全 文 ：人参铜锌超氧化物歧化酶原核表达
载体的构建、表达及纯化
林红梅１，王泽玉２，邵癑２，秦晓晔２，刘诗超３，张鑫３，杨利民１
（１吉林农业大学 中药材学院，吉林 长春 １３０１１８；２长春中医药大学 附属医院，吉林 长春１３００２１；
３长春中医药大学 研发中心，吉林 长春 １３０１１７）
［摘要］　研究提取人参叶中的总ＲＮＡ，采用ＲＴＰＣＲ扩增人参叶Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ基因，构建ｐＥＴ２８（ａ）Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ原核表达
载体。使用ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）感受态细胞进行ＩＰＴＧ诱导表达。利用镍离子亲和层析进行纯化，并采用黄嘌呤氧化
酶法测定目的蛋白的酶活。经ＲＴＰＣＲ扩增的人参Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ基因序列与ＧｅｎＢａｎｋ数据库中公布的高丽参Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ基因
序列同源性为９９００％。经ＩＰＴＧ诱导，目的蛋白的表达量约为４４４２％，相对分子质量为１６３０ｋＤａ。纯化后的蛋白酶活可达
到１０５９６６９Ｕ·ｍｇ－１。通过分子生物学方法，成功构建了人参ｐＥＴ２８（ａ）Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ原核表达载体，为进一步研究人参Ｃｕ／
ＺｎＳＯＤ生物学功能奠定了基础。
［关键词］　人参；Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ；原核表达
［收稿日期］　２０１３１０１４
［基金项目］　国家自然科学基金面上项目（８１３７３９３７，３１２７０３７１）；
国家科技支撑计划项目（２０１１ＢＡＩ０３Ｂ０１）
［通信作者］　秦晓晔，Ｔｅｌ：（０４３１）８６１７２３００，Ｅｍａｉｌ：１１４１９３５３６＠
ｑｑｃｏｍ
［作者简介］　林红梅，讲师，主要从事药用植物资源生态方面研究，
Ｅｍａｉｌ：ｂａｏｌｉｎｈｍ＠１２６ｃｏｍ
　　人参为五加科 Ａｒａｌｉａｃｅａｅ植物人参 Ｐａｎａｘｇｉｎ
ｓｅｎｇＣＡＭｅｙ的干燥根及根茎，是我国名贵中药。
现代研究表明人参中富含皂苷、挥发油、蛋白质、糖
类、脂肪酸、无机元素等多种化学成分［１２］。超氧化
物歧化酶（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅ，ＳＯＤ）是一种能清
除生物体内产生的超氧阴离子自由基（Ｏ－·２）的金属
蛋白酶类［３］，广泛存在于一切生物体内。该酶具有
抗氧化、抗炎、抗衰老和抗癌等多种药理作用［４６］。
ＳＯＤ根据辅基部位结合的金属离子的不同，可分为
Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ，ＦｅＳＯＤ，ＭｎＳＯＤ，其中 Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ是
平衡机体 Ｏ－·２ 的主要蛋白
［７８］。以往对人参化学成
分的研究大多集中于皂苷、糖类以及挥发性成分，而
对人参Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ的研究报道很少。本研究从人
参叶中克隆 Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ基因，构建 ｐＥＴ２８（ａ）Ｃｕ／
ＺｎＳＯＤ表达载体并诱导其表达，经镍离子亲和层析
纯化目的蛋白，为探索人参Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ产业化工艺
流程以及进一步研究人参Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ生物学功能提
供试验依据。
１　材料与方法
１１　人参
实验用吉林人参叶采自吉林农业大学人参种植
试验田，经杨利民教授鉴定为五加科植物人参的叶。
大 肠 杆 菌 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＤＨ５α，ＥｃｏｌｉＢＬ２１
（ＤＥ３），克隆质粒 ｐＭＤ１８ＴＶｅｃｔｏｒ，原核表达质粒
ｐＥＴ２８（ａ）Ｖｅｃｔｏｒ，ＡＭＶ逆转录试剂盒，限制性内切
酶ＸｈｏⅠ，ＮｃｏⅠ，质粒提取试剂盒，ＤＮＡ胶回收试剂
盒购自ＴａＫａＲａ公司；ＴＲｉｚｏｌＲｅａｇｅｎｔ购自 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
公司；镍离子亲和色谱柱购自Ｑｉａｇｅｎ公司。
１２　人参叶总ＲＮＡ的提取［９］
将采摘的新鲜人参叶清洗后迅速放入液氮中，
快速研磨成粉末。取１００ｍｇ粉末加入１ｍＬＴＲｉｚｏｌ
试剂，剧烈吹打混匀，低温静置５ｍｉｎ，加入２００μＬ
氯仿，剧烈混匀，低温静置２ｍｉｎ，离心，吸取无色水
相至另一 ＥＰ管中，加入等体积异丙醇，混匀，低温
静置１０ｍｉｎ，沉淀ＲＮＡ，离心１５ｍｉｎ。吸去上清，沉
淀用１ｍＬ７５％乙醇洗涤，离心１５ｍｉｎ，弃去上清，挥
干乙醇，并使用１％琼脂糖凝胶电泳检测ＲＮＡ。
１３　目的基因片段的ＲＴＰＣＲ扩增
１３１　特异引物的设计　根据 Ｇｅｎｂａｎｋ中的高丽
参Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ基因序列（ＡＡＢ８７５７２１），设计基因
片段的５′端和３′端，上游引物为５′ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧ
ＡＴＧＧＴＧＡＡＧＧＣＴＧＴＣＡ３′（标记部分为 ＮｃｏⅠ酶切
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位点），下游引物为５′ＣＣＣＴＣＧＡＧＡＣＣＣＴＧＣＡＧＣ
ＣＣＡＡＴＧＡ３′（标记部分为 ＸｈｏⅠ酶切位点）。委托
上海捷瑞生物工程有限公司合成。
１３２　ＲＴＰＣＲ扩增和测序　按照 ＡＭＶ逆转录试
剂盒说明书进行操作，扩增目的基因。ＰＣＲ参数为
９５℃ ５ｍｉｎ，９５℃ ４５ｓ，６０℃ ４５ｓ，７２℃ ５０ｓ循环
３０次，７２℃８ｍｉｎ。使用１％琼脂糖凝胶电泳检测，
经ＤＮＡ胶回收试剂盒回收 ＰＣＲ产物，与克隆质粒
ｐＭＤ１８Ｔ进行连接，构建克隆载体ｐＭＤ１８ＴＣｕ／Ｚｎ
ＳＯＤ并转化至感受态 ＥｃｏｌｉＤＨ５α中，筛选阳性菌
落，委托北京华大基因公司进行测序。
１４　重组表达载体的构建［１０］
将测序正确的重组质粒 ｐＭＤ１８ＴＣｕ／ＺｎＳＯＤ
和ｐＥＴ２８（ａ）分别进行 ＮｃｏⅠ和 ＸｈｏⅠ双酶切，将
Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ与ｐＥＴ２８（ａ）进行连接，并转化至Ｅｃｏｌｉ
ＢＬ２１（ＤＥ３）感受态细胞中，鉴定并筛选阳性克隆
菌株。
１５　目的蛋白的表达
将阳性克隆菌株和含ｐＥＴ２８（ａ）空质粒对照菌
分别接种到２ｍＬＬＢ（含有１００ｍｇ·ｇ－１Ｋａｎ）液体培
养基里，３７℃恒温，２００ｒ·ｍｉｎ－１过夜，次日以１∶１００
的比例接种到ＬＢ（含有１００ｍｇ·ｇ－１Ｋａｎ）液体培养
基里，３７℃恒温，２００ｒ·ｍｉｎ－１培养至Ａ６００约为０６，
加入终浓度为１ｍｍｏｌ·Ｌ－１的 ＩＰＴＧ进行诱导，分别
取诱导时间为０５，１，２，３，４，５ｈ的菌体溶液１ｍＬ，离
心取沉淀，进行电泳检测，优选最佳表达条件。
１６　目的蛋白的纯化
将菌体沉淀用细胞裂解液和溶解酶进行破碎，
得到包涵体沉淀，用 ＴｒｉｔｏｎＸ１００进行洗涤，使用不
同浓度（浓度为０５，１，２，５ｍｏｌ·Ｌ－１）的尿素溶液
进行复性，优选最佳浓度，经透析除盐，冻干。冻干
样品溶液与镍离子色谱柱结合，使用咪唑溶液进行
洗脱，分别收集每个洗脱峰，并进行ＳＤＳＰＡＧＥ电泳
检测，确定最佳洗脱条件。
１７　目的蛋白的酶活检测
采用Ｂｒａｄｆｏｒｄ法进行蛋白含量的测定，采用黄
嘌呤氧化酶法测定目的蛋白的活力。
２　结果
２１　人参Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ基因的克隆及测序
人参叶总ＲＮＡ经电泳检测，条带清晰明亮，无
降解，见图１。ＲＴＰＣＲ扩增结果见图２，电泳结果显
示，在约 ４６４ｂｐ处出现与预期大小一致的单一条
带。测序结果与ＮＣＢＩ上公布的高丽参 Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ
对比，其同源性为 ９９％。目的基因与质粒 ｐＥＴ２８
（ａ）连接成功后，经 ＮｃｏⅠ和 ＸｈｏⅠ双酶切，电泳结
果显示，在约５２２５，４６４ｂｐ处出现预期大小的２条
带，说明载体构建成功，见图３。目的基因的基因编
码氨基酸序列，经 ＤＮＡＭＡＮ程序进行氨基酸翻译，
共 有 １５４ 个 氨 基 酸。经 网 络 程 序 ｈｔｐ：／／
ｗｗｗｅｘｐａｓｙｏｒｇ／ｃｇｉｂｉｎ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ预测，１５４个氨基
酸相对分子质量为１５４６ｋＤａ，加上组氨酸标签翻
译的氨基酸相对分子质量０８４ｋＤａ，目的蛋白的相
对分子质量为１６３０ｋＤａ。
１人参叶总ＲＮＡ；２ＤＬ２０００Ｍａｋｅｒ（自上而下依次为２０００，１０００，
７５０，５００，２５０，１００ｂｐ）。
图１　人参叶总ＲＮＡ核酸电泳图
Ｆｉｇ１　ＥｌｅｃｒｏｐｈｏｒｅｔｏｇｒａｍｏｆｔｏｔａｌＲＮＡｆｒｏｍｇｉｎｓｅｎｇｌｅａｆ
１Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ基因片段；２ＤＬ２０００Ｍａｋｅｒ（自上而下依次为２０００，
１０００，７５０，５００，２５０，１００ｂｐ）。
图２　人参Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ基因ＰＣＲ扩增后产物核酸电泳图
Ｆｉｇ２　Ｅｌｅｃｒｏｐｈｏｒｅｔｏｇｒａｍｏｆａｍｐｌｉｆｅｄｐｒｏｄｕｃｔｏｆｔｈｅｇｉｎｓｅｎｇ
Ｃｕ／ＺｎＳＯＤｇｅｎｅ
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１质粒ｐＥＴ２８（ａ）片段和Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ片段；２ＤＬ５０００Ｍａｋｅｒ（自上而下
依次为５０００，３０００，２０００，１５００，１０００，７５０，５００，２５０，１００ｂｐ）。
图３　ｐＥＴ２８（ａ）Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ双酶切电泳图
Ｆｉｇ３　ＥｌｅｃｒｏｐｈｏｒｅｔｏｇｒａｍｏｆｐＥＴ２８（ａ）Ｃｕ／ＺｎＳＯＤｄｉｇｅｓｔｅｄ
ｂｙＮｃｏⅠａｎｄＸｈｏⅠ
２２　人参Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ的表达及纯化
含有重组子的菌株接种到 ＬＢ液体培养基后，
在培养３ｈ时达到其对数生长期，此时进行ＩＰＴＧ诱
导表达，当诱导表达至４ｈ时达到最大表达量，见图
４。其电泳图经凝胶图像分析系统分析，表达量约为
４４４２％。诱导后的菌体沉淀进行破壁处理得到包
涵体沉淀，使用 ＴｒｉｔｏｎＸ１００洗涤３次时效果较好，
使用２ｍｏｌ·Ｌ－１尿素溶液复性时包涵体沉淀的溶解
性较好。处理好的样品与镍离子亲和色谱柱结合，
选用２０ｍｍｏｌ·Ｌ－１咪唑浓度为最佳洗脱浓度，纯化
后的目的蛋白经电泳检测呈单一条带，见图５。
１对照菌诱导０５ｈ；２重组菌诱导０５ｈ；３对照菌诱导１ｈ；４重
组菌诱导１ｈ；５对照菌诱导２ｈ；６重组菌诱导２ｈ；７对照菌诱导
３ｈ；８重组菌诱导３ｈ；９对照菌诱导４ｈ；１０重组菌诱导４ｈ；
１１对照菌诱导５ｈ；１２重组菌诱导５ｈ；ＭＭａｋｅｒ（自上而下依次
为９７２，６６４，４４３，２９０，２０１，１４３ｋＤａ）。
图４　不同诱导时间ＳＤＳＰＡＧＥ电泳图
Ｆｉｇ４　ＳＤＳＰＡＧＥｅｌｅｃｒｏｐｈｏｒｅｔｏｇｒａｍｏｆｓｔｒａｉｎｓｉｎｄｕｃｅｄａｔｄｉｆ
ｆｅｒｅｎｔｔｉｍｅ
ＭＭａｋｅｒ（自上而下依次为９７２，６６４，４４３，２９０，２０１，１４３ｋＤａ）；
１粗酶液；２流穿；３目的蛋白。
图５　人参Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ纯化后ＳＤＳＰＡＧＥ电泳图
Ｆｉｇ５　ＳＤＳＰＡＧＥｅｌｅｃｒｏｐｈｏｒｅｔｏｇｒａｍｏｆｐｕｒｉｆｉｅｄＣｕ／ＺｎＳＯＤ
２３　人参Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ的酶活
纯化后的目的蛋白经Ｂｒａｄｆｏｒｄ法测定其蛋白含
量，以牛血清白蛋白为标准品，绘制标准曲线，回归
方程为 Ｙ＝０１３８６Ｘ ＋００２１６，相关系数 ｒ＝
０９９２１。经黄嘌呤氧化酶法测定目的蛋白的酶活
为１０５９６６９Ｕ·ｍｇ－１。
３　讨论
本研究选用的ｐＥＴ２８（ａ）载体是高效原核表达
载体，具有Ｔ７启动子，在没有诱导剂存在时，由 ｌａｃＩ
的基因产物（阻遏物）与操纵区ｌａｃＯ结合，阻止基因
的转录，目的蛋白不表达，而加入诱导剂后，阻遏物
离开操纵区，质粒上受Ｔ７启动子控制的含目的蛋白
基因的ＤＮＡ被转录，目的蛋白开始表达［１１］。根据
ｐＥＴ２８（ａ）载体的多克隆酶切位点区，选取 ＮｃｏⅠ和
ＸｈｏⅠ作为酶切位点，设计特异引物，并保留其组氨
酸标签序列，便于目的蛋白的纯化。
原核表达体系在高效表达外源基因时，表达蛋
白常常在细胞内聚集形成包涵体。本研究中，包涵
体采用溶菌酶方法进行破菌处理，取得了较好效果，
包涵体经离心沉淀后使用 ＴｒｉｔｏｎＸ１００洗涤，去除
了破菌后残留的膜蛋白。由于包涵体中的蛋白大部
分都失去了天然的空间结构，分子紧密积聚成颗粒
状，其溶解性很差，本文通过实验验证，使用２ｍｏｌ·
Ｌ－１尿素可以很好的溶解包涵体，少量的变性剂经短
暂透析即可除去，使表达蛋白恢复到三维空间结构，
便于下一步的纯化及活性检测。
固相金属亲和色谱是近２０年发展起来的一项
新型分离技术，目前已逐渐成为分离纯化蛋白质等
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生物工程产品最有效的技术之一［１２］。本研究选择
镍离子亲和色谱纯化目的蛋白，具有特异性好、化学
和物理稳定性好、批次重复性好等特点。
本文成功构建了人参 ｐＥＴ２８（ａ）Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ
原核表达载体，并且表达量高，纯化工艺简便，便于
大量生产，为进一步研究人参Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ生物学功
能奠定了基础，同时为有效利用人参资源提供一条
新的途径和思路。
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Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄ
ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｇｉｎｓｅｎｇＣｕ／Ｚｎｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅ
ＬＩＮＨｏｎｇｍｅｉ１，ＷＡＮＧＺｅｙｕ２，ＳＨＡＯＹｕｅ２，ＱＩＮＸｉａｏｙｅ２，ＬＩＵＳｈｉｃｈａｏ３，ＺＨＡＮＧＸｉｎ３，ＹＡＮＧＬｉｍｉｎ１
（１ＣｏｌｅｇｅｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎａｌ，ＪｉｌｉｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ１３０１１８，Ｃｈｉｎａ；
２ＴｈｅＡｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｔｏＣｈａｎｇｃｈｕｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ１３００２１，Ｃｈｉｎａ；
３ＣｈａｎｇｃｈｕｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＣｅｎｔｅｒ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ１３０１１７，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］　ＴｈｅｔｏｔａｌＲＮＡｗａｓｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍｇｉｎｓｅｎｇｌｅａｖｅｓｏｆＰａｎａｘｇｉｎｓｅｎｇ．ＴｈｅＣｕ／ＺｎＳＯＤｇｅｎｅｗａｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｖｉａＲＴ
ＰＣＲａｎｄｔｈｅｐＥＴ２８（ａ）Ｃｕ／ＺｎＳＯＤｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ．ＴｈｅｐＥＴ２８（ａ）Ｃｕ／ＺｎＳＯＤｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｗａｓｔｒａｎｓ
ｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）ｃｏｍｐｅｔｅｎｔｃｅｌｓａｎｄｗａｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙＩＰＴＧｉｎｏｒｄｅｒｔｏｓｅｌｅｃｔｏｐｔｉｍａｌｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅｔａｒｇｅｔｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｐｕｒｉｆｉｅｄｂｙｔｈｅｎｉｃｋｅｌｉｏｎｓ（Ｎｉ＋）ａｆｉｎｉｔｙｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙａｎｄｔｈｅｔａｒｇｅｔｐｒｏｔｅｉｎｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙｗａｓ
ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｅｄｂｙｔｈｅｘａｎｔｈｉｎｅｏｘｉｄａｓｅｍｅｔｈｏｄ．ＴｈｅｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｏｆｔｈｅＣｕ／ＺｎＳＯＤｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓａｎｄｔｈｅＣｕ／ＺｎＳＯＤｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆ
ＫｏｒｅａｎｇｉｎｓｅｎｇｉｎＮＣＢＩｗａｓ９９．００％．Ｔｈｅｔａｒｇｅｔｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｗａｓａｂｏｕｔ４４．４２％，ａｎｄｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｗａｓ１６．３０
ｋＤａａｆｔｅｒｔｈｅｐＥＴ２８（ａ）Ｃｕ／ＺｎＳＯＤｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓｗｅｒｅｉｎｄｕｃｅｄｂｙＩＰＴＧ．ＴｈｅｐｕｒｉｆｉｅｄＣｕ／ＺｎＳＯＤｐｒｏｔｅａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｒｅａｃｈｅｄ
１０５９６．６９Ｕ·ｍｇ－１．ＴｈｅＰ．ｇｉｎｓｅｎｇｐＥＴ２８（ａ）Ｃｕ／ＺｎＳＯＤｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｗａｓｂｕｉｌｔｂｙｔｈｅｍｅｔｈｏｄｏｆｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌ
ｏｇｙ，ｗｈｉｃｈｐｒｏｖｉｄｅｄｔｈｅｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｓｔｕｄｙｉｎｇｔｈｅＣｕ／ＺｎＳＯＤｂｉｏｌｏｇｙｆｕｎｃｔｉｏｎ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］　ｇｉｎｓｅｎｇ；Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ；ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｄｏｉ：１０．４２６８／ｃｊｃｍｍ２０１３２３１２
［责任编辑　吕冬梅］
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第３８卷第２３期
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