全 文 ：地黄 Ａｕｘ／ＩＡＡ家族基因 ＲｇＩＡＡ１的克隆和表达分析
王丰青１，３，田云鹤１，李明杰２，杨金凤１，张宝３，林文雄３，陈新建２，张重义２，３
（１．河南农业大学 农学院，河南 郑州 ４５０００２；
２河南农业大学 中药材研究所，河南 郑州 ４５０００２；
３福建农林大学 中药材ＧＡＰ研究所，福建 福州 ３５０００２）
［摘要］ 为了克隆地黄Ａｕｘ／ＩＡＡ家族基因 ＲｇＩＡＡ１，分析地黄 ＲｇＩＡＡ１的时空表达特性及对逆境胁迫的响应。以拟南芥
ＡｔＩＡＡ１４的ｃＤＮＡ序列为探针在地黄转录组数据库中进行比对，应用生物信息学方法分析 ＲｇＩＡＡ１的序列特征及进化关系，以
实时荧光定量ＰＣＲ技术检测ＲｇＩＡＡ１在地黄不同组织以及逆境胁迫下的表达量。结果表明，获得１条９０３ｂｐ的 ｃＤＮＡ序列，
包含一个６８１ｂｐ完整的开放阅读框（ＯＲＦ），编码２２６个氨基酸，具有 Ａｕｘ／ＩＡＡ家族蛋白的典型结构域和特征序列。ＲｇＩＡＡ１
在地黄不同组织中的表达呈差异表达，其中在地黄幼嫩叶片里表达强度最大，其次为茎，且随着叶片的伸展，ＲｇＩＡＡ１表达强度
不断降低。在连作时ＲｇＩＡＡ１的表达量升高，ＮａＣｌ和渍水胁迫下ＲｇＩＡＡ１的表达量降低。实验首次克隆了地黄Ａｕｘ／ＩＡＡ家族基
因ＲｇＩＡＡ１，为阐明其在地黄生长发育和逆境胁迫中的分子功能奠定基础。
［关键词］ 地黄；Ａｕｘ／ＩＡＡ家族基因；序列特征；表达分析
［收稿日期］ ２０１３０５２７
［基金项目］ 国家自然科学基金项目（８１２７４０２２；３１２７１６７４）；中国
博士后科学基金项目（２０１３Ｍ５４１９７７）；河南农业大学大学生创新实
验计划项目（ＣＸ１２００７）
［通信作者］ 张重义，教授，博士生导师，Ｅｍａｉｌ：ｚｙｚｈａｎｇ＠ｆａ
ｆｕｅｄｕｃｎ
［作者简介］ 王丰青，博士，讲师，Ｅｍａｉｌ：ｈｅａｕｚｙｃｘｗ＠１２６ｃｏｍ
地黄 ＲｅｈｍａｎｎｉａｇｌｕｔｉｎｏｓａＬ为玄参科多年生
草本植物，以块根入药，为著名的“四大怀药”之一。
随着分子生物学技术的快速发展，地黄的基因信息
解析逐渐成为研究的热点。然而迄今为止，地黄基因
克隆的报道较少，有肌动蛋白基因片段［１］、ＲｇＰＲ２１０
基因［２］、转座酶基因［３］、扩展蛋白基因ＲｇＥＸＰＡ１［４］和
３酮酯酰ＣｏＡ硫解酶基因ＲｇｈＫＡＴ［５］等。
生长素可直接作用于细胞膜或细胞内组分，参
与植物整个生命周期的生长发育调控。生长素的信
号转导途径包括信号识别、生长素相关基因的表达
及植物表现生理响应［６］。Ａｕｘ／ＩＡＡ（ａｕｘｉｎ／ｉｎｄｏｌｅａ
ｃｅｔｉｃａｃｉｄｓｐｒｏｔｅｉｎ）和 ＡＲＦ（ａｕｘｉｎｒｅｓｐｏｎｓｅｆａｃｔｏｒ）是
生长素信号转导必需的两类转录因子家族［７］。
Ａｕｘ／ＩＡＡ在植物中有多个成员组成，如从拟南芥Ａｒ
ａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ、水稻 Ｏｒｙｚａｓａｔｉｖａ、毛果杨 Ｐｏｐｕｌｕｓ
ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ和高粱Ｓｏｒｇｈｕｍｂｉｃｏｌｏｒ中分别鉴定出２９，
３１，２５，２５个 Ａｕｘ／ＩＡＡ基因。Ａｕｘ／ＩＡＡ蛋白家族成
员多包含４个高度保守的结构域，结构域 Ｉ具有转
录抑制功能，结构域Ｉ能够维持Ａｕｘ／ＩＡＡ蛋白的稳
定性，结构域ＩＩ，ＩＶ负责与Ａｕｘ／ＩＡＡ蛋白或ＡＲＦ蛋
白形成同源和异源二聚体［８９］。薛建平等［１０］检测了
地黄不同组织、不同生长时期的ＩＡＡ含量，推测ＩＡＡ
调节特异的 ｍＲＮＡ合成，促进不定根膨大形成块
根。ＡｔＩＡＡ１４控制拟南芥的侧根发育［１１］，并且参与
缺磷响应［１２］，是一个重要的功能基因。为了研究
Ａｕｘ／ＩＡＡ基因在地黄生长发育的分子功能，本研究
以ＡｔＩＡＡ１４的 ｃＤＮＡ为查询序列，应用电子克隆结
合ＰＣＲ扩增技术，克隆了一个地黄 Ａｕｘ／ＩＡＡ基因，
命名为 ＲｇＩＡＡ１。应用生物信息学和实时荧光定量
ＰＣＲ方法，分析其序列特征和基因表达模式，为地黄
Ａｕｘ／ＩＡＡ基因在地黄块根膨大、活性成分积累以及逆境
胁迫等发育进程中的分子功能研究奠定基础。
１ 材料与方法
１１ 样品和胁迫处理 克隆基因和胁迫处理均选
用怀地黄优良品种“温８５５”为材料，经河南农业大
学高致明教授鉴定为 Ｒｇｌｕｔｉｎｏｓａ。所有实验材料
均种植在直径１４５ｃｍ、高１５５ｃｍ的聚乙烯塑料盆
里，在光照培养箱（ＬＲＨ３００Ｇ，广东医疗器械厂）里
生长，温度为２５℃，光照强度为２０００～４０００ｌｘ，光
照时数１４ｈ。
实验设置３种处理：①连作胁迫。以至少１０年
未种植过地黄的土壤为头茬栽培处理，以上年种植
过地黄的土壤为连作栽培处理。在头茬和连作处理
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的土壤中种植地黄种栽（块根），出苗后７０ｄ取叶片
用于基因表达检测。②盐胁迫。以２％的 ＮａＣｌ溶
液浇灌头茬土盆栽种植４５ｄ的无菌组培苗，１２ｈ后
取叶片用于表达分析。③渍水胁迫。自来水浇灌头
茬土盆栽种植４５ｄ的无菌组培苗，水层高于土表２
ｃｍ左右，连续３ｄ后取叶片用于表达分析。盐胁迫
和渍水胁迫均以未处理的无菌组培苗为对照。
１２ ＲＮＡ提取与反转录 从“温８５５”幼苗中提取
总ＲＮＡ。每个植物样品取材约５０ｍｇ，以Ｔｒｉｚｏｌ提取
液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，上海）提取地黄总 ＲＮＡ，提取方法参
考说明书进行。反转录采用反转录试剂盒（Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ，上海），用于 ｃＤＮＡ第一链合成需要 ３μｇ的
ＲＮＡ，０５μｇ的 Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１２１８引物，ＲＮａｓｅ抑制剂，
ＭＭＬＶ反转录酶，终体积为２０μＬ，３７℃条件下反
应５０ｍｉｎ，然后７０℃加热１５ｍｉｎ终止反应。
１３ 基因克隆 以拟南芥ＡｔＩＡＡ１４（ＮＭ＿１１７５３５４）
ｃＤＮＡ为查询序列，在本课题组前期测定的转录组
ＥＳＴ数据库中进行同源搜索，应用序列分析工具
ＤＮＡＭＡＮ和ＤＮＡＳＴＡＲ对获得的ＥＳＴ序列进行冗余
序列剔除和拼接，进行全长ＯＲＦ拼接。根据ｃＤＮＡ序
列设计特异引物５′ＡＴＧＧＡＧＡＴＴＧＡＧＣＧＴＧＡＧＧＡ３′
和 ５′ＴＣＡＡＣＡＡＡＡＴＣＣＴＡＧＴＣＣＡＡＴＧＧＣ３′，以 “温
８５５”的 ｃＤＮＡ产物为模板，用 ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＨＳＤＮＡ
聚合酶（Ｔａｋａｒａ，大连）进行 ＰＣＲ扩增，克隆 ＲｇＩＡＡ１
的编码序列（ＣＤＳ）。
ＰＣＲ扩增体系：５×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｂｕｆｅｒ（Ｍｇ２＋
ｐｌｕｓ）１０μＬ，ｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ（各 ２５ｍｍｏｌ·Ｌ－１）４
μＬ，正向引物和反向引物（１０μｍｏｌ·Ｌ－１）各１μＬ，
模板 ｃＤＮＡ０５μＬ，ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳＤＮＡ聚合酶
（２５Ｕ·μＬ－１）０５μＬ，灭菌蒸馏水至 ３３μＬ，共计
５０μＬ。反应条件：９８℃ １０ｓ，５５℃ ５ｓ，７２℃ １
ｍｉｎ，３０个循环；７２℃ １０ｍｉｎ。
ＰＣＲ产物经过加Ａ反应，纯化回收后连接到载
体ｐＭＤ１８Ｔｖｅｃｔｏｒ（Ｔａｋａｒａ，大连）上，送到深圳华大
基因研究院测序。
１４ 序列特征分析 以 ＮＣＢＩ在线分析工具 ＯＲＦ
Ｆｉｎｄｅｒ（ｈｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｇｏｒｆ．ｈｔ
ｍｌ）查找基因开放阅读框（ＯＲＦ）。应用 ＳＭＡＲＴ在
线工具（ｈｔｐ：／／ｓｍａｒｔ．ｅｍｂｌ．ｄｅ／）分析氨基酸序列结
构域，相似性搜索应用 ＮＣＢＩ在线软件 ＢＬＡＳＴ（ｈｔ
ｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）进行。氨基
酸多序列联配用ＣｌｕｓｔａｌＯｍｅｇａ（ｈｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．
ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｏ／），进化树构建利用在线分析
软件 ＭＡＦＦＴ（ｈｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／
ｍａｆｔ／），先进行多序列联配，保存 ＦＡＳＴＡ格式，然后
用ＭＥＧＡ５０２软件打开并以ＮｅｉｇｈｂｏｒＪｏｉｎｉｎｇ算法进
行ｂｏｏｔｓｔｒａｐｐｉｎｇ分析，构建系统发生树。
１５ 基因表达检测 时空表达模式分析：提取地黄
“温８５５”膨大初期块根、不定根、茎、幼嫩叶、展开
叶和衰老叶的总 ＲＮＡ，反转录成 ｃＤＮＡ模板，以
Ｒｇ１８Ｓ为内参基因，实时荧光定量 ＰＣＲ（ｑＲＴＰＣＲ）
方法检测基因的表达量。
胁迫下表达水平检测：提取不同胁迫处理叶片
的总 ＲＮＡ用于 ｑＲＴＰＣＲ检测。所用 ＰＣＲ仪为
ＢＩＯＲＡＤｉＱ５（伯乐，上海）。根据候选ＲｇＩＡＡ１基因
ＣＤＳ序 列 信 息 设 计 特 异 引 物 ５′ＧＴＧＧＴＴＣＴ
ＣＡＡＧＧＧＣＴＧＡＡＧ３′和 ５′ＣＣＡＴＧＧＡＡＣＡＴＣＡＣ
ＣＧＡＣＡＡ３′，以 Ｒｇ１８Ｓ作为内参基因，引物序列为
５′ＧＴＴＣＴＴＡＧＴＴＧＧＴＧＧＡＧＣＧＡＴＴ３′和 ５′ＣＡＧＡＣＣＴ
ＧＴＴＡＴＴＧＣＣＴＣＡＡＡＣ３′。实时荧光定量分析试剂盒
为ＳＹＢＲ ＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑＩ（ＴｌｉＲＮａｓｅＨＰｌｕｓ）（Ｔａｋａ
ｒａ，大连）。ＰＣＲ扩增体系：ＳＹＢＲ ＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑ１２５
μＬ，正向引物和反向引物（１０μｍｏｌ·Ｌ－１）各１μＬ，
ｃＤＮＡ模板２０μＬ，ｄｄＨ２Ｏ８５μＬ，共计２５μＬ。反应条
件：９５℃３０ｓ；９５℃５ｓ，６０℃３０ｓ，４０个循环。
２ 结果与分析
２１ ＲｇＩＡＡ１基因克隆 在转录组 ＥＳＴ数据库中，
通过同源搜索、拼接延伸，获得１条包含９０３个碱基
的ｃＤＮＡ序列，检索发现其包含１个６８１ｂｐ的开放
阅读框（ＯＲＦ），编码 ２２６个氨基酸，５′非编码序列
（ＵＴＲ）有２０６ｂｐ，３′ＵＴＲ有１６ｂｐ，命名为 ＲｇＩＡＡ１。
根据其编码区序列设计特异引物，以地黄叶片ｃＤＮＡ
为模板扩增出１条６８１ｂｐ的条带（图１）。
图１ 地黄ＲｇＩＡＡ１基因的ＰＣＲ扩增产物
Ｆｉｇ１ ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｏｆＲｇＩＡＡ１ｇｅｎｅｗｉｔｈｃＤＮＡ
ｔｅｍｐｌａｔｅ
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２２ ＲｇＩＡＡ１的序列特征 应用 ＥｘＰＡＳｙ（ｈｔｐ：／／
ｗｅｂｅｘｐａｓｙｏｒｇ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ／）计算发现 ＲｇＩＡＡ１蛋白
的相对分子质量为２４７ｋＤａ，等电点ｐＩ５４１。应用
ＳＭＡＲＴ在线工具分析其结构域，发现从第１０个氨
基酸到第２２５个氨基酸的 Ａｕｘ／ＩＡＡ家族蛋白结构
域。利用 ＲｇＩＡＡ１蛋白的氨基酸序列在 ＮＣＢＩ上进
行ＢＬＡＳＴＰ同源搜索，获得３０个扩展蛋白，分属２２
个植物物种。应用ＣｌｕｓｔａｌＯｍｅｇａ在线软件对３１个
蛋白进行多序列联配，结果表明，３１个 Ａｕｘ／ＩＡＡ蛋
白包含多个高度保守的结构域，其中结构域Ⅰ，Ⅱ，
Ⅲ和Ⅳ（图２）为 Ａｕｘ／ＩＡＡ蛋白功能结构域，在结构
域Ｉ和Ｉ之间还有１个由两部分氨基酸序列组成的
核定位信号（ＮＬＳ），结构域Ⅳ内也含有一个 ＮＬＳ。
次级结构预测表明，ＲｇＩＡＡ１及其同源蛋白还包含１
个β折叠和２个 α螺旋 α１和 α２组成的 βαα模体
（ｍｏｔｉｆ）。由此可见，ＲｇＩＡＡ１具有 Ａｕｘ／ＩＡＡ蛋白的
典型特征。
２３ 系统进化分析 在 ＮＣＢＩ上检索到２９个拟南
芥Ａｕｘ／ＩＡＡ家族蛋白，通过与ＲｇＩＡＡ１构建进化树，
发现 ＲｇＩＡＡ１与 ＡｔＩＡＡ１４（ＮＰ＿１９３１９１２），ＡｔＩＡＡ１６
（ＮＰ＿１８７１２４１），ＡｔＩＡＡ７（ＮＰ＿１８８９４５１），ＡｔＩＡＡ１７
（ＮＰ＿１７１９２１１）属于同一个亚家族 Ｉ（图３Ａ）。其
中与 ＡｔＩＡＡ１６序列相似程度最高，一致性达到
６４％，其次为ＡｔＩＡＡ１４，一致性达到６２％。
通过与ＲｇＩＡＡ１进行进化分析，结果表明，３１个
Ａｕｘ／ＩＡＡ可初步分为２个类群，小的类群包含４个
蛋白，来源于单子叶植物水稻、玉米 Ｚｅａｍａｙｓ、短柄
草Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ、粟米Ｓｅｔａｒｉａｉｔａｌｉｃａ；大的
类群包含２７个蛋白，分属于１９个物种，均为双子叶
植物。ＡｔＩＡＡ７，ＡｔＩＡＡ１４，ＡｔＩＡＡ１７，ＶｖＩＡＡ１４（ＸＰ＿
００２２８４１３３１），ＴｃＩＡＡ７（ＥＯＹ０５８８２１），ＴｃＩＡＡ１４
（ＥＯＹ０５８８３１），ＭｐＩＡＡ１４（ＢＡＨ１５０７１１），ＧｍＩＡＡ１４
（ＸＰ＿００３５５６３８９１）属于１个群组———ＧｒｏｕｐＩ；ＧｍＩ
ＡＡ２８（ＸＰ＿００３５２１２６８１），ＬｊＩＡＡ（ＡＦＫ３６０８６１），
ＲｃＩＡＡ２８（ＸＰ＿００２５２０９８０１），ＶｖＩＡＡ２８（ＸＰ＿
００２２８１７７１１）属于 １个群组———ＧｒｏｕｐＩ，应为
ＩＡＡ２８群组；ＡｔＩＡＡ１６（ＮＰ＿１８７１２４１），ＧｍＩＡＡ１６等
１２个蛋白属于１个群组———ＧｒｏｕｐＩＩ，应为 ＩＡＡ１６
群组。ＲｇＩＡＡ１属于双子叶植物，但是与其他双子叶
植物Ａｕｘ／ＩＡＡ蛋白亲缘关系相对较远，单独为一个
分支。与番茄 ＳｏｌａｎｕｍｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍＳｌＩＡＡ１６（ＸＰ＿
００４２３００９３１）和马铃薯 ＳｏｌａｎｕｍｔｕｂｅｒｏｓｕｍＳｔＩＡＡ３
（ＡＣＶ３１２０９１）的相似程度最高，一致性均为７０％
（图３Ｂ）。
２４ ＲｇＩＡＡ１的时空表达模式 实时荧光定量 ＰＣＲ
（ｑＲＴＰＣＲ）结果表明，ＲｇＩＡＡ１在地黄不同组织中的
表达呈差异表达，其中在地黄幼嫩叶片里表达强度
最大，其次为茎，且幼嫩叶片较茎中的表达量高
３７６倍。在不定根和衰老的叶片中表达都弱（图
４），其表达量分别为幼嫩叶片的１０％，１１％。而
且，从图４中可以看出，随着叶片的伸展，ＲｇＩＡＡ１表
达强度不断降低，说明ＲｇＩＡＡ１在叶片的伸展中发挥
重要的作用。在膨大的块根中表达相对较弱，显示
其在块根的发育过程中可能发挥的作用相对较小。
２５ 逆境胁迫下ＲｇＩＡＡ１的表达 为了探讨ＲｇＩＡＡ１
在逆境胁迫下与地黄发育的关系，以ｑＲＴＰＣＲ检测了
其在连作、２％ ＮａＣｌ和渍水处理等３种逆境下的表达
量。结果表明，在连作条件下，地黄叶片内ＲｇＩＡＡ１的
表达量显著升高。而在ＮａＣｌ和渍水胁迫下，地黄叶片
内ＲｇＩＡＡ１的表达量均显著降低，且ＮａＣｌ胁迫下的表
达降低程度达到极显著水平（图５）。
３ 讨论
Ａｕｘ／ＩＡＡ基因的功能相似性和差异主要是由它
们的编码的蛋白及其表达模式决定的［１３］。具有保
守的结构域是Ａｕｘ／ＩＡＡ家族蛋白的共有特征［９，１４］。
但是不同物种中均发现也有少数 Ａｕｘ／ＩＡＡ蛋白有
不同程度的保守结构域缺失，导致其被赋予新的功
能而不再参与生长素的信号响应，或者形成假基
因［１５］。拟南芥Ａｕｘ／ＩＡＡ蛋白 ＡＸＲ３的不同结构域
的功能缺失突变体表型发生不同程度的变异，证实
保守的结构域对于 Ａｕｘ／ＩＡＡ蛋白响应生长素信号
调节植物的生长发育极为重要［１６］。本研究以
ＡｔＩＡＡ１４的 ｃＤＮＡ为探针获得了 ＲｇＩＡＡ１的序列，进
化树 分 析 表 明，ＲｇＩＡＡ１与 拟 南 芥 ＡｔＩＡＡ７，
ＡｔＩＡＡ１４，ＡｔＩＡＡ１６，ＡｔＩＡＡ１７的同源性虽然都比较
高，但与 ＡｔＩＡＡ１６的同源性最高（图 ３Ａ），说明
ＲｇＩＡＡ１是ＡｔＩＡＡ１６的直系同源基因。不同物种同源
蛋白的进化分析表明，ＲｇＩＡＡ１与双子叶植物 Ａｕｘ／
ＩＡＡ蛋白的序列相似度较高，与单子叶植物 Ａｕｘ／
ＩＡＡ蛋白的序列相似度较低，符合物种进化规律。
基因的表达特性与其功能之间密切相关。虽然
不同的Ａｕｘ／ＩＡＡ蛋白功能存在差异，但是 Ａｕｘ／ＩＡＡ
基因功能特异性主要受转录水平的调控［１７］。研究
表明，拟南芥、水稻、玉米、番茄等物种的多个 Ａｕｘ／
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划线部分为保守结构域Ｉ，Ｉ，ＩＩ，ＩＶ；序列上部方框的氨基酸为预测的核定位信号；Ｒｇ地黄；Ｓｔ马铃薯；Ｐｍ大车前；Ｇｍ大豆；Ａｔ拟南芥；Ｒｃ
蓖麻；Ｖｖ葡萄；Ｇｈ棉花；Ｐｔ毛果杨；Ｂｒ蔓菁；Ｒｃ蓖麻；Ｓｌ番茄；Ｓａ独脚金；Ｌｊ百脉根；Ｉｎ牵牛花；Ｚｍ玉米；Ｏｓ水稻；Ｔｃ可可；Ｍｄ苹
果；Ｃａ鹰嘴豆；Ｍｐ，海棠；Ｂｄ短柄草；Ｓｉ粟米。
图２ ＲｇＩＡＡ１与不同植物Ａｕｘ／ＩＡＡ家族蛋白的多序列联配
Ｆｉｇ２ ＡｌｉｇｎｍｅｎｔｏｆＡｕｘ／ＩＡＡｆａｍｉｌｙｍｅｍｂｅｒｓｆｒｏｍｄｉｆｅｒｅｎｔｐｌａｎｔｓ
ＩＡＡ基因在不同组织中或在外源生长素和光刺激下
呈差异表达［１６，１８２０］。本实验发现 ＲｇＩＡＡ１在地黄的
幼嫩叶片里表达量最高，其次为茎。随着叶片的展
开、衰老，ＲｇＩＡＡ１的表达量不断降低，这与随着草莓
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ＡＲｇＩＡＡ１与拟南芥Ａｕｘ／ＩＡＡ蛋白的进化树；ＢＲｇＩＡＡ１和不同植物同源蛋白的进化树；在每个节点的数字为１０００次自引导值中该节点存在的
百分数。
图３ 用ＭＥＧＡ５０２软件构建的ＲｇＩＡＡ１和不同物种同源蛋白的进化树
Ｆｉｇ３ ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｏｆＲｇＩＡＡ１ａｎｄｉｔｓｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｐｒｏｔｅｉｎｓｗａｓｇｅｎｅｒａｔｅｄｂｙｔｈｅｎｅｉｇｈｂｏｒｊｏｉｎｉｎｇｍｅｔｈｏｄｕｓｉｎｇｓｏｆｔｗａｒｅｏｆＭＥＧＡ
５０２
ＴＲ膨大期块根；ＡＲ不定根；Ｓ茎；ＹＬ未展开幼嫩叶片；ＵＬ初
展开叶片；ＳＬ处于衰老期叶片。
图４ ＲｇＩＡＡ１在地黄不同组织中的表达量
Ｆｉｇ４ ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＲｇＩＡＡ１ｇｅｎｅｉｎｄｉｆｅｒｅｎｔｔｉｓｓｕｅｓｏｆＲｅｈ
ｍａｎｎｉａｇｌｕｔｉｎｏｓａ
Ｆｒａｇａｒｉａ×ａｎａｎａｓａｃｖＴｏｙｏｎａｋａ果实发育ＦａＩＡＡ１，
ＦａＩＡＡ２的表达量不断降低一致［２１］。薛建平等［１０］发
现ＩＡＡ在地黄叶和茎中含量较高，而在块根中含量
较低，认为高浓度的 ＩＡＡ有利于延缓叶片的衰老，
从而有更多的光合产物形成并转运到根部参与块根
的形成。
Ａｕｘ／ＩＡＡ基因不但能够对外源激素和光刺激作
Ｐ＜００５；Ｐ＜００１。
图５ 逆境胁迫条件下ＲｇＩＡＡ１的相对表达量
Ｆｉｇ５ ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＲｇＩＡＡ１ｏｆＲｅｈｍａｎｎｉａｇｌｕｔｉｎｏｓａｕｎｄｅｒ
ｔｈｒｅｅｓｔｒｅｓｓｅｓ
出响应，在逆境胁迫下的转录水平也会发生改变。
Ｓｏｎｇ等［２２］分析了不同逆境胁迫下的水稻 Ａｕｘ／ＩＡＡ
家族基因表达谱，发现干旱和盐胁迫下多个基因呈
上调或下调表达。Ｊａｉｎ等［２３］发现高盐条件下水稻
ＯｓＩＡＡ９，ＯｓＩＡＡ２０的上调表达。Ｗａｎｇ等［２４］在盐处理
的高粱根中也观察到 ＳｂＩＡＡ２，ＳｂＩＡＡ２４的差异表达。
ａｋｉｒ等［２５］则发现葡萄 ＶｉｔｉｓｖｉｎｉｆｅｒａＶｖＩＡＡ４在盐和
干旱胁迫后 ０～２４ｈ的表达量不断降低。本实验
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中，ＲｇＩＡＡ１在连作下表达量升高，而在盐和渍水胁
迫下表达量降低。连作也是一种胁迫［２６］，连作地黄
表现产量降低、品质变差等［２７］。淹水和盐胁迫也是
不利地黄生长的主要环境因素。虽然３种逆境对于
地黄的生长发育均是不利的，但是，相对而言渍水和
盐胁迫对地黄的伤害较大，盐处理８ｈ、渍水处理３ｄ
后部分叶片开始萎蔫，而连作胁迫对地黄的伤害是
一种相对缓慢的过程，一般出苗后３０～５０ｄ才会出
现生长受阻的表型。因此，ＲｇＩＡＡ１转录水平可能与
地黄响应３种不同逆境的分子机制有关，具体原因
有待于进一步研究。已经构建了 ＲｇＩＡＡ１的过量表
达和抑制表达载体，目前正在进行遗传转化，以期从
分子水平揭示ＲｇＩＡＡ１调控地黄产量、品质形成和响
应逆境胁迫的分子功能。
［致谢］ 徐伟、马萌辉和闫士猛同学协助完成地黄逆
境胁迫处理工作。
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·８３０４·
第３８卷第２３期
２０１３年１２月
Ｖｏｌ３８，Ｉｓｓｕｅ ２３
Ｄｅｃｅｍｂｅｒ，２０１３
ＭｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆａｎＡｕｘ／ＩＡＡｇｅｎｅ
（ＲｇＩＡＡ１）ｆｒｏｍＲｅｈｍａｎｎｉａｇｌｕｔｉｎｏｓａ
ＷＡＮＧＦｅｎｇｑｉｎｇ１，３，ＴＩＡＮＹｕｎｈｅ１，ＬＩＭｉｎｇｊｉｅ２，ＹＡＮＧＪｉｎｆｅｎｇ１，ＺＨＡＮＧＢａｏ３，
ＬＩＮＷｅｎｘｉｏｎｇ３，ＣＨＥＮＸｉｎｊｉａｎ２，ＺＨＡＮＧＺｈｏｎｇｙｉ２，３
（１ＡｇｒｏｎｏｍｙＣｏｌｅｇｅｏｆＨｅｎａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ４５０００２，Ｃｈｉｎａ；
２ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎａｌＭａｔｅｒｉａｌｓ，ＨｅｎａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ４５０００２，Ｃｈｉｎａ；
３ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣｈｉｎｅｓｅｃｒｕｄｅＤｒｕｇｓＧＡＰ，ＦｕｊｉａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｆｕｚｈｏｕ３５０００２，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ ＴｏｃｌｏｎｅａｎｄａｎａｌｙｚｅａｍｅｍｂｅｒｏｆｔｈｅＡｕｘｉｎ／ｉｎｄｏｌｅ３ａｃｅｔｉｃａｃｉｄ（Ａｕｘ／ＩＡＡ）ｇｅｎｅｆａｍｉｌｙ，ＲｇＩＡＡ１，ｆｒｏｍＲｅｈｍａｎ
ｎｉａｇｌｕｔｉｎｏｓａ．ＴｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌＥＳＴｄａｔａｂａｓｅｏｆＲ．ｇｌｕｔｉｎｏｓａｗａｓｕｓｅｄｔｏｃｌｏｎｅｔｈｅｎｅｗＡｕｘ／ＩＡＡｇｅｎｅｂｙｃＤＮＡｐｒｏｂｅｏｆＡｔＩＡＡ１４．
ＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓｗａｓａｐｐｌｉｅｄｔｏａｎａｌｙｚｅｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆＲｇＩＡＡ１ｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｃｏｎｓｔｒｕｃｔｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｓ．ＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＲＴ
ＰＣＲｈａｓｂｅｅｎａｐｐｌｉｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＲｇＩＡＡ１ｉｎｓｅｖｅｎｔｉｓｓｕｅｓａｓｗｅｌａｓｉｎｌｅａｖｅｓｕｎｄｅｒｔｈｒｅｅｓｔｒｅｓｓｅｓ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓ
ｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ，ｔｈｅｃＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＲｇＩＡＡ１ｃｏｎｔａｉｎｓ９０３ｂｐｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄ．Ｔｈｅｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ（ＯＲＦ）ｏｆＲｇＩＡＡ１ｗａｓ６８１ｂｐｅｎ
ｃｏｄｉｎｇ２２６ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ，ｗｈｉｃｈｈａｓｔｙｐｉｃａｌｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｄｏｍａｉｎｓａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＡｕｘ／ＩＡＡｆａｍｉｌｙｐｒｏｔｅｉｎｓ．ＲｇＩＡＡ１ｓｈｏｗｅｄ
ｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｉｎｕｎｆｏｌｄｅｄｌｅａｆ，ｆｏｌｏｗｅｄｂｙｔｈｅｓｔｅｍ．ＡｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＲｇＩＡＡ１ｗａｓｑｕｉｃｋｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄｗｉｔｈｌｅａｆｇｒｏｗ
ｉｎｇｕｐ．Ｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｌｅｖｅｌｉｎｃｒｅａｓｅｄｕｎｄｅｒｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｃｒｏｐｐｉｎｇｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｗｈｉｌｅｉｔｒｅｄｕｃｅｄｂｏｔｈｉｎｓａｌｉｎｉｔｙａｎｄｗａｔｅｒｌｏｇｇｉｎｇｓｔｒｅｓ
ｓｅｓ．ＲｇＩＡＡ１，ａｎＡｕｘ／ＩＡＡｇｅｎｅｆｒｏｍＲ．ｇｌｕｔｉｎｏｓａｈａｓｂｅｅｎｏｂｔａｉｎｅｄｆｏｒｔｈｅｆｉｒｓｔｔｉｍｅ，ｗｈｉｃｈｃａｎｌａｙｔｈｅｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｓｔｕｄｉｅｓ
ａｂｏｕｔｉｔｓｍｏｌｅｃｕｌａｒｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｒｅｓｐｏｎｓｅｓｔｏｓｔｒｅｓｓ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ Ｒｅｈｍａｎｎｉａｇｌｕｔｉｎｏｓａ；Ａｕｘ／ＩＡＡｇｅｎｅ；ｓｅｑｕｅｎｃｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ；ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ
ｄｏｉ：１０．４２６８／ｃｊｃｍｍ２０１３２３０８
［责任编辑 吕冬梅］
·９３０４·
第３８卷第２３期
２０１３年１２月
Ｖｏｌ３８，Ｉｓｓｕｅ ２３
Ｄｅｃｅｍｂｅｒ，２０１３