮制过程中浸泡液的 pH 值调
控提供了一定的依据。
图 6 酶的 pH稳定性
Fig 6 pH Value stability of enzyme
2 5 3 酶的保存稳定性研究:将制好的粗酶液置于
冰箱中于4 保存,定时取样测定酶活力,结果见图
7。酶的保存稳定性较好, 随着保存时间的延长, 酶
活性下降幅度较小,保存10 d尚剩余 80%以上的酶
活力,由此可见,此酶具有较好的耐储存性。
图 7 酶的保存稳定性
Fig 7 Storage stability of enzyme
!1463!中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 9 期 2010 年 9 月
3 讨论
热稳定性试验表明, 此酶在30~ 60 稳定性较
差,保温 150 min 酶活基本降至原来的 20% , 提示
在炮制过程中温度的控制至关重要。pH 值稳定性
试验表明,在 pH 5 0~ 7 0比较稳定,而 pH 值低于
4时酶的稳定性较差, 尤其是在酸性条件下酶活下
降较快。保存稳定性试验表明, 在 4 下保存 10 d
酶活性仍较高, 保存稳定性较好。基本的酶学性质
为青黛炮制过程中浸泡环节温度和 pH 值的控制提
供了依据,对阐明炮制原理奠定了基础。
本研究试图证明马蓝叶细胞外存在葡萄糖苷
酶,并研究它的最佳酶解条件,以证明马蓝叶的浸泡
过程是由 葡萄糖苷酶水解吲哚苷为吲哚酚的过
程。并在此研究基础上, 确证了由马蓝叶中获取吲
哚酚可以利用马蓝叶中的细胞外酶,而不需要通过
发酵获取葡萄糖苷酶, 这样不仅大大缩短了生产
时间,而且使生产环境和浸泡液的卫生条件得到了
很大的改善,还为马蓝叶的再利用拓宽了道路。
参考文献:
[ 1] Woodw ard J , Wiseman A Fungal and other glucosidase,
thei r propert ies and applicat ions [ J] E nry meM icr obia l Te ch
nol , 1982( 4) : 7379
[ 2] 董尚胜,童启庆 栀子花中糖苷酶的分离及其与醇系香气形成
的关系[ J] 浙江大学学报, 2000, 26(1) : 8992
[ 3] 董尚胜,童启庆 茉莉花中D葡萄糖苷酶活性差异[ J ] 福
建茶叶, 1998 ( 4) : 910
[ 4] 赵 芹,童启庆 茶叶香气水解酶研究动态[ J] 福建茶叶,
1999 ( 1) : 57
[ 5] 郭雯飞 茶叶香气生成机理的研究[ J ] 中国茶叶加工, 1996
( 4) : 3437
[ 6] 江昌俊,李叶云 茶叶中D葡萄糖苷酶测定条件的研究[ J]
安徽农业大学学报, 1999, 26( 2) : 212215
[ 7] 骆耀平,董尚胜,童启庆,等 17个茶树品种新梢生育过程中
葡萄糖苷酶的变化[ J] 茶叶科学, 1997, 17(增刊) : 104107
[ 8] 王华夫,游小青 茶叶中葡萄糖苷酶活性测定[ J] 中国茶
叶, 1996 ( 3) : 1617
毛鸡骨草中异夏佛塔苷对照品的制备研究
宁丽娟1, 2 ,叶志文3 ,欧 彪3 ,汪 豪1, 2* , 叶文才2, 4 ,赵守训2
( 1 中国药科大学 现代中药教育部重点实验室, 江苏 南京 210009; 2 中国药科大学 天然药物化学教研室, 江苏 南京
210009; 3 广西玉林制药有限责任公司, 广西 玉林 537001; 4 暨南大学中药及天然药物研究所 ,广东 广州 510632)
摘 要:目的 建立毛鸡骨草中异夏佛塔苷对照品的制备分离方法。方法 取毛鸡骨草药材醇提浸膏的正丁醇萃
取部分用硅胶柱色谱分离,氯仿甲醇( 90# 10~ 70# 30)梯度洗脱, 收集异夏佛塔苷富集流份, 继续采用低压 C18柱
色谱及制备 H PLC 进行分离纯化,通过 NM R、MS 等波谱方法鉴定化合物结构, 经 T LC、HPLCUV 及 MS 联用等
技术进行质量分数检测。结果 从毛鸡骨草中制备分离的异夏佛塔苷对照品, 质量分数> 99 %。结论 本法得到
的异夏佛塔苷对照品符合中药化学对照品的相关技术要求, 为药材毛鸡骨草和含毛鸡骨草的成方制剂的质量控制
及药效物质基础研究提供化学对照品。
关键词:毛鸡骨草; 异夏佛塔苷;对照品; 制备高效液相色谱
中图分类号: R284 2; R286 02 文献标识码: A 文章编号: 02532670( 2010) 09146403
Preparation of isoschaftoside reference substance from Abrus mollis
NING Lijuan1, 2 , YE Zhiwen3 , OU Biao3 , WA NG Hao1, 2 , YE Wencai2, 4 , ZHAO Shouxun2
( 1 Key Laborat or y of Modern Chinese M edicines, China Pharmaceutical Univ ersit y, M inistry of Education, Nanjing 210009,
China; 2 Department of Natura l Medicinal Chemistry , China Pharmaceutical Univ ersity , Nanjing 210009, China;
3 Guangx i Yulin Pharmaceutical Co , Lt d , Yulin 537001, China; 4 Inst itute of T r aditional Chinese Medicine
and Natur al P roducts, Jinan Univer sity , Guangzhou 510632, China)
Abstract: Objective T o establish a preparat ive method fo r reference substance o f isoschaftoside f rom
Abr us moll i s Methods T he nbutanol f ract ion f rom the ethanol ex tract o f A moll i s was subject to co l
umn chromatog raphy on silica gel eluted w ith a gradient of CHCl3MeOH ( 90# 10 to 70# 30) The co l
lected f ract ion o f isoschaf toside w as successively purif ied by lowpressure ODS column and prepar at ive
HPLC It s str ucture w as ident ified by spect roscopic analy sis and the purity w as detected by TLC and
HPLCUVMS Results The T LC and HPLC analy sis show ed that the pur ity o f the reference substance
!1464! 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 9 期 2010 年 9 月
* 收稿日期: 20100323 基金项目:科技部∃ 十一五%重大新药创制项目( 2009ZX09103315) ;广西科学研究与技术开发项目(桂科攻 08150051)作者简介:宁丽娟,女,硕士生。T el: 15850686765 Email: lijuan nin g621@gm ail com
* 通讯作者 汪 豪 T el: ( 025) 86185376 Email: btwanghao@ yahoo com cn