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江浙蝮蛇毒对体外培养人滑膜细胞凋亡的影响
胡 珏1, 2 ,许东航1, 3 * ,吕庆华3
( 1 浙江大学药学院,浙江 杭州 310031; 2 浙江医学高等专科学校 药理教研室, 浙江 杭州 310053;
3 浙江大学医学院附属第二医院,浙江 杭州 310009)
摘 要:目的 探讨江浙腹蛇毒 ( AH V ) 诱导类风湿性关节炎 ( RA ) 患者滑膜细胞凋亡的作用及对相关蛋白
Caspase3 表达的影响。方法 AHV 处理培养的滑膜细胞后, 采用 MTT 比色法检测 AHV 对滑膜细胞增殖的抑
制作用,并采用流式细胞仪 ( FCM ) 检测细胞凋亡率, 以免疫组织化学法检测 Caspase3 蛋白的表达。结果 MTT
的检测结果显示 5g / mL AHV 处理组滑膜细胞增殖抑制率达 67 2% , 且与时间、剂量具有正相关关系 ( P <
0 05) , AH V 体外作用滑膜细胞 24 h 的 IC50为 3 508 g/ mL。流式细胞仪结果显示,与对照组相比, AH V 各剂量
组凋亡率明显增加 (P< 0 05) ,并与剂量呈正相关。AHV 体外作用滑膜细胞 24 h 时出现了明显的 Caspase3 蛋
白表达,其蛋白表达率明显高于对照组。结论 AHV 对滑膜细胞具有较强的增殖抑制作用, 细胞凋亡率明显增加
可能与 AHV 诱导滑膜细胞 Caspase3 活化相关。
关键词:江浙蝮蛇毒; 类风湿性关节炎; 滑膜细胞; 细胞凋亡; Caspase3
中图分类号: R285 5 文献标识码: A 文章编号: 02532670( 2010) 11184704
类风湿性关节炎 ( r heumato id arthritis , RA )
是一种常见的严重危害人类身心健康的多因素导致
的系统性自身免疫性疾病,表现为关节反复的炎症、
滑膜细胞 肿瘤样!增生以及由此引起的软骨和骨的
破坏,其发病机制主要与滑膜细胞凋亡减少所导致
的滑膜组织内细胞的增殖和死亡之间的平衡失调有
关[ 1]。因而,促进滑膜细胞的凋亡可能是未来治疗
RA 的重要方向。蛇毒是毒蛇分泌出来的一种毒
液,其中含有多种具有不同生理与药理活性的酶与
肽类物质。近年来国内外从蛇毒中分离出多种抗肿
瘤成分, 它们对肿瘤细胞有杀伤和抑制生长的作
用[ 23]。江浙蝮蛇毒 ( Agk ist rodon haly s Pallas
venom , AH V) 的主要活性成分蛇毒蛋白有诱导凋
亡和抗肿瘤作用,临床上已被用于治疗 RA 等慢性
疾病所致的炎症和疼痛。然而, AHV 对 RA 患者
的治疗作用机制仍不是很清楚。本实验以此为出发
点,初步研究了 AHV 对 RA 患者成纤维样滑膜细
胞增殖与凋亡的影响,并分析其可能的作用机制。
1 材料与方法
1 1 病例来源: 2007年 2~ 7月浙江大学附属第二
医院骨科行膝关节置换术的 RA 患者 6 例。其中
女性 3例, 男性 3 例,年龄 34~ 62 岁,平均 ( 50 ∀
10) 岁;病程 6~ 30 年,平均 ( 14 ∀ 10) 年。所有患
者皆符合 1987年美国风湿病学会 ( ACR) 修订的
RA 诊断标准。
1 2 主要试剂与仪器: DMEM 培养基、#型胶原
酶、胎牛血清、胰蛋白酶,美国 Gibco 公司; MT T 和
DMSO,美国 Sigma 公司;兔抗人 Caspase3 抗体,
美国 Santa Cruz 公司; PI 储存液, 美国 Sigma 公
司, RNase 试剂用时现配。AHV 由浙江龙图蛇业
集团有限公司提供, - 20 ∃ 保存。酶标检测仪
( BioRAD Model 550型) ; FACS Calibur 型流式细
胞仪,美国 BectonDickinson 公司。
1 3 滑膜细胞的分离和培养[ 4] : 无菌条件下,将关
节置换术获得的滑膜组织切成 3~ 5 mm 的碎片,用
#型胶原酶和等体积的 DMEM 培养基, 在 37 ∃ 、
%1847%中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 11 期 2010 年 11月
收稿日期: 20100328 基金项目:浙江省中医药科研基金项目 ( 2006C024)作者简介:胡 珏( 1972 & ) ,女,浙江金华人,硕士,副教授,研究方向为类风湿性关节炎的基础与临床研究。
T el : ( 0571) 87692678 Email: hjm ice@ z jmc. net . cn
* 通讯作者 许东航 T el: ( 0571) 87784529 Email: xudonghang@ zju . edu. cn
5% CO2孵箱中消化 4 h。常规离心, 弃上清后加
0 25% 胰酶 1 mL, 混匀后消化 30 min。1 000 r/
min 离心后弃上清,加入含 10% 胎牛血清、100 U /
mL 青霉素和 100 g/ mL 链霉素的 DMEM 培养
基,置 37 ∃ 、5% CO 2孵箱中孵育, 常规传代培养。
1 4 AHV 对滑膜细胞增殖的影响: 调整细胞悬液
浓度为 7 ∋ 104 / mL, 均匀接种于 96孔培养板中, 每
孔体积 100 L,培养 24 h。分别加入含不同质量浓
度 ( 1 25、2 5、5、10 g / mL) A HV 的新培养液, 设
对照组 (生理盐水) ,每组设 4 个平行孔。作用 24、
48、72 h 后弃去每孔中培养液, 加入含 10% MT T
( 5 mg/ mL) 的无血清 DMEM 培养液, 继续培养 4
h后吸去上清,加入 150 L DMSO,震荡 10 min, 用
酶联免疫检测仪于 490 nm 处测定每孔吸光度 ( A )
值,计算 AHV 的半数抑制浓度 ( IC50 )。
1 5 流式细胞仪检测滑膜细胞周期:取对数生长期
细胞,调整细胞浓度至 2 ∋ 105 / mL,加入不同质量
浓度 ( 0、2 5、5、10 g/ mL) 的 AHV 作用 24 h后,
胰酶消化收集细胞。冷 PBS 洗涤 2 次,缓慢加入 2
倍体积预冷 - 20 ∃ 的无水乙醇,充分摇匀, 固定,
4 ∃ 冰箱保存, 2 周内检测。上机测定前,离心去乙
醇,用 PBS 洗涤 2次。加入 500 L 碘化丙啶 ( 50
g/ mL) , 4 ∃ 避光染色 30 m in,用 200 目尼龙网滤
过,上机检测。
1 6 Annexin VFIT C/ PI 双染法检测滑膜细胞凋
亡:取对数生长期细胞, 细胞浓度为 2 ∋ 105 / mL。
加入不同质量浓度 ( 0、2 5、5、10 g/ mL ) 的
AHV,作用 24 h 后, 胰酶消化收集细胞。冷 PBS
洗2次, 1 000 r/ m in离心 5 m in,流式缓冲液重悬细
胞并计数,制成约 1 ∋ 106 / mL 单细胞悬液。加入 5
L Annexin VFIT C 和 10 L PI, 混匀, 室温避光
孵化 15 min,每管加入 400 L 结合缓冲液, 流式细
胞仪分析。
1 7 Caspase3 蛋白表达:同 1 6项方法 AHV 作
用 24 h 后收集各组细胞, PBS 冲洗 2 次,制成细胞
悬液涂片,风干后丙酮固定 15 min。3% 过氧化氢
孵育 5 min,以阻断内源性过氧化物酶。抗原修复
采用微波加热抗原修复法, 切片放在 0 01 mol/ L
枸橼酸盐缓冲液 ( pH 6. 0) 内, 用微波炉加热 10~
20 m in,待修复液降至室温后, PBS 洗 3次。滴加一
抗 (稀释 1 ( 100 ) , 室温 90 m in。PBS 冲洗,
2 m in ∋ 3 次。滴加辣根过氧化物酶 ( ho rseradish
perox idase, HPR) 偶联的二抗 20 ~ 30 min。以
PBS 冲洗, 2 m in ∋ 3 次。加入 3, 3二氨基联苯胺
( 3, 3)diam inobenzidine, DAB) 作为显色液, 避光
显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。以
PBS 代替一抗作为阴性对照。结果分析: Caspase3
蛋白定位于胞浆, 细胞浆染为棕黄色颗粒为阳性细
胞。利用 MPIAS500 多媒体彩色病理图像分析系
统进行分析。随机计数低倍镜下 10 个视野中的阳
性细胞占该视野细胞总数的比率, 得出每组细胞的
阳性率。
1 8 统计分析:结果均来自至少 3 组平行实验, 计
量资料用 x ∀ s 表示, 组间比较采用 SPSS 10 0 软
件进行分析, 以 OneWay ANOVA 进行方差分析,
以 StudentNewmanKeuls检验进行组间比较。
2 结果
2 1 AHV 对细胞增殖的影响:结果表明,经 1 25
g/ mL AHV 处理的细胞生长受到轻微抑制, 在
AHV 2 5~ 10 g/ mL 内, AHV 对滑膜细胞增殖的抑
制作用与剂量、时间呈正相关 (图 1)。应用 Bliss 法计
算得到 AHV 作用 24 h 的 IC50值为 3508 g/ mL,
95% 可信区间为 3464 9~ 3551 0 g/ mL。与对照组
比较,各给药组差异均有统计学意义 (P< 005)。
与对照组比较: * P< 0 05 * * P < 0 01
与 AHV 2 5 g % mL- 1组比较: # # P < 0 01
与同组 24 h 比较: ∗ P< 0 05 ∗ ∗ P < 0 01
* P < 0 05 * * P < 001 v s cont rol group
# # P < 0 01 v s AHV 2. 5 g % mL- 1 group
∗ P < 0 05 ∗ ∗ P < 001 v s 24 h in same group
图 1 AHV 对滑膜细胞增殖的影响 ( x∀ s, n= 4)
Fig. 1 Ef fect of AHV on proliferation of human
fibroblastlike synoviocytes ( x∀ s, n= 4)
2 2 AHV 对滑膜细胞细胞周期的影响: 与对照组
相比, 2 5、5 g/ mL AHV 作用于滑膜细胞, G0 / G1
期以及 G 2 / M 期的细胞比例逐渐减少, S 期细胞比
例逐渐增加,说明滑膜细胞增殖被阻滞在 S 期, 即
DNA 合成期。当 AHV 质量浓度增至 10 g/ mL
时, S期比例明显下降, 从 5 g/ mL 组的 26 27%
下降至 23 22%, 提示有部分细胞无法进入 DNA
合成期 (表 1)。
%1848% 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 11 期 2010 年 11月
表 1 AHV对滑膜细胞细胞周期分布的影响 (x ∀ s, n= 4)
Table 1 Effect of AHV on cell cycle distribution of human
fibroblastlike synoviocytes ( x∀ s, n= 4)
组别 /
(g% mL- 1 )
细胞周期分布/ %
G0 / G1 S G2 /M
对照 - 60 26∀ 3 44 22 16∀ 1 67 15 57 ∀ 2 51
AHV 2 5 58 65∀ 2 08 25 65∀ 1 38* 13 88 ∀ 2 18
5 0 55 53∀ 1 12* 26 27∀ 2 31* 12 02 ∀ 1 17*
10 0 54 43∀ 3 02* 23 22∀ 2 95 11 39 ∀ 2 26*
与对照组比较: * P< 005
* P< 0 05 v s con tr ol group
2 3 AHV 对滑膜细胞凋亡的影响: 在双变量流式
细胞仪的散点图上, 左下象限 ( LL) 显示活细胞, 为
FIT C- / PI- ;右上象限 ( U R) 是非活细胞, 即坏死
细胞,为 FIT C/ PI;而右下象限 ( LR) 为凋亡细胞,
显现 FITC/ PI- 。AHV 作用 24 h 后,滑膜细胞的
凋亡细胞增多, 右上及右下两个象限散点分布增多,
2 5、5、10 g/ mL AHV 组细胞凋亡率分别为
( 5 30 ∀ 4 22) %、( 12 93 ∀ 5 71 ) %、( 21 98 ∀
3 63) % (表 2)。
表 2 AHV对滑膜细胞凋亡的影响 (x ∀ s, n= 4)
Table 2 Effect of AHV on apoptosis of human
fibroblastlike synoviocytes ( x ∀ s, n= 4)
组别
/
( g% mL - 1)
四象限细胞比例/%
UL UR LL LR
凋亡率 (UR+ LR)/
%
对照 - 014 ∀ 191 205 ∀ 289 9621∀ 6 08 165 ∀ 549 3 70∀ 2 18
AHV 25 060 ∀ 012 277 ∀ 387 9423∀ 3 98 253 ∀ 597 5 30∀ 4 22
50 092 ∀ 377 452 ∀ 10 75 8649∀ 4 46 841 ∀ 142 12 93∀ 5 71* *
100 069 ∀ 512* 536 ∀ 11 78 7785∀ 6 19 1662∀ 4 88 21 98∀ 3 63* *
与对照组比较: * * P < 0 01
* * P< 0 01 v s cont rol gr ou p
2 4 AHV 对滑膜细胞 Caspase3 蛋白表达的影
响:不同质量浓度的 AHV 作用于滑膜细胞后,出现
了明显的 Caspase3 蛋白表达, 而且其蛋白表达率
明显高于 对照组; 并随 AHV 剂量 的增加,
Caspase3蛋白表达略有增加,差异具有统计学意义
( P< 0 05、0 01) (表 3)。
3 讨论
RA 为一种慢性、进地性、侵蚀性疾病, 我国人
群患病率大概为 0 36% ,约有 400 多万患者。在病
程 2年时 50% 患者有骨侵蚀, 20 年后几乎每例患
者均发生骨侵蚀, 如治疗不当,病情可逐渐加重, 滑
膜增生,骨关节软骨侵蚀破坏最后造成关节强直、畸
形、功能丧失和不同程度的残废。在 RA 的病理过
程中,基质成纤维样滑膜细胞增殖被认为是肿瘤样
的。因此, 抑制滑膜细胞增殖已成为研究RA治疗
的新靶点[ 5] 。
表 3 AHV对滑膜细胞 Caspase3 蛋白表达的影响
(x ∀ s, n= 4)
Table 3 Effect of AHV on protein expression in human
fibroblastlike synoviocytes ( x ∀ s, n= 4)
组别 / (g % mL- 1 ) Caspase3 阳性表达
对照 - 1 39 ∀ 0 07
AHV 2 5 2 78 ∀ 0 84*
5 0 3 27 ∀ 1 03* *
10 0 3 82 ∀ 1 44*
与对照组比较: * P < 0 05 * * P < 0 01
* P < 0 05 * * P< 0 01 v s cont rol g rou p
蛇毒是一类天然混合毒素, 含有多种活性成分,
对神经、血液等多个系统有影响,还可以直接抑制肿
瘤细胞增殖, 以抗肿瘤生长 [ 68]。前人研究显示[ 9] ,
蛇毒可用于治疗 RA, 但具体作用机制尚不明确。
RA 滑膜组织表现为增生性侵蚀性生长, 其生长及
病理学行为在许多方面类似于肿瘤组织的特性。由
此推测诱导凋亡可能是 AHV 抑制 RA 滑膜细胞增
殖的重要机制之一。本实验通过体外培养的 RA
患者滑膜细胞,研究了 AHV 对滑膜细胞增殖的影
响,并探讨其治疗 RA 的可能作用机制。以往实验
结果表明[ 10] : 正常人滑膜细胞增殖率很低, 而 RA
患者滑膜细胞的增殖明显高于正常组。本实验表明
不同质量浓度的 AHV 均能抑制 RA 患者滑膜细胞
的异常增殖, 作用 24 h 的 IC50为 ( 3 508 ∀ 0 043)
g/ mL。为了进一步为 AHV 体外抑制 RA 患者
滑膜细胞增殖提供依据并探讨其可能机制,本实验
采用流式细胞术对滑膜细胞凋亡进行了检测。作用
24 h 后, AHV 5、10 g / mL 时, 与对照组相比凋亡
百分率出现显著增加。
细胞凋亡受多种基因的调控, 其中比较重要的
包括 bcl2/ bax 基因、p53 基因和 cmyc 基因等。
Caspase 即天冬氨酸半胱氨酸特异性蛋白酶, 是一
类在细胞凋亡中起关键作用的蛋白酶家族,
Caspase3更是在凋亡的信息传递中居于核心地位,
Caspase3 基因的激活和蛋白表达后可直接导致细
胞凋亡[ 1112] 。既往实验证实, RA 患者滑膜淋巴细
胞 T 细胞大量 bcl2 表达且无凋亡现象, 提示 bcl2
表达提供给炎症细胞生存信号。Bcl2 过量表达可
能抑制 RA 滑膜细胞凋亡,是 RA 滑膜增生的原因
之一。RA 患者滑膜细胞上 bcl2表达上调,可活化
凋亡抑制信号, 从而促进滑膜细胞的增生和增
殖[ 1 3]。本实验观察到不同质量浓度的 AHV 处理
滑膜细胞后, 其 Caspase3 蛋白表达率明显升高。
AHV 作用于 RA 患者体外培养的滑膜细胞,其细
%1849%中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 11 期 2010 年 11月
胞凋亡率明显升高,同时伴有 Caspase3 阳性表达
的增加, 说明 AHV 可通过诱导 RA 滑膜细胞
Caspase3活化,促进滑膜细胞凋亡。但有关蛇毒诱
导的滑膜细胞凋亡的具体机制还有待进一步研究。
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白桂木抗炎镇痛作用有效部位筛选
欧阳胜1 ,申作洁2 ,潘琳娜3 *
( 1 江西中医学院 中药化学教研室, 江西 南昌 330006; 2 兖矿集团总医院 药剂科, 山东 邹城 273500;
3 江西中医学院 药理学教研室,江西 南昌 330006)
摘 要:目的 分离并筛选白桂木抗类风湿性关节炎的有效部位。方法 通过连续 ig 给药白桂木根总提取物、石
油醚部位、醋酸乙酯部位、氯仿部位提取物, 分别采用小鼠二甲苯致耳肿胀、大鼠棉球所致肉芽肿、小鼠醋酸扭体
法、小鼠热板法和小鼠腹腔毛细血管通透性评价活性。结果 白桂木醋酸乙酯部位抗炎镇痛作用较明显。结论
白桂木醋酸乙酯部位可能是其治疗类风湿性关节炎的有效部位。
关键词:白桂木; 类风湿性关节炎; 有效部位; 抗炎; 镇痛
中图分类号: R285 5 文献标识码: A 文章编号: 02532670( 2010) 11185004
白桂木 A r tocar pus hypargy r eus Hance 为桑
科波罗蜜属植物, 其根入药,味甘、淡,性温, 具有祛
风利湿、活血通络等功效,主治风湿痹痛、腰膝酸软、
头痛、胃痛、黄疸、产妇乳汁不足等症。该药在赣南、
粤北地区民间应用较广, 用于治疗类风湿性关节炎、
慢性腰腿疼痛等。白桂木根和根皮的化学成分已进
行研究[ 12] , 但目前对白桂木的基础研究尚不够深
入,其抗类风湿性关节炎的有效成分不清,缺乏以有
效成分为基础的质量标准, 疗效难以保证。本实验
着重对白桂木根治疗类风湿性关节炎有效部位进行
筛选,通过对白桂木根醇浸膏的 3种不同溶媒 (石
油醚、氯仿、醋酸乙酯) 萃取物以及总浸膏分别进行
抗炎、镇痛活性评价,确定其有效部位。
1 材料
1 1 动物:小鼠, SPF 级, 雌雄兼用, 体质量 18~ 22
g ,由江西中医学院实验动物中心提供, 合格证号:
%1850% 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 11 期 2010 年 11月
收稿日期: 20100329 基金项目:江西省自然科学基金资助项目 ( 2007GZY0926)作者简介:欧阳胜( 1968 & ) ,女,江西省南昌市人,江西中医学院中药化学教研室副教授,中药化学专业硕士生导师,长期从事中药化学的教学、科研工作。T el: 13450477365 Em ail : ouyangsh eng2003@ yahoo. com. cn
* 通讯作者 潘琳娜