全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 9 期 2011 年 9 月

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千斤拔属植物亲缘关系分析及其初步质量评价
张忠廉 1 *，张丽霞 1，宋美芳 1，李海涛 1，高微微 2
1. 中国医学科学院药用植物研究所云南分所，云南 景洪 666100
2. 中国医学科学院 北京协和医学院药用植物研究所，北京 100193
摘 要：目的 分析千斤拔属植物种间亲缘关系，并对其进行初步质量评价，为筛选新药源提供理论依据。方法 应用 ISSR
分子标记技术，对 14 种千斤拔属植物进行亲缘关系分析；同时，采用紫外分光光度法测其总黄酮量。结果 从 60 个 ISSR
引物中筛选出 30 个引物用于试验，共扩增出 367 个条带，其中多态性条带 363 条，共有带 4 条，多态性条带比例（PPB）
为 98.91%，遗传相似系数（GS）在 0.566 8～0.833 8，表现出丰富的遗传多样性；亲缘关系最近的为云南千斤拔和蔓性千斤
拔，遗传距离最远的为细叶千斤拔和墨江千斤拔；总黄酮量最高的为勐捧千斤拔，其次为蔓性千斤拔，云南千斤拔总黄酮量
也较高。结论 千斤拔属植物具有丰富的遗传多样性，云南千斤拔有成为药用植物蔓性千斤拔替代品的潜力。
关键词：千斤拔属；ISSR；遗传多样性；云南千斤拔；总黄酮
中图分类号：R282.2 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2011)09 - 1817 - 05
Analysis of genetic relationship and quality assessment on plants in Flemingia Roxb.
ex Ait. et Ait. f.
ZHANG Zhong-lian1, ZHANG Li-xia1, SONG Mei-fang1, LI Hai-tao1, GAO Wei-wei2
1. Yunnan Branch of Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences, Jinghong 666100, China
2. Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing
100193, China
Abstract: Objective To analyze the genetic relationship of the plants in Flemingia Roxb. ex Ait. et Ait. f. and make preliminary
quality accessment, in order to provide the theoretical basis for screening the new medicinal resource. Methods Inter-simple
sequence repeats (ISSR) markers were used to analyze the genetic relationship of 14 species in Flemingia Roxb. ex Ait. et Ait. f..
Meanwhile, spectrophotometry was used to measure total flavones. Results Thirty primers were screened out of 60 ISSR random
primers and produced 367 bands totally. Among them 363 bands (98.91%) were polymorphic, four bands were owned by all; The
genetic similarity (GS) was 0.566 8 －0.833 8, showing abundant genetic diversity; F. wallichii and F. philippinensis have the closest
genetic relationship, F. lineate and F. chappar have the largest genetic distance; The highest content of total flavones is in F.
mengpengensis and secondary is in F. philippinensis, total content of flavones in F. wallichii is above average. Conclusion The plants
in Flemingia Roxb. ex Ait. et Ait. f. have the abundant genetic diversity. As medicinal plants, F. wallichii has the potential for replacing
F. philippinensis.
Key words: Flemingia Roxb. ex Ait. et Ait. f.; inter-simple sequence repeats (ISSR); genetic diversity; Flemingiawallichii Wight et
Am.; total flavones

豆科（Leguminosae）千斤拔属（Flemingia
Roxb. ex Ait. et Ait. f.）植物全世界约 40 种，分
布于亚洲、非洲热带和大洋洲的澳大利亚地区，
中国产 17 种及 1 变种，主要分布于西南、中南和
东南各省[1-2]。该属植物在我国一直作为民族药及
民间药被广泛使用，其中有确切药用历史的就有
6 种[3]。《中国药典》2010 年版[4]规定千斤拔为豆
科植物蔓性千斤拔 F. philippinensis Merr. et
Rolfe、大叶千斤拔 F. macrophylla Willd. Prain 或
锈毛千斤拔 F. ferruginea Wall. ex Benth．的干燥
根；地方种还有球穗千斤拔 F. strobilifera (Linn.)
Ait.、腺毛千斤拔 F. glutiaosa (Prain) Y. T. Wei 和
宽叶千斤拔 F. latifolia Benth.等。该属植物大都具
有补肝肾、祛风湿、强腰膝的功效，民间常用于
治疗风湿性关节炎、腰腿痛、腰肌劳损、气虚脚
肿、肺虚久咳、白带过多、月经不调、跌打损伤

收稿日期：2011-04-02
基金项目：中国医学科学院药用植物研究所中央级公益性科研院所基本科研业务专项（YZYN-09-04）
*通讯作者 张忠廉（1982—），男，山西省阳泉市人，助理研究员，硕士研究生，从事药用植物种质资源方面的研究，主要研究方向为热带
药用植物分子生物学。Tel: 15924692393 E-mail: zzl0605@163.com
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等症[3-4]。研究表明[5]，千斤拔属植物及主要活性
成分为黄酮类，此外还含有香豆素类、萜类、挥
发油类、脂肪酸类等，具有抗炎镇痛、抗病原微
生物、抗氧化、抗血栓、保护神经及脑组织等生
物活性。近年来又发现因其富含植物雌激素而在
治疗妇女更年期综合征方面有很好的疗效。目前，
对千斤拔药用资源的需求量日益增大，《中国药
典》2010 年版只规定 3 种千金拔属植物为千斤拔
正品来源，使得千斤拔药用资源供不应求。
本实验采用 ISSR-PCR技术对千斤拔属 14种植
物进行遗传多样性分析，同时采用紫外分光光度法
测其总黄酮量，旨在通过分析种间亲缘关系及初步
的质量评估，扩大千斤拔药用资源，为千斤拔的合
理开发利用及新品种选育等提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 材料
实验所用的 14 种植物材料均来自于中国医
学科学院药用植物研究所云南分所栽培基地，均
经本所张丽霞副研究员鉴定，收集当年生新鲜嫩
叶，经硅胶快速干燥后带回实验室内−20 ℃低温
保存，用于遗传多样性分析中的 DNA 提取；收
集原植物根部适量并保存于自封袋中，以备下一
步总黄酮的测定。材料编号、种名及其拉丁名见
表 1。
表 1 14 份供试材料
Table 1 Fourteen materials used for test
编号 名 称 拉丁名 编号 名 称 拉丁名
HB 河边千斤拔 F. fluminalis MP 勐捧千斤拔 F. mengpengensis
DY 大叶千斤拔 F. macrophylla CY 长叶千斤拔 F. stricta
ZX 锥序千斤拔 F. paniculata YN 云南千斤拔 F. wallichii
GZ 贵州千斤拔 F. kweichowensis XY 细叶千斤拔 F. lineate
RM 绒毛千斤拔 F. grahamiana MJ 墨江千斤拔 F. chappar
XM 腺毛千斤拔 F. glutinosia KY 宽叶千斤拔 F. latifolia
MX 蔓性千斤拔 F. philippinensis AI 矮千斤拔 F. procumbens

1.2 仪器与试剂
扩增仪（Biometra professional standard），电
泳仪（Biometra 公司），凝胶成像系统（Uvitec 公
司），TU—1901 双光束紫外可见光分光光度计（北
京普析通用），DP3111 型 DNA 提取试剂盒（北京
百泰生物技术有限公司），引物（上海生工），
TaqDNA 聚合酶（Takara 公司 DR001B），DNA
Marker（Takara），染料木黄酮对照品（云南顺勃
生物工程公司，质量分数≥99.9%）。
1.3 ISSR-PCR 反应
1.3.1 基因组 DNA 的提取 材料经灭菌水清洗晒
干后，液氮充分研磨，按照 DNA 快速提取试剂盒
所提供方法提取基因组 DNA。DNA 样品经 0.8%琼
脂糖凝胶电泳检测，后经核酸蛋白分析仪测其原始
质量浓度，经适当稀释后−20 ℃保存备用。
1.3.2 PCR 反应 ISSR 反应体系：Mg2+ 1.5
mmol/L、dNTP 0.2 mmol/L、引物 0.5 μmol/L、Taq
DNA 聚合酶 1.25 U、缓冲液 2 μL 和模板 DNA 20～
50 ng，加 ddH2O 至 20 μL。
PCR 扩增程序：94 ℃预变性 4 min；30 个循环：
94 ℃变性 45 s，50～55 ℃（因引物序列不同退火
温度不同）退火 45 s，72 ℃延伸 2 min；循环结束
后 72 ℃延伸 10 min。反应产物用 2%琼脂糖凝胶电
泳，电压 100 V，电泳 90 min，经 EB 染色后在凝
胶成像仪上观察并照相记录。
1.3.3 引物筛选 从 60 个 ISSR 随机引物中筛选出
扩增条带清晰、多样性好、重复性高的 ISSR 引物
用于样品的遗传多样性分析，每个选定的引物至少
重复扩增 2 次。每条引物退火温度进行单独摸索，
使之达到最好扩增效果。
1.3.4 统计分析与数据处理 ISSR 为显性标记，同
一引物扩增产物中电泳迁移率一致的条带被认为具
有同源性，同一位点以带的有（“1”）和无（“0”）
记录电泳条带，得到 0、1 矩阵，对于较弱条带，如
其在重复性试验中反复出现，赋值 1。用 NTSYSpc
21-2 软件进行数据分析，对原始矩阵用其中的
SimQual 程序求 DICE 相似系数矩阵，用其中的
SHAN 程序和 UPGMA 方法进行聚类分析。
1.4 总黄酮的测定
1.4.1 对照品溶液的制备 精密称取充分干燥后的
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染料木黄酮 10 mg，置于 10 mL 量瓶中，加甲醇溶
解并定容至刻度，摇匀制成质量浓度为 1 mg/mL 的
对照品溶液。
1.4.2 供试品溶液的制备 采用千斤拔总黄酮最佳
提取工艺[6]，各样品粉碎，过 40 目筛，于 60 ℃烘
箱中干燥 6 h，冷却后置于干燥器中备用。精密称取
样品 1 g，置于 150 mL 三角瓶中，加 85%甲醇 40 mL
超声提取 40 min 1 次，滤过，定容至 100 mL 量瓶中，
摇匀。
1.4.3 线性关系考察 分别取对照品溶液 0.00、
0.005、0.01、0.02、0.03、0.04 mL 于 10 mL 量瓶中，
加甲醇至刻度，摇匀，258 nm 处测其吸光度（A）。
以质量浓度（X）为横坐标，A 值（Y）为纵坐标，
标准曲线为 Y＝0.021 9X－0.014 1，r＝0.999 1，在
0.5～4 μg/mL 内线性良好。
1.4.4 精密度试验 精密吸取同一对照品溶液，在
波长 258 nm 处连续测定 5 次 A 值，结果 A 值 RSD
为 0.32%，说明仪器精密度良好。
1.4.5 重现性试验 精密称取 MP 样品 3 份，制备
供试品溶液，测定总黄酮量，结果质量分数为
3.683%、3.701%、3.659%，RSD 为 0.5%，表明重
现性良好。
1.4.6 稳定性试验 取 MP 样品供试液，置室温条
件下保存，分别于 0、4、8、12、24、48 h 内测定 A
值。结果 A 值的 RSD 为 0.32%，表明供试溶液在
48 h 内稳定性良好。
1.4.7 加样回收率试验 精密称取巳知量的样品 5
份，分别加入质量浓度为 1 mg/mL 的对照品溶液 1
mL，258 nm 处测定样品 A 值，计算总黄酮量及样
品回收率。结果 5 份样品的平均回收率为 99.64%，
RSD 为 1.12%。
1.4.8 总黄酮的测定 取供试品 1 mL，置10 mL 量
瓶中稀释定容，258 nm 处测其 A 值，每个样品平行
测定 3 次，取其平均值，计算总黄酮质量分数。
2 结果分析
2.1 引物筛选及扩增结果
对 60 个 ISSR 引物进行筛选，共筛选出 30 个
扩增条带较多、谱带清晰、多态性较好的引物用于
ISSR-PCR 分析，具体引物名称、序列及其退火温
度见表 2，用筛选出的引物对 14 份材料进行 PCR
扩增，并对扩增片段进行统计分析。结果显示，扩
增产物的碱基数在 100～2 000 bp。30 个引物共扩增
出 367 个位点，每个引物检测到的位点为 5～24，
平均每个引物可扩增出 12.2 条条带，其中多态性条
带 363 条，共有条带 4 条，多态性条带比例（PPB）
为 98.91%。所筛选的 30 条引物全部是二核苷酸重
复序列类型的引物，其中（AG）n 有 7 条，（AC）n
有 10 条，（GT）n 有 10 条，（TC）n 有 3 条，说明千
斤拔属植物基因组中存在大量的 AG、AC、GT 二
核苷酸重复序列。图 1 为引物 UBC825 的扩增图谱。
2.2 遗传相似性分析
利用 NTSYS 软件计算出 14 份千斤拔属材料
间遗传相似系数（GS），得到供试材料相似性矩阵
（表 3）。供试材料的 GS 值在 0.566 8～0.833 8，表
现出丰富的遗传多样性。由相似系数矩阵可以看
出，在所有供试材料间，XY 与 MJ 样品间遗传距
离最远，即遗传相似性最低；YN 与 MX 遗传距离
最小，即二者间亲缘关系最近。
2.3 聚类分析
利用 UPGMA 法对千斤拔属植物进行聚类分
表 2 筛选出的 30 个 ISSR 引物序列及其退火温度
Table 2 Thirty ISSR primer sequences and their annealing temperature
编号 引物序列 退火温度/℃ 编号 引物序列 退火温度/℃ 编号 引物序列 退火温度/℃
UBC808 (AG)8C 54 UBC809 (AG)8G 54 UBC810 (GA)8T 52
UBC821 (CA)8T 52 UBC823 (TC)8C 54 UBC825 (AC)8T 52
UBC829 (TG)8C 54 UBC830 (TG)8G 54 UBC831 (AC)8YA 53
UBC834 (AG)8YT 53 UBC841 (AG)8YC 55 UBC843 (CT)8RA 53
UBC844 (CT)8RC 55 UBC846 (CA)8RT 53 UBC847 (CA)8RC 55
UBC848 (CA)8RG 55 UBC849 (GT)8YA 53 UBC850 (GT)8YC 55
UBC851 (GT)8YG 55 UBC855 (AC)8YT 53 UBC856 (AC)8YA 53
UBC858 (TG)8RG 55 UBC859 (TG)8RC 55 UBC860 (TG)8RA 53
UBC807 (AG)8T 52 UBC816 (GA)8G 52 UBC817 (CA)8A 52
UBC819 (GT)8A 52 UBC826 (GT)8C 54 UBC857 (AC)8YG 55
R=G/A, Y=C/T
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M AI MX KY XM MJ M RM XY GZ YN ZX CY DY MP HB

图 1 引物 UBC825 的 ISSR-PCR 扩增结果
Fig. 1 Amplification result of ISSR-PCR with Primer UBC825
表 3 ISSR-PCR 法建立的千斤拔属植物的遗传相似系数矩阵
Table 3 Genetic similarity matrix among plants in Flemingia Roxb. ex Ait. et Ait. f. based on ISSR-PCR
材料 HB MP DY CY YN GZ XY RM MJ XM KY MX AI ZY
HB 1.000 0
MP 0.795 6 1.000 0
DY 0.667 6 0.670 3 1.000 0
CY 0.683 9 0.713 9 0.678 5 1.000 0
YN 0.776 2 0.817 4 0.694 8 0.727 5 1.000 0
GZ 0.700 3 0.724 8 0.673 0 0.689 4 0.760 2 1.000 0
XY 0.705 7 0.686 6 0.613 1 0.580 3 0.667 6 0.574 9 1.000 0
RM 0.637 6 0.673 0 0.648 5 0.632 2 0.741 1 0.735 7 0.588 6 1.000 0
MJ 0.643 1 0.662 1 0.604 9 0.577 7 0.664 9 0.610 4 0.566 8 0.574 9 1.000 0
XM 0.801 1 0.782 0 0.659 4 0.664 9 0.762 9 0.670 3 0.790 2 0.618 5 0.640 3 1.000 0
KY 0.727 5 0.752 0 0.656 7 0.716 6 0.749 3 0.711 2 0.613 1 0.686 6 0.621 3 0.686 6 1.000 0
MX 0.762 9 0.792 9 0.692 0 0.730 2 0.833 8 0.746 6 0.659 4 0.694 8 0.667 6 0.765 7 0.762 9 1.000 0
AI 0.735 7 0.765 7 0.664 9 0.692 1 0.768 4 0.697 5 0.626 7 0.678 5 0.613 1 0.722 1 0.708 5 0.756 7 1.000 0
ZY 0.730 2 0.722 1 0.599 5 0.637 6 0.681 2 0.648 5 0.632 2 0.591 3 0.629 4 0.711 2 0.632 2 0.662 1 0.651 2 1.000 0
析，结果见图 2。由图可知，亲缘关系最近的为 YN
与 MX 样品，GS 达 0.833 8；次之为 HB 与 XM 样
品，GS 为 0.801 1；二分支与 MP 聚在一起成为较
独立的一支，然后与其他样品逐次聚在一起，显示
出逐步的递进演化过程；其中，GZ 样品与 RM 样
品较其他分支而言，单独聚为一支，GS 为 0.735 7；
而遗传距离最远的 XY 与 MJ 样品，GS 仅为 0.566 8，
显示出千斤拔属植物间丰富的遗传多样性。
2.4 总黄酮测定结果
因样品资源有限，本研究对 12 种千斤拔属植
物进行总黄酮测定，测定结果见表 4。其中，量最
高的为勐捧千斤拔（3.685%），其次为蔓性千斤拔
（3.136%），最低的为腺毛千斤拔（1.379%），而与
蔓性千斤拔亲缘关系最近的云南千斤拔总黄酮量
较高（2.148%）。

图 2 以 Nei’s 遗传距离构建的千斤拔属植物 ISSR 聚类图
Fig. 2 ISSR dendrogram of plants in Flemingia Roxb. ex Ait.
et Ait. f. based on Nei’s genetic distance
3 讨论
遗传多样性体现着物种对环境变化的适应能
力，遗传多样性越丰富，在环境发生变化时该物种
生存下来的可能性越大，ISSR 分子标记技术因其
HB
XM
MP
YN
MX
AI
KY
CY
GZ
RM
DY
ZY
XY
MJ
0.62 0.67 0.73 0.78 0.83
1 500 bp


1 000 bp
900 bp
800 bp
700 bp
600 bp
500 bp
400 bp
300 bp
200 bp
100 bp

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表 4 总黄酮测定结果
Table 4 Determination of total flavonoids
样品 总黄酮/% 样品 总黄酮/% 样品 总黄酮/%
MP 3.685 MX 3.136 DY 2.880
KY 2.834 MJ 2.461 YN 2.148
CY 2.142 ZX 1.955 XY 1.939
HB 1.769 GZ 1.573 XM 1.379

稳定、方便、多态性丰富等优点，在药用植物遗传
多样性及亲缘关系方面应用十分普遍 [7-9]。本研
究结果表明，千斤拔属种间遗传距离水平差距很
大，意味着该属植物对环境变化具有较强的适应
能力。而 Hamrick 认为，物种的分布范围影响其遗
传变异，遗传多样性水平与该物种分布区大小呈
正比[10]。依据韦裕宗等[2]的研究结果，该属植物有
1/3 种，其分布的海拔高度变化幅度较大，适应生
境较强、较广，此结论与本实验研究结果相一致。
千斤拔属植物虽在我国分布种类丰富，共有 17
种 1 变种，约占全属种类的 41%，尤其在我国云南
西南部，被认为可能是该属植物的分布中心及起源
中心，但大部分物种只在 1～3 个省区有分布，且种
质资源十分匮乏，只有大叶千斤拔和蔓性千斤拔作
为该属植物的广布种分布于我国 5 个省区以上[2]；
外加千斤拔属植物大部分种类具有药用价值，如蔓
性千斤拔、大叶千斤拔等作为妇科千金片、金鸡胶
囊等中成药的主要原料，被广泛用于中成药的生产，
从而造成千斤拔属植物野生资源锐减[11]。本研究通
过对千斤拔属植物亲缘关系进行分析，一方面对其
野生资源保护策略提供了理论依据，另一方面为筛
选新药源，使千斤拔属植物得到合理利用奠定基础。
从本研究结果可知，与千斤拔主流品种蔓性千
斤拔亲缘关系最近的是分布较广、资源丰富[9]且总
黄酮量较高的云南千斤拔。依据以往科学研究结果，
亲缘关系近的药用植物几乎具有相同或相似的功
效、化学成分、药理作用[12-13]。因此，云南千斤拔
具有作为蔓性千斤拔替代品的开发潜力（总黄酮量
最高的勐捧千斤拔虽与蔓性千斤拔的亲缘关系仅次
于后者与云南千斤拔的亲缘关系，但其资源匮乏且
分布范围很窄）。但仅以总黄酮量及亲缘关系判断其
是否能作为蔓性千斤拔替代品依据尚显不足，且关
于云南千斤拔化学成分及药理作用的研究相对甚
少，其是否能真正成为千斤拔替代品还需进一步科
学研究。此外，总黄酮量最高的勐捧千斤拔，仅在
我国云南省勐腊县（海拔 200～300 m）内分布，虽
资源存储量少，但可作为以后千斤拔优良品种选育
研究的候选种质资源以供选择，可对其进行深入的
活性成分及药理作用研究，充分发挥其潜在的药用
价值及商用价值。
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