全 文 ：何首乌叶愈伤组织的诱导和二苯乙烯苷含量的检测
范洪琼 (重庆三峡职业学院，重庆万州 404001)
摘要 ［目的］对何首乌叶进行愈伤组织诱导并检测叶愈伤组织中二苯乙烯苷的含量。［方法］在 25 ℃暗箱培养条件下，将何首乌叶在
含有浓度为 1 mg /L 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)和浓度为 0． 4 mg /L萘乙酸(NAA)的MS诱导培养基中进行诱导，15 d后把诱导出的愈伤
组织转接到相同培养基中培养 15 d，共转接 3次，并通过 HPLC法检测叶愈伤组织中二苯乙烯苷的含量。［结果］诱导出的愈伤组织生
长状况良好，并且测得叶愈伤组织中二苯乙烯苷的含量为 0． 37 mg /g。［结论］由叶诱导出的愈伤组织中含有二苯乙烯苷，该愈伤组织可
以用于进一步的生理生化研究。
关键词 何首乌(RADIX POLYGONI MULTIFLORI);愈伤组织;叶;二苯乙烯苷
中图分类号 S567． 23 + 9 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2011)32 －19759 －02
Induction of Leaf Callus and Detection of Stilbene Glucoside Content in RADIX POLYGONI MULTIFLORI
FAN Hong-qiong (Chongqing Three Gorges Polytechnic College，Chongqing 404001)
Abstract ［Objective］The aim was to carry out the induction of leaf callus and the detection of stilbene glucoside content in RADIX POLY-
GONI MULTIFLORI．［Method］Under dark culture conditions at 25 ℃，leaves of RADIX POLYGONI MULTIFLORI were cultured on MS me-
dium (1 mg /L 2，4-D + 0． 4 mg /L NAA)for 15 d． Then，the calluses induced were transferred 3 times into the same MS medium，with 15 d
for each transformation． Content of stilbene glucoside in leaf callus was detected by HPLC．［Result］Calluses induced grew well，and the con-
tent of stilbene glucoside in leaf callus was 0． 37 mg /g．［Conclusion］There was stilbene glucoside in leaf callus of RADIX POLYGONI MUL-
TIFLORI． And the leaf callus could be used for the further physiological and biochemical studies．
Key words RADIX POLYGONI MULTIFLORI;Callus;Leaf;Stilbene glucoside
作者简介 范洪琼(1969 － ) ，女，重庆人，副教授，从事生物化学研究，
E-mail:512195105@ qq． com。
收稿日期 2011-08-03
何首乌(RADIX POLYGONI MULTIFLORI)为蓼科(Po-
lygonaceae)植物何首乌(Polygonum multiflorum Thunb．)的
干燥块根，主产于我国广东、广西、贵州、安徽等省区，生长
在灌木丛或者林荫处。何首乌具有补肝肾、益精血、乌须
发、强筋骨之功效，是滋补肝肾的常用中药［1］。二苯乙烯苷
(全称为 2，3，5，4 -四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，2，
3，5，4– tetrahy- droxystilbene-2-O-β-D- glucoside，简称 stil-
bene glucoside )为何首乌的主要有效成分，《中华人民共和
国药典》(2005年版)一部将其作为何首乌药材的质量控制
指标，规定干药材含量不得少于 1． 0%(HPLC)。二苯乙烯
苷具有抗氧化、抗衰老、调节血脂、改善记忆、抗肿瘤、抑制
动脉粥样硬化、抗血栓、脑保护等功效［2 － 9］。笔者对何首乌
叶进行愈伤组织诱导，并通过 HPLC 测定叶愈伤组织中二
苯乙烯苷的含量，以期为何首乌叶的开发与利用提供理论
依据。
图 1 二苯乙烯苷结构
Fig． 1 The structure of stilbene glucoside
1 材料和方法
1． 1 材料
1． 1． 1 研究对象。何首乌(RADIX POLYGONI MULTIFLO-
RI) ，原产于广东德庆种植基地，引种后种植在广州军区总医
院苗圃，已经种植 3年，经鉴定为正品。
1． 1． 2 主要仪器。Waters 1525 高效液相色谱仪，购自美国
Waters公司;Waters 2487 双波长紫外检测器，Waters breeze
色谱工作站，色谱柱为 SunFireTM C18(4． 6 mm × 250 mm，5
μm) ，购自美国Waters公司。
1． 1． 3 主要试剂。W2，3，5，4 －四羟基二苯乙烯 － 2 － O － β
－ D － 葡萄糖苷对照品图 1，购自广东省药检所，批号:
200607;乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂为分析纯，
市售。
1． 2 方法
1． 2． 1 愈伤组织的诱导和继代。将何首乌叶用自来水冲洗
3次后再用蒸馏水冲洗 3次，然后用滤纸吸干水分，并在超净
工作台上用浓度 75%乙醇处理 1 min，再用无菌水冲洗 3次，
然后用浓度 0． 1% HgCl2 处理 10 min，接着用无菌水冲洗 3
次，并用无菌滤纸吸干水分。将干燥的叶片切成 0． 5 cm ×
0． 5 cm大小的方块，然后接种在含有浓度为 1 mg /L 2，4-D
和浓度为 0． 4 mg /L NAA 的 MS 培养基中(附加浓度为 300
mg /L 酸水解酪蛋白和浓度为 500 mg /L 脯氨酸) ，将培养基
置于人工气候箱中(25 ℃)暗培养。
1． 2． 2 色谱条件。色谱柱为 SunFireTM C18(4． 6 mm × 250
mm，5 μm) ，流动相为乙腈 －水(20∶80，V /V) ，检测波长为 320
nm，流速 1． 0 ml /min，进样量均为 20 μl。
1． 2． 3 方法学考察。
1． 2． 3． 1 线性关系的考察。精密称取二苯乙烯苷对照品
1． 6 mg于 10 ml容量瓶中，加无水乙醇至刻度，配成浓度为
160 μg /ml的溶液。分别取 0． 5 ml二苯乙烯苷对照品储备液
稀释成质量浓度为 20． 0、40． 0、80． 0、120． 0、160． 0 μg /ml 的
溶液，分别吸取 20 μl梯度浓度的对照品溶液，注入液相色谱
仪中，记录相应的峰面积值。以峰面积对质量浓度进行线性
回归，作标准曲线。
1． 2． 3． 2 精密度、稳定性、重现性试验。精密度试验:取二
苯乙烯苷溶液 20 μl，重复进样 5次，计算二苯乙烯苷峰面积
的 RSD;稳定性试验:取供试品溶液，于室温下放置，分别在
0、6、8、12、24 h测定，计算二苯乙烯苷的平均峰面积的 RSD;
重现性试验:平行制备 5份供试品溶液，按“1． 2． 3． 1”中方法
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2011，39(32):19759 － 19760，19792 责任编辑 石金友 责任校对 傅真治
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2011.32.216
测定并计算平均峰面积的 RSD。
1． 2． 3． 3 回收率试验。精密称取 5 份何首乌愈伤组织干
粉，每份为 0． 200 g，分别精密加入对照品各 50 μg，按
“1． 2． 3． 1”中方法测定并计算平均回收率和 RSD。
1． 2． 4 二苯乙烯苷的提取和测定。将何首乌叶愈伤组织在
60 ℃烘箱中烘 12 h，称取 0． 500 g干粉，加浓度 50%乙醇 25
ml，称定质量，超声处理 30 min(用冰冷却) ，共处理 2 次，再
次称定质量，用浓度 50% 乙醇补足减失的质量，摇匀，上清
液用微孔滤膜(0． 45 μm)过滤，滤液即为供试品溶液。用
“1． 2． 3． 1”的方法进行二苯乙烯苷的测定，根据峰面积和回
归方程计算二苯乙烯苷的含量。
2 结果与分析
2． 1 何首乌愈伤组织的诱导 叶在诱导培养基上生长 8 d
后即可看到有愈伤组织出现，继续培养直到 15 d后再转接到
相同培养基上进行继代培养，继代培养时间也是 15 d，共继
代培养 3次，最终的愈伤组织生长状况良好(图 2)。
图 2 何首乌叶愈伤组织
Fig． 2 Leaf callus of RADIX POLYGONI MULTIFLORI
2． 2 方法学考察
2． 2． 1 线性关系的考察。通过计算得出回归方程为 Y =
0．264 1X －0．480 9，R2 = 0．998 1，结果表明二苯乙烯苷在 20． 0
～160． 0 μg /ml 浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系
(图 3)。
图 3 二苯乙烯苷标准曲线
Fig． 3 The standard curve of stilbene glucoside
2． 2． 2 精密度、稳定性、重现性试验。精密度试验结果显
示，二苯乙烯苷峰面积的 RSD为 0． 11%(n = 5) ，表明仪器精
密度良好;稳定性试验结果显示，二苯乙烯苷的平均峰面积
的 RSD为 0． 30%(n =5) ，表明二苯乙烯苷在24 h内稳定;重
现性试验结果显示，二苯乙烯苷平均峰面积的 RSD 为
0． 64%，表明重现性良好。
2． 2． 3 回收率试验。计算二苯乙烯苷平均回收率为
98． 4%，RSD为 1． 68%(n =5)。表明该方法简捷、迅速、准确
度高，可用于何首乌叶中二苯乙烯苷的含量测定。
2． 3 何首乌叶愈伤组织二苯乙烯苷的含量测定 由图 4 可
知，对照品和供试品在相同位置有吸收峰，初步表明该吸收
峰对应的物质为二苯乙烯苷。经测定何首乌叶愈伤组织中
图 4 二苯乙烯苷对照品(a)和何首乌叶愈伤组织(b)HPLC色谱图
Fig． 4 HPLC chromatogram of the reference substance of stilbene glucoside (a)and the leaf callus of RADIX POLYGONI MULTIFLORI
(b)
二苯乙烯苷的含量为 0． 37 mg /g。
3 小结
何首乌根和茎中都存在二苯乙烯苷，曾有研究报道根和
茎诱导出的愈伤组织中二苯乙烯苷含量分别为 1． 5 mg /g和
0． 4 mg /g(湿重)［10］，而关于由叶诱导出的愈伤组织是否存
在二苯乙烯苷的研究鲜有报道。试验通过叶愈伤组织诱导
和 HPLC检测，发现叶愈伤组织中也存在二苯乙烯苷，其含
量为 0． 37 mg /g(湿重)。结果表明，何首乌根、茎、叶诱导出
的愈伤组织中均都含有二苯乙烯苷，以他们作为外植体诱导
出的愈伤组织都可以进行相同的生理生化研究。
参考文献
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(下转第 19792页)
06791 安徽农业科学 2011 年
验结果也表明，NaCl 溶液浓度为 4%时，香柏精油提取率极
显著高于其他水平，故认为 NaCl 溶液的最适浓度为 4%。
表 1 NaCl溶液的浓度对香柏精油提取率的影响
Table 1 Effect of NaCl solution concentration on the extraction rate of
essential oil from Thuja occidentalis L．(n =3)
序号
No．
NaCl溶液浓度
Concentr-
ation of NaCl
solution∥%
平均精油提取率
Average extraction
rate of ess-
ential oil∥ml /kg
差异显著性
Significance of difference
α =0． 05 α =0． 01
1 2 13． 2 c B
2 3 13． 8 bc B
3 4 18． 0 a A
4 5 15． 0 b B
5 6 14． 3 bc B
2． 2 料液比对香柏精油提取率的影响 结果表明，在料液
比不同的情况下，香柏精油的提取率变化幅度很小，料液比
为 1∶ 15(g /ml)时，精油提取率略高于其他水平，但差异不显
著。可能在料液比 1∶ 15(g /ml)的条件下，香柏枝叶粉末在
NaCl溶液中已经饱和，随着溶液体积的进一步增加，精油提
取率略微有所降低，可能是精油在水中的溶解量有所增加的
缘故。为节约资源，选取料液比 1∶ 15(g /ml)较为适宜。
表 2 料液比对香柏精油提取率的影响
Table 2 Effect of solid － liquid ratio on the extraction rate of essential
oil from Thuja occidentalis L．
序号
No．
料液比∥g /ml
Solid-liquid ratio
平均精油提取率
Average extraction
rate of essential oil∥ml /kg
1 1∶ 15． 0 17． 5
2 1∶ 17． 5 16． 5
3 1∶ 20． 0 16． 8
4 1∶ 22． 5 17． 2
表 3 浸泡时间对香柏精油提取率的影响
Table 3 Effect of soaking time on the extraction rate of essential oil
from Thuja occidentalis L．
序号
No．
浸泡时间
Soaking time
h
平均精油提取率
Average extraction
rate of ess-
ential oil∥ml /kg
差异显著性
Significance of difference
α =0． 05 α =0． 01
1 2 18． 5 ab A
2 3 18． 0 b AB
3 4 15． 7 c C
4 5 16． 3 c BC
5 6 19． 5 a A
2． 3 浸泡时间对精油提取量的影响 由表 3 可以看出，随
着浸泡时间的延长，4 h 后，精油提取量逐渐增加，浸泡 6 h
时，提取率高达 19． 5 ml /kg。可能是随着浸泡时间的延长，
香柏枝叶能够与 NaCl 溶液充分接触，细胞破碎更彻底。差
异显著性检验结果表明，NaCl 溶液浸泡 6 h时，香柏精油提
取率显著高于其他水平，所以确定的浸泡时间为 6 h。
2． 4 蒸馏时间对精油提取量的影响 表 4 结果显示，随着
蒸馏时间的延长，香柏精油的提取率逐渐升高，蒸馏 2 ～ 3 h，
精油提取率差异不显著，蒸馏4 h时，精油提取率极显著的高
于 2 h，蒸馏 5 h时，精油提取率比蒸馏 4 h时也有显著增加，
但还没有达到极显著水平。考虑到蒸馏时间的延长，不仅会
浪费能源，而且随着蒸馏时间的延长，还会有更多的副产物
产生，从而会影响到香柏精油的品质，所以在实际的提取中
认为以 4 h为宜。
表 4蒸馏时间对香柏精油提取率的影响
Table 4 Effect of distillation time on the extraction rate of essential oil
from Thuja occidentalis L．
序号
No．
蒸馏时间
Distillation time
h
平均精油提取率
Average extraction
rate of ess-
ential oil∥ml /kg
差异显著性
Significance of difference
α =0． 05 α =0． 01
1 2 17． 3 d D
2 3 18． 0 cd CD
3 4 18． 5 c BC
4 5 19． 3 b B
5 6 20． 8 a A
3 结论
适宜浓度的 NaCl 溶液不仅可以改变植物细胞的渗透
压，促进细胞破烈，从而使细胞内的包括精油在内的内含物
更多的渗透出来，而且还可以减少精油在水中的溶解度。以
NaCl溶液作为盐析试剂，通过单因素试验，得到提取香柏精
油的最佳工艺条件为浓度 4% NaCl 溶液，料液比 1∶ 15(g∶
ml) ，浸泡时间 6 h，蒸馏时间 4 h。该法具有操作简单，成本
低，且精油提取率高等优点，适合工业化生产。
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