全 文 ：药材与资源
人参及西洋参栽培土壤微生物种群遗传多样性的 RAPD分析
李 勇, 应益昕,赵东岳,晋 森, 丁万隆*
(中国医学科学院 北京协和医学院药用植物研究所,北京 100193)
摘 要:目的 研究不同年生人参、西洋参栽培土壤中微生物种群结构差异。方法 采用 RAPD 技术对采集自吉
林省抚松县的 18 份人参、西洋参根际土和根围土中的微生物种群结构进行遗传多样性分析。结果 栽培年限对
根际土及根围土中的微生物种群结构有显著影响; 人参和西洋参栽培土壤中的微生物种群结构也存在差异;寄主
植物对土壤微生物种群结构的影响表现有根际效应。结论 人参或西洋参根系分泌物对土壤微生物的定向选择
压力可能是造成土壤微生物种群遗传多样性变化的主要原因之一, 人参或西洋参栽培土壤中微生物种群结构变化
是导致土壤生态功能紊乱以及连作障碍形成的关键因子。
关键词:人参; 西洋参;栽培土壤; 微生物种群;遗传多样性; RAPD
中图分类号: R282 7 文献标识码: A 文章编号: 02532670( 2010) 11187105
Genetic diversity analysis on rhizosphere soil microbial population of Panax ginseng
and Panax quinquef olium by RAPD
LI Yong, YING Yix in, ZHAO Dongyue, JIN Sen, DIN G Wanlong
( Inst itute of Medicinal P lant Development, Chinese Academy o f Medical Sciences and Peking Union Medica l Colleg e,
Beijing 100193, China) )
Abstract: Objective To study rhizosphere and nonrhizosphere soil microbial populat ion genetic
diversity of Panax ginseng and P quinquef ol ium w ith dif ferent grow ing years Methods Eighteen P
ginseng and P quinquef ol ium rhizosphere and nonr hizo sphere so il samples w er e collected f rom Fusong
county of Jilin Prov ince, and genet ic diversity of m icrobial populat ion const ruct ion w ere analy zed by
RAPD Results Cult ivat ion t imes have gr eat inf luence on m icrobial populat ion const ruct ion o f r hizo sphere
and nonrhizosphere soil A lso w e found that there w ere differences betw een soil m icrobial population con
st ruct ion of P ginseng and P quinquef ol ium Fur thermo re, rhizosphere effect of plants on soil m icrobial
populat ion const ruct ion w as also found Conclusion Direct ional select ion pr essure that r oot secret ions of
P ginseng and P quinquef ol ium to soil m icroor ganisms is one of the main drives that resulted in the
change of m icrobial populat ion genet ic diversity, and microbial populat ion const ruct ion change in P gin
seng and P quinquef ol ium cult iv ated so il is the key factor for soil ecolo gical funct ion turbulence and the
development o f cont inuously cropping obstacle
Key words: Panax ginseng C A Meyer; Panax quinquef ol ium L ; cult ivat ing soil; m icrobial popu
lat ion; g enet ic diversity; RAPD
人参 Panax ginseng C A Meyer 系我国传统
名贵中药材[ 1] , 在生产中存在较为严重的连作障碍
问题,栽过人参的土地(俗称老参地) 30 年内不能重
复栽参,否则易出现严重的!烧须、烂根、病害高发∀
等问题,严重者甚至造成绝收。西洋参与人参同为
五加科人参属药用植物, 在生产中也存在连作障碍
问题。针对人参、西洋参连作障碍问题,已从土壤理
化性状[ 2] 、营养成分 [ 3]、土壤酶活性[ 4] 、土壤微生物
区系 [ 5]、病菌积累[ 6] 、化感作用 [ 7]等方面开展了大量
研究,但其形成机制迄今尚不明确。根据对人参连
1871中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 11 期 2010 年 11月
收稿日期: 20100321 基金项目:国家自然科学基金资助项目( 30672619) ;高校博士点科研基金资助项目( 200800231060)作者简介:李 勇( 1976 # ) ,男,河北省衡水市人,博士,副研究员,主要从事药用植物分子生物学及病害生物防治技术研究,已发表论文 30余篇。T el : ( 010) 62899745 Email: liyong@ im plad ac cn
* 通讯作者 丁万隆 Email: w lding@ implad ac cn
作障碍的研究结果, 通过轮作、土壤消毒、土壤改良、
病害生物防治等 [ 89]手段开展了人参、西洋参连作障
碍的消除试验, 尽管取得了初步成效, 但人参、西洋
参连作障碍并未彻底消除。
土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分,
其在物质与能量循环、土壤结构保持、土壤微生态平
衡等方面发挥重要作用[ 10]。土壤微生物种群多样
性是评价土壤微生态环境变化的重要指标, 开展老
参地土壤微生物种群结构研究, 对于阐明人参栽培
土壤中微生物种群遗传多样性及群落结构功能在土
壤微生态平衡保持中的作用意义重大。
土壤微生物传统分析方法建立在菌物培养的基
础上,受多种因素制约,可培养的微生物仅占土壤微
生物总数的极小比例( 1% ~ 5%) [ 1112] 。因此, 借助
传统的菌物培养方法难以真实、客观地反映土壤微
生物种群结构。随着科学技术的进步, 许多基于高
通量组织培养(如 BIOLOG)、化学分析(如 PLFA)
以及 PCR扩增(如 DGGE、TRFLP)等现代生态学
研究方法不断涌现,并成功应用于土壤微生物遗传
多样性、物种鉴定、系统进化、生态功能分析等研究
领域[ 1315] 。随机扩增多态性 DNA 标记( random ly
amplif ied polymorphic DNA , RAPD)是用于土壤微
生物种群分析的有效方法之一,其具有操作简单、费
用低廉、通用性好等优点; RAPD引物能够与土壤微
生物基因组 DNA 特定位点随机结合,从而达到扫
描微生物全基因组的目的。该方法自创建至今, 已
被广泛应用于动物、植物及微生物基因组水平的遗
传多样性研究。本研究在前期的基础上 [ 1618] , 利用
RAPD方法对采自人参、西洋参生产基地的根际土
及根围土微生物种群开展了遗传多样性研究;另外,
通过比较不同年生人参及西洋参根区土壤微生物种
群结构差异,探讨了人参栽培过程中土壤微生物种
群结构的特征性变化, 为深入研究人参连作障碍的
形成机制奠定理论基础。
1 材料与方法
1 1 土壤样品:供试土壤样品共计 18份,均采自吉
林省抚松县新屯镇黄泥村(北纬 42∃31%54 2&, 东经
127∃15%45 8&, 海拔 581 6 m)。供试土壤样品均为
农田土,土壤类型为黄土, 分别采自人参、西洋参的
根际及根围(表 1)。每份土壤样品均通过多点取样
获得,取后直接装入自封袋,采回土样随即用试剂盒
( OMEGA)进行了土壤微生物基因组DNA的提取,
提取步骤参照试剂盒说明操作, 提取的基因组总
DNA 溶液于- 20 ∋ 保存,备用。
表 1 供试土壤样品
Table 1 Soil samples
编号 参龄 土壤样品 备注 编号 参龄 土壤样品 备注
1 1 1 年生人参根际土 A 10 5 2+ 3年生人参根围土 A
2 1 1 年生人参根围土 A 11 6 3+ 3年生人参根际土 A
3 1 1 年生人参根际土 B 12 6 3+ 3年生人参根围土 A
4 1 1 年生人参根围土 B 13 3 3年生西洋参根际土 A
5 3 3 年生人参根际土 A 14 3 3年生西洋参根围土 A
6 3 3 年生人参根围土 A 15 2 2年生西洋参根际土 A
7 4 3+ 1 年生人参根际土 A 16 2 2年生西洋参根围土 A
8 4 3+ 1 年生人参根围土 A 17 4 1+ 3年生西洋参根际土 A
9 5 2+ 1 年生人参根际土 A 18 4 3年生西洋参根围土 A
A未改良土壤; B农家肥改良土壤
A soil unimpr oveod; B soil improved by farmyard manu re
1 2 土壤微生物 RAPD分析:土壤微生物总 DNA
提取及 RA PD反应体系参考文献方法 [ 19]。PCR反
应体系为 25 L, 包括 17 9 L 超纯水( ddH 2O) ,
2 5 L 10 ( PCR 缓冲液 ( 100 mmol/ L T ris、500
mmol/ L KCl、20 mmol/ L Mg 2+ , pH8 3) , 1 5 L
RA PD 引物 ( 10 mo l/ L ) ; 1 5 L dNTP ( 2 5
mmol/ L ) , 0 6 L T aq DNA 聚合酶( 2 5 U /L) , 1
L 模板 DNA (约 15 ng )。本实验利用从 200 条
RA PD引物中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的
24条 RAPD引物(表 2) ,对样品中的土壤微生物种
群进行了遗传多样性分析。
PCR 反应在 BIOMET RA T GRADIENT96型
扩增仪上完成。扩增程序为: 94 ∋ 、1 m in, 94 ∋ 、
1 min, 37 ∋ 、1 min, 72 ∋ 、1 5 min, 40个循环; 最
后, 72 ∋ 延伸 7 min。扩增产物经 1 5%琼脂糖凝
胶电泳及 EB染色处理后,在 BIORAD紫外凝胶成
像仪上观察、拍照。
1 3 数据采集及分析:根据 RAPD扩增产物的电泳
结果,在迁移位置相同的琼脂糖凝胶上无 DNA 条带
记为! 0∀,有 DNA 条带记为! 1∀。用 POPGENE Ver
sion 1 31软件计算多态位点百分率、观察等位基因数
( N a)、有效等位基因数(N e)、Nei%s基因多样性指数
( H e)、Shannon信息指数( I )。用 NT SYSpc Version
2 10e软件中的非加权平均数( unweight pairgroup
method using arithmetic averages, UPGMA)方法对统
计数据进行聚类分析。
2 结果与分析
2 1 土壤微生物 RAPD扩增评价: 以试剂盒纯化
的土壤微生物基因组 DNA 为模板, 经 PCR 扩增,
共扩增出 359 条清晰、可辨的 RAPD 扩增条带, 其
中多态性条带 324条, 多态性率高达 90 25% ,扩增
片段的长度为 200~ 900 bp。每条 RAPD引物扩增
的DNA条带数为7~ 24, 平均每条引物可扩增出
1872 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 11 期 2010 年 11月
表 2 用于微生物遗传多样性分析的 RAPD 引物
Table 2 RAPD Primers used in analysis of soil microbial population genetic diversity
引物 序 列 GC/ % 引物 序 列 GC/ %
OPH 8 5%GAA ACACCCC3% 60 OPR11 5%GT AGCCGT CT3% 60
OPH 10 5%CCTACGT CAG3% 60 OPR14 5%CAGGAT TCCC3% 60
OPH 11 5%CTT CCGCAGT3% 60 OPR16 5%CT CTGCGCGT3% 70
OPI4 5%CCGCCTAGT C3% 70 OPR17 5%CCGT ACGTAG3% 60
OPJ1 5%CCCGGCAT AA3% 60 OPR19 5%CCTCCT CAT C3% 60
OPJ4 5%CCGAACACGG3% 70 OPS4 5%CACCCCCTT G3% 70
OPJ7 5%CCTCTCGACA3% 60 OPS6 5%GAT ACCTCGG3% 60
OPJ8 5%CATACCGT GG3% 60 OPS10 5%ACCGTT CCAG3% 60
OPR7 5%ACTGGCCT GA3% 60 OPT 16 5%GGT GAACGCT3% 60
OPR8 5%CCCGTT GCCT3% 70 OPT 17 5%CCAACGTCGT3% 60
OPR9 5%TGAGCACGAG3% 60 OPT 18 5%GATGCCAGAC3% 60
OPR10 5%CCATT CCCCA3% 60 OPT 19 5%GTCCGT AT GG3% 60
13 5条多态性条带。其中, RAPD引物 OPJ1 扩增
出的多态性条带最多( 23条) , RAPD引物 OPR8扩
增出的多态性条带最少( 7条)。图 1为 RAPD引物
OPR11在 18份土壤微生物样品中的扩增图谱。琼
脂糖凝胶电泳结果表明, 筛选出的 24条 RAPD 引
物可在土壤样品间扩增出丰富的多态性条带, 能够
用于供试土壤的微生物种群遗传多样性分析。
图 1 RAPD引物 OPR11 在 18 份土壤微生物样品中的
扩增图谱
Fig 1 RAPD Prof iles of eighteen soil microbial samples
amplified by OPR11
2 2 微生物种群遗传多样性分析: N e和 H e 是遗
传多样性研究中最常用的衡量指标,具有重要的遗
传学意义[ 2022] 。I 本身没有遗传学意义, 但方便与
同类研究进行比较。利用 POPGEN Version 1 32
软件对土壤微生物种群遗传多样性分析结果表明,
18份土壤样品的平均 N a为 1 975 3, 平均 N e 为
1 446 3, 平均 H e为 0 277 6,平均 I 为 0 433 5。就
不同土壤样品而言,其土壤微生物种群的遗传多样
性存在较大差异, N e最大值为 1 650 2,最小值仅为
1 273 8; H e最大值为 0 366 6,最小值为 0 198 0; I
最大值为 0539 2,最小值为 0 338 9, 表明不同土壤样
品的微生物种群间存在较丰富的遗传变异。见表 3。
2 3 基于微生物种群遗传多样性的聚类分析:根据
18份土壤样品的微生物种群和 359个 RAPD扩增位
点的原始统计数据矩阵, 经 NTSYSpc Version 210e
软件分析,共获得 153个两两比较的遗传相似系数,
最大值为 0 845 7,最小值为 0 527 8。以 0 65为阈
值可以将18份土壤样品划分为 6组,见图2。组)包
括 8份土壤样品,其中土壤样品 1和样品 2、3和 4为
直播 1年生人参, 4份土壤样品中的微生物种群遗传
相似系数最高;样品 7和样品 8对应 4( 3+ 1)年生人
参,由于经过人工移栽,在新土壤环境中实际仅生长
了 1年,他们与土壤样品 1~ 4的遗传相似系数也较
高。另外,该组还包括与土壤样品 15和 16对应的直
播 2年生西洋参。组 ∗包括4份土壤样品,分别对应
5( 2+ 3)年生人参根际土、6( 3+ 3)年生人参根际土、4
( 1+ 3)年生西洋参根际土和 6( 3+ 3)年生人参根围
土。尽管4份土壤样品对应不同的人参种,生长年限
也不相同,但仔细研究发现,他们均在新移栽土壤中
生长了 3年,其微生物种群结构也最接近。组+包括
2份土壤样品,分别对应直播 3年生西洋参根际土和
直播 3年生西洋参根围土。组,仅有 4(1+ 3)年生人
参根围土1种。组−包括 2份土壤样品, 分别对应直
播 3年生人参根际土和直播 3年生人参根围土。组
.也仅有5( 2+ 3)年生人参根围土 1种。从上述聚类
结果不难发现,栽培年限对土壤中的微生物种群结构
的影响最显著; 其次, 植物的种类对土壤微生物种群
也有影响。尽管人参和西洋参同为五加科人参属植
物,但从分类学的角度讲,他们属于不同的种,组+和
组−中土壤微生物种群的遗传差异说明, 即使是近缘
植物,土壤微生物种群结构也可能存在差异。另外,
根据相同参龄的人参(或西洋参)根际土和根围土聚
类分析结果,植物对土壤微生物种群结构的影响表现
有根际效应。
1873中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 11 期 2010 年 11月
表 3 18份土壤样品的微生物种群遗传多样性分析
Table 3 Genetic diversity analysis of 18 soil microbial samples
RAPD引物 总条带数 多态性条带 多态性率/ % N e H e I
OPH 08 11 11 100 1 385 8 / 0 209 3 0 264 2 / 0 103 4 0 427 4 / 0 125 0
OPH 10 10 8 80 1 605 3 / 0 312 1 0 354 2 / 0 135 8 0 529 7 / 0 161 7
OPH 11 16 16 100 1 328 8 / 0 274 0 0 221 9 / 0 133 9 0 367 1 / 0 167 6
OPI04 22 21 95 1 542 0 / 0 291 3 0 328 7 / 0 128 7 0 500 6 / 0 154 0
OPJ01 24 23 96 1 444 8 / 0 285 0 0 281 5 / 0 142 5 0 438 2 / 0 187 6
OPJ04 21 20 95 1 273 8 / 0 210 1 0 198 0 / 0 109 7 0 338 9 / 0 141 5
OPJ07 16 16 100 1 445 2 / 0 330 6 0 274 8 / 0 156 8 0 429 7 / 0 195 5
OPJ08 18 18 100 1 416 5 / 0 267 7 0 272 7 / 0 120 4 0 435 5 / 0 142 7
OPR07 13 13 100 1 332 1 / 0 311 8 0 217 5 / 0 149 3 0 357 5 / 0 189 4
OPR08 7 7 100 1 400 1 / 0 315 5 0 257 1 / 0 150 3 0 410 3 / 0 187 9
OPR09 15 15 100 1 276 0 / 0 208 2 0 200 3 / 0 106 6 0 343 0 / 0 136 6
OPR10 15 14 93 1 332 8 / 0 261 7 0 228 4 / 0 118 1 0 379 8 / 0 142 2
OPR11 16 12 75 1 317 8 / 0 224 9 0 223 2 / 0 116 1 0 371 8 / 0 149 0
OPR14 15 12 80 1 650 2 / 0 330 4 0 366 6 / 0 151 8 0 539 2 / 0 188 8
OPR16 14 10 71 1 576 2 / 0 345 8 0 334 4 / 0 160 5 0 500 9 / 0 200 0
OPR17 17 11 65 1 609 1 / 0 292 5 0 357 4 / 0 129 6 0 533 7 / 0 155 2
OPR19 16 14 88 1 588 9 / 0 335 7 0 341 2 / 0 152 5 0 510 4 / 0 187 6
OPS04 17 15 88 1 492 3 / 0 328 2 0 297 4 / 0 161 8 0 452 8 / 0 214 5
OPS06 15 15 100 1 456 7 / 0 319 5 0 282 3 / 0 155 8 0 436 1 / 0 205 6
OPS10 15 14 93 1 493 7 / 0 270 0 0 309 4 / 0 127 3 0 478 1 / 0 155 1
OPT 16 11 9 82 1 447 3 / 0 297 4 0 284 2 / 0 138 7 0 445 7 / 0 173 4
OPT 17 13 12 92 1 597 8 / 0 286 8 0 354 8 / 0 120 9 0 532 1 / 0 143 3
OPT 18 10 9 90 1 577 1 / 0 251 6 0 351 7 / 0 101 4 0 531 7 / 0 114 7
OPT 19 12 9 75 1 615 0 / 0 365 9 0 346 6 / 0 172 8 0 508 6 / 0 230 4
总计 359 324 90 1 446 3 / 0 310 2 0 277 6 / 0 147 0 0 433 5 / 0 186 0
相似系数
图 2 18份土壤微生物样品的 UPGMA 聚类图
Fig 2 UPGMA Dendrogram of 18 soil microbial samples
3 讨论
目前,用于研究土壤微生物种群遗传多样性的
分子生态学研究方法较多, 如 DGGE/ T GGE、SS
CP、TRFLP、ARDRA 等。但是从研究技术自身特
点而言, AFLP 和 RAPD 的扩增条带最为丰富、引
物的结合位点随机,能够对土壤微生物全基因组进
行扫描, 最适合开展土壤微生物种群研究。AFLP
扩增结果稳定, 可重复性高,结合高分辨力的聚丙烯
酰胺凝胶电泳,能够对扩增产物进行高效分离, 是研
究土壤微生物种群遗传多样性的首选。但该方法建
立在限制性酶切的基础上, 土壤微生物 DNA 提取
物中的腐殖酸严重限制了该项技术在土壤微生态学
研究中的应用[ 23] ;另外, AFLP 酶切时需要 DNA 模
板的量较多( 0100 ng) ,如果微生物 DNA 提取量
不够大, 土壤中的非优势微生物种群将很难被发
现[ 2 4]。尽管 RAPD的扩增条带数量和可重复性均
1874 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 11 期 2010 年 11月
不如 AFLP,但该方法对微生物 DNA 模板的质量
和数量要求较低,在熟练掌握 PCR 扩增技术, 严格
控制反应条件和扩增体系的基础上,试验结果的稳
定性能够得到保证[ 25] 。
土壤微生物是土壤的重要组成部分,土壤微生
物种群结构多样性与土壤养分循环、土壤微生态平
衡、土壤理化性状保持等密切相关 [ 26]。本研究尝试
从土壤微生物种群遗传多样性变化的角度研究人参
栽培过程中人参栽培土壤中微生物种群结构改变与
土壤微生态环境恶化的关系。研究结果表明, 不同
栽培年限人参或西洋参根际土及根围土中的微生物
种群结构均存在显著差异, 而且不同土壤样品中的
微生物种群结构在一定程度上表现有根际效应。
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川产麦冬野生资源 HPLC指纹图谱及化学模式识别研究
刘 江,陈兴福* ,杨文钰,张树平, 杜 刚,刘卫国
(四川农业大学农学院 ,四川 雅安 625014)
摘 要:目的 建立川产麦冬野生资源的化学模式识别方法。方法 采用高效液相色谱法, 建立川产麦冬野生资
源的 HPLC 指纹图谱,使用 SPSS17 0软件对 26 批不同来源川产麦冬样品的 H PLC 指纹图谱进行主成分分析, 在
主成分得分系数矩阵的基础上,对其进行系统聚类分析; 并使用相似度评价软件进行相似度评价验证。结果 26
批麦冬样品共提取出 4 个主成分, 被分为 4 大类; 与共有峰直接聚类相比,主成分聚类分析更符合相似度评价结
果。结论 利用 SPSS 软件对麦冬 H PLC 指纹图谱进行主成分聚类分析,所建立的模式识别方法, 操作简便,统计
结果具有可靠性,可对麦冬化学计量学分类及其质量评价提供有效参考。
1875中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 11 期 2010 年 11月
收稿日期: 20100212 基金项目:四川省育种攻关项目! 特色种质资源收集整理与创新利用∀ ( 2006yzgg1212)作者简介:刘 江( 1986 # ) ,男,四川江油人,硕士研究生,主要从事药用植物生理生态与栽培研究。
* 通讯作者 陈兴福 T el: ( 0835)2882612 Em ail : chenxf64@ sohu. com.