全 文 ：药材与资源
金钗石斛相关序列扩增多态性反应体系的正交优化研究
赵红燕,冯尚国, 沈 波,王慧中*
(杭州师范大学 生物化学与分子生物学杭州市重点实验室,浙江 杭州 310036)
摘 要:目的 建立金钗石斛 Dend robium nobile 相关序列扩增多态性 ( SRAP) 反应体系,为金钗石斛分子生物学
研究提供技术支持。方法 运用 L 25 ( 56 ) 正交设计对影响金钗石斛 SRAP 反应的 5 个因素: 模板 DNA、M g2+ 、
dNTPs、Taq 酶、引物在 5个水平上进行优化试验,对 PCR 结果进行极差分析。结果 金钗石斛 SRAP 反应最佳
体系为: 25L PCR 体系中含有 20 ng 模板 DNA, 2 0 mmol/ L M g2+ , 0. 2 mmol/ L dNTPs, 1 U T aq 酶, 0. 6 mo l/
L 引物。各因素对 SRAP 反应的影响依次为: T aq 酶> M g2+ > dNTPs> 模板 DNA> 引物。结论 所建立的金钗
石斛 SRAP 反应体系具有标记位点清晰、多态性丰富、稳定性好等特点, 可用于金钗石斛分子生物学的研究。
关键词:金钗石斛; SRAP; 优化; 正交设计
中图分类号: R286 1 文献标识码: A 文章编号: 02532670( 2010) 08135306
Optimization of sequencerelated amplified polymorphism system in Dendrobium nobile
based on orthogonal design
ZHAO Hongyan, FEN G Shangguo, SHEN Bo , WANG Huizhong
( Key Labor ator y of H angzhou City fo r Biochemistry and Mo lecular Bio log y, H ang zhou Normal Univ ersity ,
H ang zhou 310036, China)
Abstract: Objective To establish the opt imal sequencerelated amplif ied polymorphism ( SRAP) reac
t ion system for molecular biolo gy r esearch in Dendrobium nobi le . Methods T he L 25 ( 56 ) orthogonal design
w as used to opt imize SRAPPCR amplificat ion sy stem of D. nobile on f ive levels, the exper iment w as per
formed on f iv e factors: template DNA, M g
2+
, dNT Ps, T aq DNA po lymerase, and primer. The data gen
erated by SRAPPCR were analyzed. Results The opt imal condit ion of the f ive impo rtant factors, tem
plate DNA, M g
2+
, dNT Ps, Taq DNA po lymerase, and primer in the 25 L SRAPPCR react ion system
w ere 20 ng, 2. 0 mmol/ L, 0. 2 mmo l/ L, 1 U, and 0. 6 mol/ L , respect ively. T he effect iv e deg ree of the
factor s on the SRAP react ion w as in the o rder: T aq DNA polymerase > M g
2+
> dNT Ps > template
DNA > primer. Conclusion T he pr esent react ion system could provide clear bands, abundant po lymor
phisms, and reliable react ion. It is proved to be suitable fo r molecular biolog y r esearch of D. nobi le.
Key words: Dendrobium nobile Lindl. ; sequencerelated amplified polymorphism ( SRAP) ; opt im iza
t ion; orthogonal design
相关序列扩增多态性 ( sequencerelated ampli
f ied polymorphism, SRA P) 是由美国加州大学蔬
菜作物系 Li与 Quiros 博士于 2001 年在芸薹属植
物中开发出来的 [ 1] , 又名基于序列扩增多态性 ( se
quencebased amplified polymorphism, SBAP) [ 2]。
SRAP 技术的基本原理是通过设计的引物对 ORFs
( open r eading frames) 进行扩增, 上游引物长 17
bp, 5 端的前 10 bp 是一段填充序列, 紧接着是
CCGG, 组成核心序列及 3 端 3个选择碱基,对外显
子进行特异扩增, 下游引物长 18 bp, 5 端的前 11
bp 是一段填充序列, 紧接着是 AAT T, 组成核心序
列及 3 端 3 个选择碱基, 对内含子区域、启动子区
域进行特异扩增, 因个体不同以及物种的内含子、启
动子与间隔区长度不等而产生多态性。SRAP 技术
具有简便、稳定、产率高和便于克隆目的片段的特
点。该标记在植物遗传多样性分析及种质资源鉴
定[ 3~ 6] 、遗传图谱构建 [ 7]、重要性状基因定位 [ 8]等方
面已经得到了广泛的应用。
1353中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 8 期 2010 年 8 月
* 收稿日期: 20091105 基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 30670199, 30770185, 30870180) ; 浙江省自然科学基金资助项目 ( X305692, X301406) ; 浙江省科技计划资助项目 ( 2008C12081) ; 杭州市重点实验室项目 ( 20080432T06) ; 钱江人才计划资助项目作者简介:赵红燕( 1985 ! ) ,女,河南平顶山人,主要从事植物遗传研究。Email: z haoh y1000@163. com
* 通讯作者 王慧中 Email : w hz62@ 163. com
金钗石斛 Dendr obium nobile Lindl. 又称石
斛、金钗、扁金钗、金斗、扁金斗、扁黄草, 为兰科
( Orchidaceae) 石斛属 Dendr obium Sw . 植物,始载
于∀神农本草经#,被列为上品, ∃主伤中、除痹、下气,
补五脏虚劳赢瘦, 强阴, 久服厚肠胃%。现代药理研
究表明,石斛还具有治疗眼病、抗衰老及免疫调节、
收缩肠管、抗肿瘤等功效[ 9] 。近年来,我国学者对金
钗石斛的生物学特性、药用价值、人工栽培、化学成
分、药理、毒理等方面进行了广泛的研究[ 10] ,而有关
遗传多样性等分子水平方面的研究甚少。本研究利
用正交试验设计,从模板 DNA、Mg 2+ 、dNT Ps、T aq
酶、引物 5种因素 5个水平, 对金钗石斛 SRAP 反
应体系进行优化分析,建立了多态性丰富、稳定性好
的金钗石斛 SRAP 反应体系,为进一步研究金钗石
斛的遗传多样性、开发利用这一珍稀药用资源提供
技术支持。
1 材料与方法
1 1 材料:金钗石斛采自云南思茅,由杭州师范大
学王慧中教授鉴定, 用于 SRAPPCR 反应的 T aq
酶 ( 2 U /L )、dNT Ps ( 10 mmol/ L )、Mg2+ ( 20
mmo l/ L )、10 & PCR buf fer ( 100 mmo l/ L Tris
HCl, 100 mmol/ L ( NH 4 ) 2SO4 , 100 mmol/ L KCl,
1% Tr iton X100, pH 8. 8) 订购于北京鼎国公司、
标准相对分子质量 ( M ar ker) DL2000 购自 T aKa
Ra 公司, SRAP 引物由上海生工合成。
1 2 总 DNA 的提取: DNA 提取采用改良的
CT AB 法。取 0 3 g 左右新鲜叶片,研磨至粉末状,
迅速转移至 1 5 mL 离心管中, 加入 1 mL 不含
CT AB 的抽提缓冲液 ( 200 mmol/ L Tr isHCl; 50
mmo l/ L EDT A; 250 mmol/ L NaCl; 2% 巯基乙
醇) ,混匀后冰上静止 15 min, 4 ∋ 、8 000 r/ min 离
心 10 min。去上清 (若上清比较黏稠, 则按上述方
法再次离心, 直到上清变清澈) 加入 500 L 预热
( 65 ∋ ) 的抽提缓冲液 ( 3% CT AB; 100 mmol/ L
TrisHCl; 25 mmol/ L EDT A; 1. 5 mol/ L NaCl;
1% 巯基乙醇) , 混匀后 65 ∋ 水浴 40 min 至 1 h。
冷却至室温,加入等体积的氯仿异戊醇 ( 24( 1) 轻
轻颠倒混匀 1~ 2 min,直至没有明显的分层。室温
静止 5 min, 4 ∋ 、10 000 r/ m in 离心 10 min。取上
清液至一新的离心管,用酚氯仿异戊醇 ( 25 (24 (
1) 重复抽提一次。取上清至另一新的离心管中, 加
入 0 5 倍体积的 5 mo l/ L NaCl, 2倍体积的无水乙
醇,轻微上下颠倒, 室温静止 20~ 30 min。取白色
沉淀至新的离心管中 (若沉淀物很少, 4 ∋ 、12 000
r/ min 离心 2 min 获得沉淀)。用 70% 乙醇洗涤 2
次,去乙醇,自然风干,用 500 L TE 缓冲液溶解。
加入 1 L 10 ng/ mL RN ase, 37 ∋ 水浴 10 m in,降
解 RNA。用等体积的苯酚氯仿异戊醇 ( 25( 24(
1) 抽提 1次,方法同上,最后将沉淀溶解于适量的
T E 缓冲液中。
提取的总 DNA , 采用 0 8% 的琼脂糖凝胶电
泳检测其纯度及完整性。用紫外分光光度计检测其
在 260 nm 的吸光度, 并将 DNA 浓度稀释到 20
ng/L 备用。
1 3 SRAPPCR 反应体系正交设计: 随机选用引
物组合 m8 ( T GAGT CCAAACCGGT GC ) / em10
( GACTGCGTACGAATT CAG) ,采用 L2 5 ( 56 )正交
表,选取影响反应体系的 5 个主要因素 ( M g2+ 、
dNTPs、引物、模板 DNA 和 T aq 酶) 在 5水平上进
行优化试验, 见表 1 (阴性对照中不加 T aq 酶)。反
应总体积为 25 L, 其中含 10 & PCR buffer 2. 5
L,不足部分双蒸水补足, 每个处理重复两次。
表 1 SRAPPCR 反应因素水平正交试验设计表 L25 ( 56 )
Table 1 L25( 56 ) Orthogonal design for factors
and levels of SRAPPCR reaction
试验号
M g2+ /
( mmol L- 1)
Taq酶/
( U 25L- 1)
dNTPs /
( mmol L- 1 )
引物/
( mol L- 1 )
模板 DNA/
( ng 25 L- 1 )
1 1 0 0 0 1 0 2 20
2 1 0 0 5 0 2 0 4 30
3 1 0 1 0 0 3 0 6 40
4 1 0 1 5 0 4 0 8 50
5 1 0 2 0 0 5 1 0 60
6 1 5 0 0 3 0 8 60
7 1 5 0 5 0 4 1 0 20
8 1 5 1 0 0 5 0 2 30
9 1 5 1 5 0 1 0 4 40
10 1 5 2 0 0 2 0 6 50
11 2 0 0 0 5 0 4 50
12 2 0 0 5 0 1 0 6 60
13 2 0 1 0 0 2 0 8 20
14 2 0 1 5 0 3 1 0 30
15 2 0 2 0 0 4 0 2 40
16 2 5 0 0 2 1 0 40
17 2 5 0 5 0 3 0 2 50
18 2 5 1 0 0 4 0 4 60
19 2 5 1 5 0 5 0 6 20
20 2 5 2 0 0 1 0 8 30
21 3 0 0 0 4 0 6 30
22 3 0 0 5 0 5 0 8 40
23 3 0 1 0 0 1 1 0 50
24 3 0 1 5 0 2 0 2 60
25 3 0 2 0 0 3 0 4 20
1 4 SRAPPCR 扩增及检测: 反应程序为 94 ∋
预变性 5 min; 94 ∋ 变性 1 m in、35 ∋ 复性 1 min、
72 ∋ 延伸 1 m in,共 5个循环; 随后 35 个循环为:
1354 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 8 期 2010 年 8 月
94 ∋ 变性 1 min, 50 ∋ 复性 1 min, 72 ∋ 延伸 1
min; 最后 72 ∋ 延伸 7 m in, 4 ∋ 保存。扩增产物
加 1~ 2 L 6 & loading buf fer ( 40% 蔗糖, 0 25%
溴酚蓝, 0 25% 二甲苯青 FF) 混匀后, 取 8 L 用
于 6% 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,电泳缓冲
液为 1 & T BE。200 V 电压电泳约 2 h, 二甲苯青
FF 至胶板 2/ 3 处,银染拍照。
15 SRAP 最佳反应体系的验证:随机选用引物对
组合 m8 ( TGAGTCCAAACCGGT GC) / em11 ( GAC
TGCGT ACGAA TT CCA ) 和 m2 ( TGAGTCCA
AACCGGAGC) / em1 ( GACT GCGTACGAAT TA
A T) ,采用 8个不同地域来源的金钗石斛居群,对优
化建立的金钗石斛 SRAPPCR 反应体系及反应参
数的稳定性进行验证。
2 结果与分析
2 1 金钗石斛基因组 DNA 的提取: 利用改良
CT AB 方法提取金钗石斛基因组 DNA, 紫外分光
光度计检测,其纯度和产量均较高。琼脂糖凝胶电
泳检测 DNA 条带清晰且没有降解, 说明提取的
DNA 质量高, 完整性好, 可用于 SRA PPCR 反应
(图 1)。
图 1 改良 CTAB 法提取 DNA 电泳结果
Fig. 1 Electrophoretogram of DNA with modified CTAB
2 2 电泳结果评分:按表 1设计的 25个处理进行
PCR 试验,电泳检测结果如图 2 所示, 根据电泳条
带的多少、清晰度及背景颜色进行打分 ( 0~ 5分)。
对两次重复分别单独进行统计,得分依次为: 0, 0, 0,
0, 0, 0, 0, 1, 2, 3, 0, 4, 5, 4, 1, 0, 2, 4, 2, 3, 0, 2, 3, 3, 3;
0, 1, 1, 0, 1, 0, 2, 1, 2, 3, 0, 4, 5, 4, 2, 0, 2, 4, 3, 3, 0, 3,
3, 2, 3。从两次重复的得分来看, 结果的一致性较
好。取两次得分的平均值, 在假设不存在交互作用
的情况下进行直观分析, 求各列各水平的和 T 1、
T 2、T 3、T 4、T 5 ;由于各列各水平均重复了 5次,故可
求出各水平的均值 K 1、K 2、K 3、K 4、K 5 ;用各列最大
平均值减去最小平均值得各列的极值 R。显然 R
越大,说明该因素对指标影响越大。分析极差 R 可
知, T aq 酶的量对反应结果影响最大,引物浓度影响
最小, 各因素水平的变化对 PCR 反应的影响从大
到小依次为: T aq 酶、Mg2+ 、dNT Ps、模板 DNA、引
物 (表 2)。
1~ 25处理代号见表 1 MDL 2000
1 ! 25t reatment n umber and t reatment as show ed in Table 1
MDL 2000 Marker
图 2 SRAPPCR 正交试验电泳结果图
Fig. 2 Electrophoretogram of SRAPPCR orthogonal design
表 2 SRAPPCR 反应各因素间极差分析表
Table 2 Analysis for factors of SRAPPCR reaction
水平 M g2+ T aq酶 dN TP s 引物 模板 DNA
T 1 1 5 0 11 5 7 11 5
T 2 7 10 12 9 5 8 5
T 3 14 5 13 5 9 5 10 6 5
T 4 11 5 11 9 5 10 8
T 5 11 11 6 5 8 11
K 1 0 3 0 2 3 1 4 2 3
K 2 1 4 2 2 4 1 9 1 7
K 3 2 9 2 7 1 9 2 1 3
K 4 2 3 2 2 1 9 2 1 6
K 5 2 2 2 2 1 3 1 6 2 2
R 2 6 2 7 1 1 0 6 1
2 3 T aq 酶浓度对 PCR 结果的影响:由关系曲线
的波动幅度可知, T aq 酶浓度对 PCR 结果的影响
较大。Taq 酶浓度过低, PCR 产物信号弱, 背景浅,
浓度过高时, 产生大量的杂带, 并且背景较深,不利
于遗传多样性的分析。从图 3可知, 1 0 U 为 Taq
酶最佳反应水平。
图 3 Taq 酶量与结果均值的关系图
Fig. 3 Relationship between quantity of Taq DNA
polymerase and mean of result
2 4 Mg2+ 浓度对 PCR 结果的影响: M g2+ 对 PCR
扩增的特异性和产量有显著的影响, 浓度过高, 反应
特异性降低, 出现非特异性扩增, 浓度过低会降低
1355中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 8 期 2010 年 8 月
Taq DNA 聚合酶的活性,使反应产物减少。从图 4
可知, 2 0 mmol/ L 为 Mg2+ 浓度最佳反应水平。
图 4 Mg2+ 浓度与结果均值的关系图
Fig. 4 Relationship between quantity of Mg2+
concentration and mean of result
2 5 dNT Ps 浓度对 PCR 结果的影响:如图 5所示
dNT Ps 浓度在 0 1~ 0 4 mmol/ L 无明显差异, 但
与 0 5 mmol/ L 差异显著。0 5 mmol/ L 浓度过高,
错误掺入率大大增加, 且 dNTPs 能与 Mg 2+ 结合,
使游离的 Mg2+ 浓度降低, 降低 PCR 扩增效果, 浓
度过低时, 降低 PCR 产物的产量, 导致无扩增产物
或扩增产物不稳定或扩增出来的条带模糊不清。因
此,选择峰值 0 2 mmol/ L 为反应的最佳水平。
图 5 dNTPs 浓度与结果均值的关系图
Fig. 5 Relationship between quantity of dNTPs
concentration and mean of result
2 6 模板 DNA 浓度对 PCR 结果的影响:如图 6,
模板 DNA 在 20 ng/ 25 L 与 60 ng / 25 L 时均达
到理想的扩增效果。但为降低 TE 缓冲液中
EDTA 对反应中 Mg2+ 的不良影响程度, 在保证扩
增效果的前提下, 应尽量降低模板 DNA 的用量。
因此,最终选定 20 ng/ 25 L 作为最佳反应水平。
2 7 引物浓度对 PCR 结果的影响:由关系曲线的
波动幅度可知, 引物在本研究所选梯度范围内对
PCR反应结果影响较小,但是引物浓度变化对 PCR
产物电泳信号强弱的影响有关,浓度增加信号增强,
同时浓度过大导致条带背景的加深,影响了多态性
的鉴别分析。可能由于试验材料的不同以及反应各
因素的综合作用等原因而使得本研究结论有所不
同,在 0 6 mo l/ L 与 0 8 mo l/ L 水平均达到了反
图 6 模板 DNA 浓度与结果均值的关系图
Fig. 6 Relationship between quantity of DNA template
concentration and mean of result
应体系的最佳效果, 从经济角度考虑选择 0 6
mo l/ L 为最佳反应水平。结果见图 7。
图 7 引物浓度与结果均值的关系图
Fig. 7 Relationship between quantity of primer
concentration and mean of result
2 8 体系稳定性检测: 采用优化所建立的反应体
系,引物对组合 m8/ em11 和 m2/ em1 对 8个不同
来源地的金钗石斛居群进行 SRAPPCR扩增, 均能
扩增出清晰谱带, 而且不同个体间存在一定的差异
(图8和图9) , 这说明优化的金钗石斛SRA PPCR
图 8 引物对组合 m8/ em11 的检测结果
Fig. 8 Testing result of primer pair m8/ em11
1356 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 8 期 2010 年 8 月
图 9 引物对组合 m2/ em1 的检测结果
Fig. 9 Testing result of primer pair m2/ em1
反应体系是可行的, 可用于金钗石斛遗传多样性分
析、遗传连锁图谱构建、分子标记辅助育种等分子生
物学的研究。
3 讨论
金钗石斛叶片中含有大量的多糖物质, 多糖易
与 DNA 形成黏稠的胶状物, 给 DNA 的分离和纯
化带来困难,从而影响 PCR 扩增反应,因此选择适
宜的 DNA 提取法非常重要。CTAB 法是最为常用
的植物 DNA 提取方法,经过改良, 以满足不同植物
和不同实验的要求。实验采用改良的 CTAB 法对
金钗石斛 DNA 进行提取,从电泳检测结果来看, 得
到的 DNA 质量较高,可用于后期研究。
传统的体系优化方法一般采用单因素试验, 不
仅试验处理繁多,而且会忽视因素间的互作效应, 而
本研究所采用的正交试验设计具有均衡分散、综合
可比及可伸可缩、效应明确的特性,可了解各因素之
间的内在规律, 较快地找到最优的水平组合, 使实验
结果更科学、完善和简便 [ 11]。试验中各因素间及因
素内水平间的相关性分析结合图表,其规律变化一
目了然,具有一定的客观准确性。但该方法也存在
一定的局限性, 如对实验结果本身优劣的判断依据
带有主观上的成分, 不能很好地估计试验误差,说明
各个实验条件之间的互作等。如果能够对 PCR 扩
增条件及结果建立客观的标准, 无疑将极大地促进
PCR 技术的发展。
樊洪泓等[ 12] 采用单因素试验, 以霍山石斛总
DNA 为模板, 对石斛属 SRAP 反应体系的重要参
数进行优化。王燕燕等 [ 13]采用单因素试验, 优化了
金钗石斛 RAPDPCR 反应体系。目前有关采用正
交设计法优化金钗石斛 SRAP 反应体系的研究还
未见报道。本研究通过对影响金钗石斛 SRAP 反
应的各因子进行正交设计试验, 最终确定的适合于
金钗石斛的 SRAP 体系, 在模板 DNA、Mg2+ 以及
引物浓度上与樊洪泓等[ 12] 对石斛属研究中的用量
有一定差别, 从电泳分析的结果上看,本研究所建立
的体系 PCR 扩增效果更理想, 而且节省了实验的
成本。同时, 本研究结果与樊洪泓等[ 12] 研究结果相
比,也客观地体现了正交设计试验的优越性。
SRAP 分子标记技术基于 PCR 反应, 试验材料
及反应体系中各影响因子浓度的不同都会对反应结
果产生影响。本研究结果证明, 采用不同的体系组
合对金钗石斛的 SRAPPCR 扩增效果影响很大。
综合考虑各种因素, 本研究最终建立的金钗石斛
SRAP 反应最佳体系为:在 25 L 反应体系中含有
20 ng 模板 DNA, 2 0 mmo l/ L Mg 2+ , 0. 2 mmo l/ L
dNTPs, 1 U T aq DNA 聚合酶, 0 6 mo l/ L 引物。
同时,本研究对得到的最佳反应体系进行了验证,采
用不同的引物组合、在不同来源地的金钗石斛居群之
间均得到了清晰、重复性好的条带,这也表明所建立
的体系在金钗石斛中具有一般的通用性,为今后金钗
石斛遗传连锁图谱构建、遗传多样性分析、分子标记
辅助育种等分子生物学研究奠定了良好的基础。
参考文献:
[ 1] Li G, Quiros C F S equen cerelated am plif ied polym orphism
( SRAP) , a new mark er system b ased on a simple PCR reac
ti on : it s applicat ion to mapping an d g ene tagging in B rassic a
[ J] Th eor Ap p l G enet , 2001, 103: 455461
[ 2] Ferriol M , Pico M B, Nuez F Genet ic divers ity of some ac
cessions of Cu curbi ta max ima from Spain using RAPD and
SBAP m ark ers [ J] G enet Resource s Crop Evolut , 2003, 50:
227238
[ 3] Budak H , Shearm an R C Molecular characterizat ion of Buf
falograss germplasm using sequ ence related am pl ifi ed poly
morphism m ark ers [ J] T heor A p p le Gene t , 2004, 108: 328
334
[ 4] Ding G, Zhang D Z, Ding X Y, e t al . Genet ic variat ion an d
conservation of the endan gered C hinese endemic herb Den
d robium of f ic inale b ased on SRAP an alys is [ J] P lant S yst
E vol , 2008, 276: 149156
[ 5] 陈大霞, 李隆云, 瞿显友, 等 栽培黄连群体遗传关系的
SRAP 分析 [ J] 中草药, 2008, 39( 10) : 15521556
[ 6] 郭庆华, 郭美丽, 薛 芊, 等 青葙 SRAP 体系的建立和优
化 [ J ] 中草药, 2008, 39( 2) : 263266
[ 7] Lin Z X, Zhang Y X, Zhan g X L, et al . A highden sity inte
grat ive lin kag e map for Gossyp ium hi rsutum [ J] E up hyt ic a,
2009, 166: 3545
[ 8] Rahman M, McVet ty P B E , Li G Y Development of
1357中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 8 期 2010 年 8 月
SRAP, SNP and mult iplexed SCAR molecular m ark ers for
th e m ajor seed coat color gen e in Br assica r apa L. [ J]
T heor A p p l Gene t , 2007, 115: 11011107
[ 9] 陈晓梅, 郭顺星 石斛属植物化学成分和药理作用的研究进
展 [ J] 天然产物研究与开发, 2001, 13( 1) : 7075
[ 10] 郑晓珂, 曹新伟, 冯卫生, 等 金钗石斛的研究进展 [ J ] 中
国新药杂志, 2005, 14( 7) : 836839
[ 11] 杨水云, 李续娥, 吴明宇, 等 正交实验法在 PCR 反应条件
优化中的应用 [ J] 生物数学学报, 2005, 20( 2) : 202206
[ 12] 樊洪泓, 李廷春, 邱 婧, 等 石斛属植物 SRAP 反应体系
的建立与优化 [ J] 分子植物育种, 2006, 4( 6) : 153156
[ 13] 王燕燕, 徐 红, 魏丹红, 等 金钗石斛遗传多样性研究的
随机扩增多态性 DNAPCR 反应体系的建立与优化 [ J ] 时
珍国医国药, 2008, 19( 12) : 28272830
黄花蒿悬浮培养细胞对二氢青蒿酸的生物转化研究
唐 煜,朱建华,于荣敏*
(暨南大学药学院, 广东 广州 510632)
摘 要:目的 采用黄花蒿悬浮培养细胞研究二氢青蒿酸 ( ) )的生物转化。方法 向预培养 14 d 的黄花蒿细胞
悬浮培养体系中加入底物二氢青蒿酸,培养 2 d 后终止转化。通过 TLC 和 H PLC 检测转化产物,利用硅胶、Seph
adex LH20 以及 ODS 柱色谱分离纯化转化产物, 并根据理化数据和波谱技术鉴定转化产物的化学结构, 最后利用
HPLC 考察共培养时间对转化率的影响。结果 二氢青蒿酸在黄花蒿培养体系中成功地进行了转化并分离得到
两个转化产物: 3 羟基二氢青蒿酸( ∗a)和 3羟基二氢青蒿酸( ∗b)。两个转化产物的最佳共培养时间均为 1
d,总的摩尔转化率分别为 2 6% ( ∗a) 和 15 7% ( ∗b)。结论 本研究首次利用黄花蒿培养细胞生物转化二氢
青蒿酸,且得到一对区域特异性的羟基化转化产物。
关键词:黄花蒿; 悬浮培养细胞; 二氢青蒿酸; 生物转化
中图分类号: R284 1 文献标识码: A 文章编号: 02532670( 2010) 08135804
Biotransformation of dihydroartemisinic acid by suspension culture cell of Artemisia annua
TANG Yu, ZHU Jianhua, YU Rongmin
( Colleg e of Pharmacy, Jinan Univer sity, Guang zhou 510632, China)
Abstract: Objective T o invest igate the bio t ransformation of dihydro ar temisinc acid ( ) ) by cultur ed
cells of A r tem isia annua. Methods Dihydroartem isinic acid w as added to the suspension cells of A . annua
which had been precultured for 14 d and cocultur ed for another 2 d. T he bio tr ansf romed products w ere
detected w ith TLC and HPLC, and iso lated by various chromato graphic methods. Results The chem ical
st ructures o f biot ransformed products w ere elucidated on the basis of spect roscopic data. 3 Hydroxydi
hydroartemisinic acid ( ∗a) and 3hydr oxydihydroartemisinic acid ( ∗b) w er e obtained after 2 d adminis
t rat ion of dihydro ar temisinic acid to the suspension cells of A . annua. ∗a and ∗ b yields could reach a
maxium mole r at io of 2. 6% and 15. 7% af ter 1 d incubation, respect ivly. Conclusion It is the f irst t ime
for the biot ransformat ion of dihydroartem isinic acid to epimer ic 3hydro xyar temisinic acid by using suspen
sion culture cell of A . annua. T he results indicate that cells of A. annua have the ability to hydroxy late
dihydr oartem isinic acid region select iv ely .
Key words: A rtemisia annua L. ; suspension cultur e cell; dihydroartem isinic acid; biot ransfo rmat ion
生物转化是利用生物活性的酶体系对外源性底
物进行结构修饰的一种生物学方法 [ 12]。它作为化
学修饰的重要补充, 在活性分子或药物分子结构修
饰方面, 具有独特的优势, 已经得到了广泛的应
用[ 36]。天然产物的结构通常比较复杂,分子中多含
有手性中心,采用化学方法对其进行结构修饰常会
遇到很多困难。而利用生物转化反应, 由于其具有
区域专一性和立体选择性等特点, 则有可能获得具
有新颖取代方式的衍生物[ 7] 。
黄花蒿 A rtemisia annua L. 是菊科艾属植物,
含有多种药用活性成分,如青蒿素等是传统中药治
疗疟疾的主要有效药物 [ 8]。然而由于青蒿素在黄花
1358 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 8 期 2010 年 8 月
* 收稿日期: 20091218 作者简介:唐 煜( 1984 ! ) ,男,湖南永州人,硕士,研究方向为活性成分的生物转化与生物合成。
* 通讯作者 于荣敏 T el: ( 020) 85220386 Email: tyrm@ jnu. edu. cn