全 文 :21413 酶2Sevag 法 :精确配制 0102 g/ mL 的多糖
溶液 ,酶法水解后高温灭活 ,离心 ,上清液再采用
Sevag 法 ,重复多次 ,直到无变性蛋白产生为止。结
果见图 2。
图 2 酶法2Sevag 法除蛋白
Fig12 Using enzyme2Sevag method to remove protein
经过 5 次萃取后蛋白的脱除率与多糖损失率分
别为 84150 %、29135 % ,随着萃取次数的增加两相
指标变化不大 ,蛋白质几乎全部除去。
3 讨论
3 种除蛋白方法都能在一定程度上脱除金银花
多糖中的蛋白质。除蛋白目的在于为金银花多糖分
离纯化与理化性质研究提供实验依据 ,故在兼顾多
糖损失的同时尽可能除去其中的蛋白质。从表 4 获
知 ,采用 Sevag 法脱蛋白 ,蛋白质的脱除率最高 ,但
同时多糖损失率也最高 ;采用酶法脱蛋白 ,蛋白的脱
除率最低 ;酶2Sevag 法脱蛋白 ,蛋白质的脱除率与
Sevag 法接近 ,但多糖损失率仅为 Sevag 法的 1/ 2。
酶2Sevag 法是利用木瓜蛋白酶来酶解蛋白 ,使
其成为相对分子质量较小多肽或者更为彻底的氨基
表 4 3 种脱蛋白方法结果比较
Table 4 Comparison of three kinds of method
for protein removal
除蛋白方法 多糖损失率/ % 蛋白质脱除率/ %
Sevag 法 561 57 851 72
酶法 311 22 731 28
酶2Sevag 法 291 35 841 50
酸 ,再进行醇沉 ,则大分子的多糖绝大多数得到沉
淀 ,而相对分子质量较小的多肽和氨基酸大部分保
留在溶液中 ,再结合 Sevag 法经过 5 次萃取后多糖
中蛋白质的脱除率达到 84150 % ,由于萃取次数与
单纯的 Sevag 法相比大大减少 ,多糖损失率仅为
29135 % ,进而证明酶2Sevag 法是金银花多糖脱蛋
白可行的方法。
参考文献 :
[ 1 ] 中国药典[ S]1 一部1 20051
[ 2 ] Kwak W J , Hart C K , Chang H W , et al1 Loniceroside C ,
antiinflammatory saponin f rom L onicera j aponica [J ]1 Chem
Pharm B ull , 2003 , 51 (3) : 33323351
[ 3 ] 毕跃峰 ,田 野 ,裴姗姗 ,等1 金银花中裂环环烯醚萜苷类化学
成分研究[J ]1 中草药 ,2008 ,39 (1) :182211
[ 4 ] 王 琦1 金银花的化学成分研究 [ D ]1 沈阳 :沈阳药科大学 ,
20081
[ 5 ] 邓庆华1 用正交试验法优化金银花多糖提取工艺[ D ]1 长春 :
东北师范大学 ,20081
[ 6 ] 司梁宏 ,谈恒山1 苯酚2硫酸显色法测定枸杞益肾胶囊中多糖
含量[J ]1 中国医院药学杂志 ,2007 ,27 (6) :83628371
[ 7 ] 张维杰1 复合多糖生化研究技术[ M ]1 上海 :上海科学技术出
版社 ,19871
[ 8 ] 李建武 ,陈丽荣 ,袁明秀1 生物化学实验原理和方法 [ M ]1 北
京 :北京大学出版社 ,19941
[ 9 ] 史德芳 ,韩淑琴1 仙人掌多糖提取过程中三种脱蛋白方法的比
较研究[J ]1 现代食品科学 ,2006 ,22 (4) :932951
降脂灵分散片溶出度的研究
楼超群1 ,戴德雄2 ,朱 莹2 3 ①
(11 湖州市安吉县中医院 ,浙江 湖州 313300 ; 21 浙江维康药业有限公司 ,浙江 丽水 323000)
摘 要 :目的 建立降脂灵分散片溶出度的测定方法。方法 以水作为溶出介质 ,采用桨法 ,100 r/ min ,以高效液
相色谱法测定累积溶出率 ,绘制降脂灵分散片的累积溶出曲线 ,并进行样品的溶出度测定。结果 二苯乙烯苷在
01057 2~01572μg 时进样量与峰面积呈良好的线性关系 ( r = 01999 9) ;对 3 批降脂灵分散片进行溶出度测定 ,二
苯乙烯苷 15 min 的溶出量均达 70 %以上。结论 所用方法具有灵敏、准确、快速的优点 ,适用于降脂灵分散片的
质量控制。
关键词 :降脂灵分散片 ;二苯乙烯苷 ;溶出度 ;高效液相色谱
中图分类号 :R28412 ;R286. 02 文献标识码 :B 文章编号 :025322670 (2010) 0420586202
降脂灵分散片处方来源于部颁标准降脂灵片
( WS32B23260298) ,由何首乌、枸杞子、黄精、山楂、 决明子 5 味中药组成 ,以何首乌为主药 ,可用于肝肾阴虚 ,头晕 ,目昏 ,须发早白 ,高血脂等症。该制剂中
·685· 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 4 期 2010 年 4 月
①收稿日期 :2009210212
主药何首乌中 2 ,3 ,5 ,4′2四羟基二苯乙烯222O2β2D2
葡萄糖苷 (简称为二苯乙烯苷) 为活性成分 ,因此本
实验对降脂灵分散片的溶出度测定方法进行了考
察 ,以便控制质量。
1 仪器与试药
Agilent 1100 高效液相色谱仪 ; ZRS —8 G 智能
溶出仪。降脂灵分散片 (批号 20081201 ,20081202 ,
20081203) ,由浙江维康药业有限公司提供。二苯乙
烯苷对照品 (批号 1108442200404) 由中国药品生物
制品检定所提供。乙腈为色谱纯 ,水为双蒸水 (自
制) 。其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
211 色谱条件 : Kromasil C18 (250 mm ×416 mm ,
5μm)为色谱柱 ;乙腈2水 (18 ∶82)为流动相 ;检测波
长 :320 nm ;体积流量 :110 mL/ min ;柱温 :35 ℃。
212 溶液的制备
21211 对照品溶液的制备 :取二苯乙烯苷对照品适量 ,
精密称定 ,加甲醇制成 20 mg/ mL 的溶液 ,摇匀 ,即得。
21212 供试品溶液的制备 :取本品 6 片 ,以脱气的
水 100 mL 为溶出介质 ,温度控制在 37 ℃±015 ℃,
转速 100 r/ min ,供试品进入释放池瞬间开始记时 ,
在规定取样点吸取溶液适量 ,立即滤过 ,续滤液高速
离心后 ,取上清液 ,即得。
21213 阴性对照溶液的制备 :处方比例称取除何首
乌以外的材料制成阴性样品 ,按供试品溶液的制备
方法制备空白对照溶液。
213 专属性考察 :按上述色谱条件分别对样品溶液、
供试品溶液和阴性对照品溶液进行分析 ,结果无干扰。
214 线性关系的考察 :分别精密吸取二苯乙烯苷对
照品溶液 2、6、10、14、20μL 注入高效液相色谱仪 ,
测定峰面积。以峰面积值为纵坐标 ,进样量为横坐
标作标准曲线 , 得回归方程为 Y = 2 ×106 X -
5 47712 , r = 01999 4。结果表明二苯乙烯苷进样量在
01057 2~01572μg 与峰面积呈现良好的线性关系。
215 精密度试验 :取二苯乙烯苷对照品溶液 ,连续
进样 6 次 ,测定二苯乙烯苷峰面积 ,计算得其 RSD
为 01954 %。
216 重现性试验 : 平行取样品 (批号 20081202)
6 份 ,进行测定 ,计算二苯乙烯苷的质量分数 ,结果
RSD 为 1191 %。
217 稳定性试验 :分别将供试品溶液于室温下放置
0、2、4、6、8 h 后 ,测定 ,计算得二苯乙烯苷峰面积的
RSD 为 1112 %。表明样品溶液在 8 h 内基本稳定。
218 回收率试验 :取本品 (批 20081202) 10 片 ,精密
称重 ,研细 ,取约 0125 g 共 6 份 ,精密称定 ,分别加
入 01068 7 mg/ mL 二苯乙烯苷对照品溶液 810、
1010、1210 mL ,依法制备供试品溶液 ,测定 ,计算 ,
结果平均回收率 98156 % ,RSD 为 01856 %。
219 溶出度的测定
21911 溶出介质及体积的选择[1 ] :因二苯乙烯苷量
有限 ,为保证检出量在限度范围内 , 选择《中国药
典》2005 年版溶出度第三法即小杯法 (溶液体积为
100 mL ,桨板法 ,转速为 100 r/ min) ,介质为水。
21912 溶出度测定方法的确定 :取本品 6 片 ,以脱
气的水 100 mL 为溶出介质 ,温度控制在 37 ℃±
015 ℃,转速 100 r/ min ,供试品进入释放池瞬间开
始记时 ,分别在 0、3、5、8、15、20、30、45 min 时取样
2 mL (同时补充等体积相同温度的溶出介质) ,用微
孔滤膜 (0145μm)滤过 ,取续滤液作为供试品溶液。
取供试品溶液 10μL ,注入液相色谱仪 ,测定二苯乙
烯苷 ,计算相对累积溶出率。
21913 溶出曲线的制备 :每批 6 片 ,按照以上条件
操作 ,分别在 0、3、5、10、15、20、30、45 min 时取样 2
mL (同时补充等体积相同温度的溶出介质) ,立即滤
过 ,续滤液高速离心后 ,取上清液进样 ,记录色谱图 ,
测定二苯乙烯苷相对累积溶出率。结果表明 ,降脂
灵分散片溶出曲线基本一致 ,二苯乙烯苷溶出率在
15 min 后均大于 70 % ,30 min 后基本溶出 (平均大
于 95 %) 。结果见图 1。
图 1 降脂灵分散片的溶出曲线
Fig. 1 Dissolution curve of Jiangzhiling dispersible tablets
2110 与市售降脂灵片溶出度的比较 :参照《中国药
典》2005 年版溶出度第三法即小杯法 (溶液体积为
100 mL ,浆板法 ,溶出介质为水 ,转速为 100 r/ min) ,
分别于 1、3、5、10、15、30、45 min 取 2 mL 的溶液 ,
并立即补 2 mL 的原溶剂 ,过滤 ,即得。分别进样 20
μL ,记录色谱图 ,结果见图 2。结果表明 ,降脂灵分
散片中二苯乙烯苷的溶出远远快于市售降脂灵片。
(下转第 626 页)
·785·中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 4 期 2010 年 4 月
图 2 T2DM 大鼠胰岛免疫组化染色结果
Fig. 2 Immunohistochemistry results of langerhans islands in T2DM rats
力下降 ,故糖尿病时机体氧化应激水平明显升高 ,氧
自由基产生增多并与 NO 结合 , 形成有害的
ONOO - ,引起血管内皮细胞等多方面损害[10 ] 。成
细华等[11 ]针对糖代谢及抗氧化应激方面 ,研究了左
归复方对转基因 2 型糖尿病小鼠的干预治疗作用。
根据实验结果推测 ,白背三七水提取物对 T2DM 的
作用机制可能与其能改善糖和脂质代谢 ,增强机体
对活性氧的清除能力 ,减轻氧自由基对胰岛β细胞
损害有关。胰岛β细胞 H E 染色和免疫组化形态学
观察的结果也表明 ,白背三七水提取物组的β细胞
和胞质内分泌颗粒相对较多 ,着色较深 ,且在外分泌
部腺泡细胞间可见到单个免疫反应阳性细胞 ,提示
白背三七水提取物除了对胰岛β细胞有一定的保护
作用 ,还可能促使胰岛β细胞的修复与增生。
参考文献 :
[ 1 ] 江苏新医学院1 中药大词典 [ M ]1 上册1 上海 :上海人民出
版社 , 19771
[ 2 ] 冼寒梅 , 周 蓉 , 刘 雯 , 等1 白子菜不同药用部位挥发油
的含量测定及其气相色谱2质谱联用分析 [J ]1 时珍国医国
药 , 2008 , 19 (4) : 85828591
[ 3 ] 胡 勇 , 李维林 , 林厚文 , 等1 白背三七地上部分降血糖作
用研究 [J ]1 西南林学院学报 , 2007 , 27 (1) : 552581
[ 4 ] 王津江 , 陈 磊 , 宋洪涛 , 等1 白背三七总黄酮的提取工艺
研究 [J ]1 中国药师 , 2009 , 12 (2) : 14621491
[ 5 ] 洪丽莉 , 许冠荪 , 申国明 , 等1 SD 大鼠 2 型糖尿病模型的建
立 [J ]1 中国比较医学杂志 , 2005 , 15 (6) : 37923811
[ 6 ] 周迎生 , 高 妍 , 李 斌 , 等1 高脂喂养联合链脲佐菌素注
射的糖尿病大鼠模型特征 [J ]1 中国实验动物学报 , 2005 ,
13 (3) : 15421591
[ 7 ] Talpur N , Echard B , Ingram C , et al . Effect s of a novel for2
mulation of essential oils on glucose2insulin metabolism in
diabetic and hypertensive rat s : a pilot study [J ]1 Diabetes
Obes Metab , 2005 , 7 (2) : 19321991
[ 8 ] Antonio C , Roberta A , Roberto D R , et al . Effect of atorv2
astatin and irbesartan , alone and in combination , on post2
prandial endot helial dysfunction , oxidative st ress , and in2
flammation in type 2 diabetic patient s [J ]1 Ci rculation ,
2005 , 111 : 2518225241
[ 9 ] Onozato M I , Tojo A , Goto A , et al . Oxidative st ress and
nit ric oxide synt hase in rat diabetic nephropat hy : effect of
ACEI and ARB [J ]1 Ki dney I nt , 2002 , 61 (1) : 18621951
[ 10 ] Meigs J B , Hu F B , Rifai N , et al . Biomarkers of endot helial
dysfunction and risk of type 2 diabete mellitus [J ]1 J A M A ,
2004 , 291 (16) : 1978219841
[ 11 ] 成细华 , 喻 荣 , 吴勇军 , 等 1 左归复方对 M KR 转基因 2
型糖尿病小鼠糖代谢及抗氧化应激的影响 [J ]1 中草药 ,
2008 , 39 (11) : 1675216791
(上接第 587 页)
图 2 样品和降脂灵片的溶出度比较
Fig. 2 Comparison of dissolution between sample
and Jiangzhiling Tablets
3 讨论
降脂灵分散片以制何首乌中二苯乙烯苷为有效
成分。分散片的特征是遇水可迅速崩解形成均匀的
混悬液 ,综合了片剂和液体制剂的优点 ,大剂量服用
方便、吸收快、生物利用度高。但崩解并不等于溶
出 ,所以对降脂灵分散片的溶出度进行了研究 ,并将
其加入质量标准中 ,从而更好地控制降脂灵分散片
的溶出情况。
参考文献 :
[ 1 ] 中国药典[ S]1 二部1 附录ⅩⅢC732741 20051
·626· 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 4 期 2010 年 4 月