全 文 ：SRAP, SNP and mult iplexed SCAR molecular m ark ers for
th e m ajor seed coat color gen e in Br assica r apa L. [ J]

T heor A p p l Gene t , 2007, 115: 1101-1107

[ 9]
陈晓梅, 郭顺星
石斛属植物化学成分和药理作用的研究进
展 [ J]
天然产物研究与开发, 2001, 13( 1) : 70- 75

[ 10]
郑晓珂, 曹新伟, 冯卫生, 等
金钗石斛的研究进展 [ J ]
中
国新药杂志, 2005, 14( 7) : 836-839

[ 11]
杨水云, 李续娥, 吴明宇, 等
正交实验法在 PCR 反应条件
优化中的应用 [ J]
生物数学学报, 2005, 20( 2) : 202-206

[ 12]
樊洪泓, 李廷春, 邱
婧, 等
石斛属植物 SRAP 反应体系
的建立与优化 [ J]
分子植物育种, 2006, 4( 6) : 153-156

[ 13]
王燕燕, 徐
红, 魏丹红, 等
金钗石斛遗传多样性研究的
随机扩增多态性 DNA-PCR 反应体系的建立与优化 [ J ]
时
珍国医国药, 2008, 19( 12) : 2827- 2830

黄花蒿悬浮培养细胞对二氢青蒿酸的生物转化研究
唐
煜,朱建华,于荣敏*
(暨南大学药学院, 广东 广州
510632)
摘
要:目的
采用黄花蒿悬浮培养细胞研究二氢青蒿酸 (
)的生物转化。方法
向预培养 14 d 的黄花蒿细胞
悬浮培养体系中加入底物二氢青蒿酸,培养 2 d 后终止转化。通过 TLC 和 H PLC 检测转化产物,利用硅胶、Seph-
adex LH-20 以及 ODS 柱色谱分离纯化转化产物, 并根据理化数据和波谱技术鉴定转化产物的化学结构, 最后利用
HPLC 考察共培养时间对转化率的影响。结果
二氢青蒿酸在黄花蒿培养体系中成功地进行了转化并分离得到
两个转化产物: 3-
-羟基二氢青蒿酸(
a)和 3-
-羟基二氢青蒿酸(
b)。两个转化产物的最佳共培养时间均为 1
d,总的摩尔转化率分别为 2
6% (
a) 和 15
7% (
b)。结论
本研究首次利用黄花蒿培养细胞生物转化二氢
青蒿酸,且得到一对区域特异性的羟基化转化产物。
关键词:黄花蒿; 悬浮培养细胞; 二氢青蒿酸; 生物转化
中图分类号: R284
1


文献标识码: A


文章编号: 0253-2670( 2010) 08-1358-04
Biotransformation of dihydroartemisinic acid by suspension culture cell of Artemisia annua
TANG Yu, ZHU Jian-hua, YU Rong-min
( Colleg e of Pharmacy, Jinan Univer sity, Guang zhou 510632, China)
Abstract: Objective
T o invest igate the bio t ransformation of dihydro ar temisinc acid (
) by cultur ed
cells of A r tem isia annua. Methods
Dihydroartem isinic acid w as added to the suspension cells of A . annua
which had been pre-cultured for 14 d and co-cultur ed for another 2 d. T he bio tr ansf romed products w ere
detected w ith TLC and HPLC, and iso lated by various chromato graphic methods. Results
The chem ical
st ructures o f biot ransformed products w ere elucidated on the basis of spect roscopic data. 3-
-Hydroxy-d-i
hydroartemisinic acid (
a) and 3-
-hydr oxy-dihydroartemisinic acid (
b) w er e obtained after 2 d adminis-
trat ion of dihydro ar temisinic acid to the suspension cells of A . annua.
a and
b yields could reach a
maxium mole r at io of 2. 6% and 15. 7% af ter 1 d incubation, respect ivly. Conclusion
It is the f irst t ime
for the biot ransformat ion of dihydroartem isinic acid to epimer ic 3-hydro xyar temisinic acid by using suspen-
sion culture cell of A . annua. T he results indicate that cells of A. annua have the ability to hydroxy late
dihydr oartem isinic acid region select iv ely .
Key words: A rtemisia annua L. ; suspension cultur e cell; dihydroartem isinic acid; biot ransfo rmat ion


生物转化是利用生物活性的酶体系对外源性底
物进行结构修饰的一种生物学方法 [ 1-2]。它作为化
学修饰的重要补充, 在活性分子或药物分子结构修
饰方面, 具有独特的优势, 已经得到了广泛的应
用[ 3-6]。天然产物的结构通常比较复杂,分子中多含
有手性中心,采用化学方法对其进行结构修饰常会
遇到很多困难。而利用生物转化反应, 由于其具有
区域专一性和立体选择性等特点, 则有可能获得具
有新颖取代方式的衍生物[ 7] 。
黄花蒿 A rtemisia annua L. 是菊科艾属植物,
含有多种药用活性成分,如青蒿素等是传统中药治
疗疟疾的主要有效药物 [ 8]。然而由于青蒿素在黄花

1358
中草药
Chinese Traditional and Herbal Drugs
第 41 卷第 8 期 2010 年 8 月
* 收稿日期: 2009- 12-18





















作者简介:唐
煜( 1984
) ,男,湖南永州人,硕士,研究方向为活性成分的生物转化与生物合成。
* 通讯作者
于荣敏
T el: ( 020) 85220386
E-mail: tyrm@ jnu. edu. cn
蒿植物中的量很低 [ 9] 以及化学合成非常复杂 [ 10] 等
不利因素而严重制约了青蒿素以及青蒿素类衍生物
的开发及其应用。二氢青蒿酸是青蒿素生物合成的
前体[ 11] ,在植物体内的量比青蒿素高[ 12] 。因此, 利
用二氢青蒿酸作为底物, 采用生物转化的方法来得
到青蒿素类衍生物具有重大创新意义, 目前还未见
相关报道。Kaw amoto 等 [ 7]利用黄花蒿悬浮培养细
胞对二氢青蒿酸的 11, 13 脱氢同系物青蒿酸进行
了生物转化研究, 分离并鉴定了 3 个糖基化产物。
本实验利用黄花蒿悬浮培养细胞对二氢青蒿酸进行
生物转化研究, 旨在为尚未完全阐明的青蒿素类衍
生物的生物合成途径研究提供新方法和新思路; 同
时,亦期望对化学合成青蒿素类衍生物研究起到一
定的指导作用。
1
材料与试剂
1
1
仪器与试剂: ESI-M S 用 Bruker esquir e 2000
mass spect rometer 测定; NMR 用 Bruker AV2400
( 400 MHz fo r
1
H, 100 MHz for
1 3
C-NMR spec-
trometer 测定 ( TM S 为内标) ; 柱色谱硅胶采用青
岛化工厂硅胶; T LC 用青岛化工厂生产的硅胶 H
预制薄板和 Merck H P RP-8F254 预制薄板; ODS
购自日本 YMC 公司; Sephadex LH-20 购自 Phar-
macia Co.。HPLC 分析采用安捷伦 1200 系统; 色
谱柱为安捷伦 Hypersiol ODS 柱。
1
2
底物:二氢青蒿酸, 由本研究组从黄花蒿叶中
分离得到, 经 HPLC 验证其质量分数> 95%。使用
前用无水乙醇配成 50 mg / mL 的溶液。
1
3
培养体系:以黄花蒿的嫩茎和嫩叶为外植体,
诱导愈伤组织[ 14] 。将经过多次继代培养的愈伤组
织接种于装有 200 mL 含 1
0 mg/ L 6-苄氨基腺嘌
呤 ( 6-BA) 和 0
5 mg/ L 2, 4-二氯苯氧乙酸 ( 2, 4-
D) 及 3% 蔗糖的 MS 培养基的 500 mL 三角瓶中,
25
振荡暗培养,摇床转速为 110 r/ min。每 25 d
继代 1次, 每瓶接种黄花蒿细胞鲜质量 10 g。
2
实验方法
2
1
生物转化方法:向 3瓶预培养 14 d 的黄花蒿
悬浮培养细胞中分别加入 50 mg/ mL 的底物 (
)
乙醇溶液 0
1 mL,迅速摇匀。同样条件下继续培养
2 d。另取 3瓶培养物, 每瓶加入相同体积的无水乙
醇 (不含底物) 作为空白对照。
2
2
转化产物的检测: 培养结束后将培养液滤过,
获得的培养基用等体积的醋酸乙酯萃取 4 次, 合并
醋酸乙酯萃取液减压浓缩至干, 浸膏用少量甲醇溶
解,待检; 培养物则于 55
条件下烘干至恒重, 乳
钵研细, 然后用 10 倍 (质量体积比) 的甲醇于室温
下浸置 12 h, 再反复超声提取 3 次, 每次 30 min。
合并甲醇提取液, 减压蒸干后所得残渣用蒸馏水混
悬。最后再用等体积的醋酸乙酯萃取 3 次, 合并醋
酸乙酯萃取液浓缩至干。同样, 浸膏用少量甲醇溶
解,待用。将底物标准品、培养基和培养物的提取物
(样品及对照) ,一起点于硅胶 G 板上, 以石油醚-醋
酸乙酯 ( 1
1) 展开, 1% 香草醛-浓硫酸显色。
2
3
转化产物的分离纯化:向预培养 14 d 的黄花
蒿细胞培养体系中加入底物 (
) 300 mg, 继续培
养 2 d 后对其培养物和培养基分别进行处理,获得
的醋酸乙酯层萃取液浓缩至干, 得浸膏。将浸膏用
硅胶柱色谱分离, 石油醚-醋酸乙酯梯度洗脱。初步
分离得到的转化产物再反复上 Sephadex LH-20 凝
胶柱和 ODS 反相柱,分别得到油状物
a和针状结
晶
b。
2
4
共培养时间对产物转化率的影响:严格控制接
种量,向 18瓶预培养了 14 d 的黄花蒿悬浮培养细
胞培养瓶中每瓶分别加入 50 mg/ mL 底物甲醇溶
液 0
1 mL 进行共培养。分别在共培养 1、2、3、4、5、
6 d后取出 3瓶终止转化。抽滤,分获培养物和培养
基,处理方法同 2
2。得到的浸膏用甲醇定容至 5
mL,经 0
45
m 微孔滤膜过滤后用于 HPLC 检测分
析。HPLC 检测条件:流动相为甲醇 ( A)-水 ( B) ;洗
脱条件: 0~ 5 min, 60%~ 70% A; 5~ 10 min, 70%~
80% A; 10~ 15min, 80% ~ 90% A; 体积流量 0
8
mL/ min;柱温 30
;检测波长 210 nm。
3
结果
3
1
转化产物的 HPLC 检测:比较对照组和底物
组的 HPLC 色谱图 (图 1) ,在底物组的醋酸乙酯层
中存在 2个新色谱峰, 结合 TLC 结果可知二氢青
蒿酸在黄花蒿悬浮细胞中发生了生物转化反应。
3
2
转化产物的结构鉴定:转化产物
a 为无色油
状物, ESI-MS m/ z : 275 [ M + N a] + 峰, ESI-M S
m/ z : 251 [ M - H ]
+ 峰, 因此推断
a的相对分子质
量为 252,比底物(
)多了 16,推测可能为底物(
)
的羟基化产物。
a 的碳谱与
比较, 其明显的区
别为转化产物
a 的 C-15 信号峰向高场移动了
4
5 (
23
7~ 19
2) ,且另一信号则显著向低场移动
(
26
6~ 66
9)。
a 的
C-15 向高场移动可能是
由于底物
a 的 C-3 位发生了羟基化而产生的
效
应所引起的。为了鉴定
a 羟基的构型,对其进行
了 NOESY 测定。NOESY 谱显示, H-3 (
4
07) 和
H-10 (
1
41) , H-3和 Me-15 (
1. 75) , H-3和 H-2


1359
中草药
Chinese Traditional and Herbal Drugs
第 41 卷第 8 期 2010 年 8 月
A-底物组醋酸乙酯层溶液
B-底物溶液
C-空白组醋酸乙酯层溶液
A-EtOAc ext ract of ex perimental cultures
B-dihydroartemisinic acid
C-E tOAc ext ract of cont rol cu ltures
图 1
二氢青蒿酸(
)在黄蒿悬浮细胞中生物转化的
HPLC 图谱
Fig. 1
HPLCChromatograms of dihydroartemisinic
acid (
) biotransformed by cell suspension
cultured of A. annua
(
2
33) , H-2
(
1
58) 相关,且 H-3 和 H-2
相关
的点比 H-3 和 H-2
相关的点大很多, 因此,
a 被
确定为 3-
-羟基二氢青蒿酸。化合物
a: ESI-MS
m/ z 251 [ M - H ] + , 275 [ M + Na] + 。1 H-NMR
( 400 MHz, acetone-d6 )
: 0
93 ( 4H , d superim-
posed on m, J = 6. 0 Hz) , 1
14 ( 3H , d, J = 6
8
Hz) , 1
75 ( 3H , s, 15-CH 3 ) , 2
60 ( 1H , br s) , 4
07
( 1H , m ) , 5. 29 ( 1H , s) ; 13 C-NMR ( 100 MHz, ace-
tone-d6 )
: 41
8 ( C-1) , 35
2 ( C-2) , 66
9 ( C-3) ,
138
8 ( C-4) , 121
6 ( C-5) , 36
8 ( C-6) , 44
5 ( C-
7) , 27
3 ( C-8) , 36
4 ( C-9) , 28
3 ( C-10) , 43
6 ( C-
11) , 177
2 ( C-12) , 14
6 ( C-13) , 19
1 ( C-14) , 19
2
( C-15)。
转化产物
b与转化产物
a具有相同的相对
分子质量,
b与
a 的氢谱、碳谱相比, 发现两者非
常相似。
b 与
a 碳谱最大的区别在于 C14 和
C15的
不同。
a 的 C-14 和 C-15 的
分别为
19
1 和 19
2,而
b 的 C-14 和 C-15 的
则分别
为 20
6 和 21
2。
b 的氢谱、碳谱数据与文献对
照基本一致 [ 15] ,故将
b 鉴定为 3-
-羟基二氢青蒿
酸。化合物
b: 无色针晶; ESI-M S m/ z 251 [ M -
H ]
+
, 275 [ M + Na]
+
;
1
H-NMR ( 400 MHz, ace-
tone-d6 )
: 0
92 ( 4H , d superimposed on m , J =
6. 4 Hz) , 1. 13 ( 3H , d, J = 7. 2 Hz) , 1. 78 ( 3H , s) ,
2. 27 1H , dd, J= 14. 2, 2. 2 Hz, H-2) , 3. 96 ( 1H , d,
J= 5. 3 H z, H-3a) , 5. 33 ( 1H , s) ; 13 C-NMR ( 100
MHz, acetone-d6 )
: 42. 3 ( C-1) , 35. 7 ( C-2) , 67. 4
( C-3) , 139. 2 ( C-4) , 122. 8 ( C-5) , 38. 0 ( C-6) , 44. 6
( C-7) , 28. 4 ( C-8) , 36. 7 ( C-9) , 29. 4 ( C-10) , 42. 5
( C-11) , 176. 5 ( C-12) , 15. 5 ( C-13) , 20. 6 ( C-14) ,
21. 2 ( C-15)。
3
3
转化产物的时效 ( T-C ) 曲线: 从图 2可以看
出,转化产物
a 与
b均在投入底物(
) 1 d 后转
化率达最高, 分别为 2
6% 及 15
7%。之后其量均
随着时间的延长而降低。
图 2
共培养时间对转化产物在黄花蒿体系中量的影响
Fig. 2
Time-course experiments in biotransformation
of dihydroartemisinic acid with cell supension
culture of A. annua
4
讨论


在底物分子结构中的不同位置, 区域性的引入
氧化基团 (主要是羟基) 是植物体系生物转化的一
个重要特点。本实验首次利用药用植物黄花蒿悬浮
培养细胞作为生物转化体系对外源性底物二氢青蒿
酸进行转化研究, 分离并鉴定了 2个互为差向异构
体的羟基化转化产物 (图 3) , 提示我们二氢青蒿酸
能诱发并激活黄花蒿细胞内的可进行 3位羟基化的
酶系统, 从而进一步发生酶催化反应。从转化产物
的时效曲线 (图 2) 可以初步推断,在投入底物二氢
青蒿酸第 1 天时黄花蒿细胞体内的特异性酶活性
表达最强,此时
a 和
b 的转化率达到最高。
图 3
黄花蒿悬浮培养细胞对二氢青蒿酸的生物转化
Fig. 3
Biotransformation of dihydroartemisinic acid
by cell suspension culture of A. annua
此外,从图 2还可以看出: 2个转化产物的量在
第一天达到最高后迅速下降,可以推测转化产物
a
和
b在后期可能会继续发生转化反应, 生成新的
转化产物。目前, 此实验工作还在进一步研究中。
另据报道 [ 13] ,黄花蒿悬浮培养细胞能在青蒿酸
3位及 9位进行羟基化, 而本研究未检测到 9-羟基

1360
中草药
Chinese Traditional and Herbal Drugs
第 41 卷第 8 期 2010 年 8 月
二氢青蒿酸的生成。因此,我们初步推测,黄花蒿悬
浮培养细胞对倍半萜类外源底物进行羟基化时可能
具有底物选择性。
参考文献:
[ 1]
Loug hlin W A
Biot ransformation in organ ic synthesis [ J]

B iore sour ce T echnol , 2000, 74: 49-62

[ 2]
杨世海, 刘家源, 于
博, 等
掌叶大黄细胞悬浮系统和根
培养系统对鬼臼毒素的生物转化研究 [ J ]
中草药, 2008,
39( 5) : 763-766

[ 3]
韩斌青, 冯
冰, 马百平
皂苷的生物转化研究进展 [ J]
中
草药, 2009, 40( 10) : 1664-1668

[ 4]
崔玉娜, 张怡轩, 赵余庆
利用生物转化制备稀有人参皂苷
的研究进展 [ J]
中草药, 2009, 40( 5) : 676- 680

[ 5]
王
宇, 戴传超
内生真菌对生物活性物质代谢转化作用的
研究进展 [ J]
中草药, 2009, 40( 9) : 1496- 1499

[ 6]
Dong H J, J iang B H, H an Y, et al . Transformat ion of com-
pound K from saponin s in leaves of P anax notoginseng b y im-
mobil ized
-glu can as e [ J]
Chin H er b Med , 2010, 2( 1) : 41-
47

[ 7]
Riva S
Biocatalytic m odi ficat ion of natural p rodu cts [ J]

Cu rr Opin Chem Biol , 2001, 5: 106-111

[ 8]
Liu C X, Xiao P G, Pen g Y, e t al . Challenges in research
an d developm ent of t radit ional Chines e m edicines [ J]
Chin
H e rb Med , 2009, 1( 1) : 1-28

[ 9]
陈秋实, 陈孟兰, 范
晶
青蒿素提取研究进展 [ J ]
武汉生
物工程学院学报, 2007, 3( 2) : 120- 124

[ 10]
Yadav J S , Sath eesh B R, Sabitha G
Stereos elect ive total
synthesis of ( + )-artemisin in [ J]
Te trah ed ron L e tt , 2003,
44: 387-389

[ 11]
Brow n G D, Sy L K
I n v i v o t ransformat ions of dihyd roarte-
misinic acid in A rtemisia annua plants [ J]
Te tr ahed ron,
2004, 60: 1139-1159

[ 12]
Eelco Wallaart T, Uden W V, H eidi G M, et al . Isolation
an d ident if icat ion of dihydroartemis inic acid fr om A r temisia
annua and it s poss ible role in th e biosyn thes is of artemisinin
[ J]
J N at P rod , 1999, 62: 430-433

[ 13]
Kaw amoto H , Asada Y, Sekine H , et al . Biot ransformation
of artemis inic acid b y cultur ed cells of A rtemisia annua [ J ]

Phytoch emist ry , 1998, 48: 1329-1333

[ 14]
贾秀山, 廖宇静, 于飞飞, 等
黄花蒿组织培养研究 [ J]
生
物技术通讯, 2008, 19( 2) : 259-262

[ 15]
Nan cy A
Semisyn th esi s of 3-
-hyd rox yartemisinin [ J]
J
N at P rod , 1999, 62: 790-793

不同处理对药用紫苏种子萌发特性的影响
张春平1 ,何
平1* ,何俊星1 , 喻泽莉1 , 杜丹丹1 ,胡世俊2
( 1
西南大学生命科学学院 三峡库区生态环境教育部重点实验室,重庆市三峡库区植物生态与
资源重点实验室,重庆
400715; 2
中国科学院昆明植物研究所,云南 昆明
650204)
摘
要:目的
通过对紫苏种子形态和萌发特性的研究,寻找打破种子休眠、提高种子萌发率的适宜条件。方法
观
察种子外部形态,对紫苏种子千粒质量、净度、含水量和吸水率等多项指标进行测定,对紫苏种子分别进行超声、低温
和热水预处理, 分析不同温度、不同浓度化学物质和不同萌发介质处理对种子萌发率的影响。结果
紫苏种子的含
水量为 9
09% ,吸水率为 42
84% ,经过 60
热水和 4
/ 5 d 预处理后的萌发率分别为 91
2% 和 90
1%。GA3
200 mg/ L 和 PEG 200 mg/ L 处理后的萌发率分别为 94
6% 和 91
1% ,较高浓度的 NAA 和 6-BA 对种子萌发具有
明显的抑制效应, 变温下 ( 15
/ 23
) 种子萌发率为 94
7% , 滤纸和纱布介质上的萌发率分别为 94
2% 和
91
2%。结论
种皮是限制种子萌发的主要因素, 先用 60
热水对种子进行预处理,然后再用 GA3 200 mg / L 处理
种子,可以在短时间内显著地提高种子的萌发率, 种子萌发的最佳温度为 15
/ 23
,最佳发芽介质为双层滤纸。
关键词:紫苏; 种皮; 吸水率; 萌发率
中图分类号: R282
2


文献标识码: A


文章编号: 0253-2670( 2010) 08-1361-05
Effects on germination characteristics with different treatments for seeds
of medicinal plant Perilla f rutescens
ZHANG Chun-ping
1
, HE Ping
1
, HE Jun-x ing
1
, YU Ze-li
1
, DU Dan-dan
1
, HU Sh-i jun
2
( 1
School of L ife Sciences, Southw est Universit y, Key Labor ator y ( M inistr y of Education) of Eco-environments
of Three Gorges Reservo ir Region, Chongqing Key Labo rato ry of P lant Eco lo gy and Resources Research
fo r T hree Gorges Reserv oir Reg ion, Chongqing 400715, China; 2. Kunm ing Institute
of Bo tany, Chinese Academy of Sciences, Kunming 650204, China)
Abstract: Objective
T o break the dormancy and improve the germinat ion rate of P eri l la f r utescens

1361
中草药
Chinese Traditional and Herbal Drugs
第 41 卷第 8 期 2010 年 8 月
* 收稿日期: 2009- 11-12





















基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 30070080)作者简介:张春平( 1982
) ,男,山东潍坊人,博士,主要从事植物资源学与植物分子生物学等方面的研究。
T el: 13667652727
E- mail : chunpingzhan g520@ 163. com
* 通讯作者
何
平
T el: ( 023) 68254122
E-mail: hepin g196373@ 126. com