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Vol.34，Issue 3
February，2009
第 34 卷第 3 期
2009 年 2 月
·研究论文·
利用 SRAP 和 ISSR 标记分析川党参的
遗传多样性
陈大霞 1*，彭 锐 1，李隆云 1，孙年喜 1，钟国跃 1，蔡应繁 2
（1. 重庆市中药研究院，重庆 400065；2. 重庆邮电大学，重庆 400065）
[摘要] 目的：川党参 Codonopsis tangshen 的遗传多样性研究。方法：对 18 个不同来源地的川党参种质进行 SRAP
（sequence-related amplified polymorphism），ISSR（inter simple sequence repeat）分析。利用 TREECONW 软件分析遗传相
似系数，UPGMA 方法构建亲缘关系系统图。结果：29 条 SRAP 引物组合共得到 329 条扩增条带，其中有 266 条呈现多态
性，占 80.85%，平均遗传相似系数为 0.712 1。21 条 ISSR 引物共得到 223 条扩增条带，其中有 166 条呈现多态性，占 74.44%，
平均遗传相似系数为 0.778 1。2 种标记均表明川党参具有较高的遗传多样性。聚类结果显示川党参种质亲缘关系与地理分布
相关性不显著。2 种标记系统得到了相似但并不完全相同的聚类图，2 种标记方法间存在显著相关性(r=0.802，P＜0.01)。结
论：川党参种质的遗传多样性水平较高。SRAP 与 ISSR 标记均适用于川党参种质的遗传多样性分析。
[关键词] 川党参；SRAP；ISSR；遗传多样性
随着分子生物学的迅猛发展，将分子标记技术
运用于物种的遗传多样性研究已日益受到育种学
家的青睐。在众多的分子标记中，简单重复序列区
间(inter simple sequence repeat，ISSR)和相关序列扩
增多态性(sequence-related amplified polymorphism，
SRAP)标记针对基因组中的特殊序列设计引物，同
时使用较高的退火温度和较长的引物，不仅重复性
高、稳定性好，且具有无需预知受试基因组 DNA
序列、多态性和信息量丰富等特点，已广泛应用于
药用植物种质资源遗传多样性方面的研究。
川党参 Codonopsis tangshen 属桔梗科植物，味
甘、性平，入脾、肺二经，具有补中益气，生津和
胃之功效，为《中国药典》2005 年版收载品种。目
前对党参分子生物学方面的报道较少，仅见于将分
子标记技术用于鉴定方面的研究[1-2]及采用 RAPD
标记对甘肃栽培的党参 C. pilosula (Franch.) Nannf.
和素花党参 C. pilosula Nannf. var. modesta (Nannf.)
L. T. Shen 在居群水平上的遗传多样性分析[3]。利用

[收稿日期] 2008-04-16
[基金项目] 国家中医药管理局攻关项目（国中医药科 2004ZX06-1）；
国家“十一五”科技支撑计划项目（2006BAI06A11-09）
[通信作者] ∗陈大霞，Tel：(023)89029062，E-mail：chendaxia6891@
hotmail. com
分子标记技术对川党参种质资源遗传多样性方面
的研究尚未见报道。本研究利用 SRAP 和 ISSR 技
术研究川党参种质的遗传多样性，为川党参品种鉴
定、优良种质资源筛选提供方法和理论依据。
1 材料和方法
1.1 供试种子 川党参采自重庆、陕西、湖北、贵
州等地，共 18 份材料见表 1，由重庆市中药研究
院副研究员彭锐鉴定。选取植株上的成熟种子，脱
粒去杂，置于放有滤纸的培养皿上 25 ℃萌发，发
芽 3～5 cm 高时取幼苗，置于-40 ℃冰箱保存备用。
1.2 仪器 HH-S 型水浴锅（河南省巩义市英峪予
华仪器厂），TGL-16G 台式离心机（上海菲恰尔分
析仪器有限公司），Gel Doc 2000 凝胶成像系统
（BIO-RAD），Eppendorf Mastercycler® gradient 梯
度 PCR 仪（Eppendorf），Smart SpeeTM3000 型分
光光度计（BIO-RAD 公司），DYCZ-24B 型电泳槽
（北京市六一仪器厂），DYY-6C 型电泳仪（北京市
六一仪器厂），Caplio R4 数码相机（RICOH 公司）。
1.3 试剂 丙烯酰胺、双丙烯酰胺、硝酸银、37%
甲醛、甘油均为 BBI 公司产品，TEMED、过硫酸
铵为 Promega 产品，SRAP 和 ISSR 引物(北京赛百


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表 1 研究所用材料
No. 来源 海拔/m No. 来源 海拔/m
1 重庆奉节县龙桥乡 1 250 10 重庆南川市黄草坪 1 500
2 重庆巫山县庙宇镇 1 520 11 重庆巫溪县尖山镇 1 620
3 重庆巫山县庙宇镇 1 620 12 贵州道真县坝羊乡 1 620
4 陕西平利县正阳乡 1 520 13 重庆巫溪县兰英乡 1 600
5 陕西平利县正阳乡 1 800 14 重庆奉节县兴隆镇 1 825
6 陕西平利县正阳乡 1 400 15 湖北恩施市板桥镇 1 760
7 湖北竹溪县丰溪镇 1 900 16 重庆奉节县长龙乡 1 540
8 湖北竹溪县丰溪镇 2 050 17 重庆巫山县庙宇镇 1 550
9 重庆武隆县仙女镇 1 400 18 重庆南川市黄草坪 1 600

盛基因技术有限公司)，100 bp DNA ladder marker
(TOYOBO)，Taq 酶(TOYOBO)，dNTPs(TaKaRa)，
CTAB(Amresco)，PVP(Sigma)，β-巯基乙醇(Sigma)，
琼脂糖(进口分装)，其余为国产分析纯试剂。
1.4 基因组 DNA 的提取 取川党参供试材料，采
用 CTAB 法提取基因组 DNA。用紫外-分光光度计
测定其浓度和纯度，将样品稀释为 40 mg·L-1，用作
PCR 扩增的模板。
1.5 SRAP-PCR 扩增 SRAP 引物采用 Li 和
Quiros[4]已发表的引物。本研究所用引物序列见表
2。SRAP 反应体系：总体积 25 µL，内含 1×PCR
buffer，MgCl2 2.0 mmol·L-1，dNTPs 200 µmol·L-1，
引物各 0.2 µmol·L-1，Taq DNA 聚合酶 1 U，模板 40
ng，不足部分 dd H2O 补足。1 滴矿物油覆盖。SRAP
扩增程序采用复性变温法，共 40 个循环，即 94 ℃
预变性 5 min；前 5 个循环：94 ℃变性 1 min，35 ℃
退火 1 min，72 ℃延伸 1.5 min；后 35 个循环：94 ℃
变性 1 min，50 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 1.5 min；
循环结束后 72 ℃延伸 7 min，4 ℃保存。
1.6 ISSR-PCR 扩增 ISSR 引物采用加拿大哥伦
比亚大学（UBC）公布的序列（http://www.biotech.ubc.
ca/serices/ naps/primers/ primers.pdf），由北京赛百盛
基因技术有限公司合成。从 36 个引物中筛选出 21
个扩增条带较多、信号强、背景清晰的引物用于 ISSR
分析，见表 2。反应体系：总体积 25 µL，内含 1×PCR
buffer，1.5 mmol·L-1 Mg2+，200 µmol·L-1 dNTP，0.3
µmol·L-1引物，40 ng 模板，1 U Taq DNA 聚合酶。扩
增程序为 94 ℃预变性 5 min，然后进行 35 个循环：
94 ℃变性 30 s，55 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 1.5 min，
循环结束后 72 ℃延伸 7 min，4 ℃保存。
表 2 ISSR 和 SRAP 引物名称与序列
SRAP 引物 5-3
ISSR 引物 5-3
上游引物 下游引物
UBC807 (AG)8C UBC841 (GA)8YC ME1 TGAGTCCAAACCGGATA EM1 GACTGCGTACGAATTAAT
UBC808 (AG)8C UBC842 (GA)8YG ME2 TGAGTCCAAACCGGAGC EM2 GACTGCGTACGAATTTGC
UBC810 (GA)8T UBC846 (CA)8RT ME3 TGAGTCCAAACCGGAAT EM3 GACTGCGTACGAATTGAC
UBC811 (GA)8C UBC847 (CA)8RC ME4 TGAGTCCAAACCGGACC EM4 GACTGCGTACGAATTTGA
UBC818 (CA)8G UBC848 (CA)8RG ME5 GAGTCCAAACCGGAAG EM5 GACTGCGTACGAATTAAC
UBC825 (AC)8T UBC855 (CA)8YT ME7 TGAGTCCAAACCGGTCC EM6 GACTGCGTACGAATTGCA
UBC826 (AC)8 C UBC857 (AC)8YG ME8 TGAGTCCAAACCGGTGC EM7 GACTGCGTACGAATTCAA
UBC834 (AG)8YT UBC866 (CTC)6 ME10 TGAGTCCAAACCGGCAT
UBC835 (AG)8YC UBC873 (GACA)4 ME11 TGAGTCCAAACCGGTCT
UBC836 (AG)8YA UBC880 (GGAGA)3
UBC840 (GA)8YT
注：Y=(C，T)；R=(A，G)。

1.7 产物的检测 取扩增产物5 µL在6%的非变性
聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，以 0.5×TBE 为缓冲
液，稳压 150 V，电泳至溴酚蓝距凝胶边缘 2~3 cm
处结束。采用银染法进行染色。染色后，用数码相
机照相、记录。
1.8 数据的采集、统计、分析 根据各分子标记的
电泳迁移率及其有无统计所有的二元数据，按 DNA
条带的“有”或“无”进行统计，有带（扩增阳性）


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记为“1”，无带（扩增阴性）记为“0”，强带和弱
带的赋值均为 1，形成 0/1 矩阵图输入计算机。对
于多态性位点，仅在重复实验中能稳定出现的差异
带用于数据分析。
根据 SRAP 和 ISSR 扩增的结果，利用
TREECONW（Version 1.3）分析软件计算材料间遗
传相似系数，按 UPGMA(unweighted pair group
method arithmetic averages)方法构建聚类图。用
Mantel 检验在 XLSTAT 分析软件下对 2 种标记所得
到的 GD 矩阵进行相关性分析。
2 结果与分析
2.1 SRAP 和 ISSR 标记的遗传多态性比较 本试
验从 50 个 SRAP 引物组合中筛选出 29 个扩增谱带
清晰并呈现多态性的引物组合用于 SRAP-PCR 扩
增，扩增片段大部分集中在 100~600 bp。SRAP 引
物组合 M7E4 的扩增结果见图 1。29 个 SRAP 引物
共扩增出 329 条可区分的 DNA 条带，每个引物检
测到的位点 5～24 个，平均每个引物扩增出 11.3 条
带。在这 329 条 DNA 扩增条带中，有 266 条带呈
多态性，多态性条带比率(PPB)为 80.85%，每个
SRAP 引物可扩增出 3～19 条多态性带，平均每个
引物产生 9.2 条多态性带。

M. maker；1~18.见表 1（图 2 同）。
图 1 SRAP 引物组合 ME7-EM4 的扩增图谱

对于 ISSR 标记，本研究从 36 个 RAPD 引物中
筛选出谱带清晰并呈现多态性的引物 21 个，对供
试的 18 份党参进行 ISSR-PCR 扩增。引物 UBC834
的扩增图谱见图 2，扩增片段大部分集中在 200~
1 000 bp。21 个引物共扩增出 223 条可区分的 DNA
条带，每个引物检测到的位点在 5～17，平均每个
引物可扩增出 10.6 条带。在这 223 条 DNA 扩增带
中，有 166 带呈多态性，多态性条带比率(PPB)为
74.44%，每个引物可扩增出 4～14 条多态性带，平
均每个引物产生 7.9 条多态性带。

图 2 ISSR 引物 UBC834 的扩增结果

通过以上分析可知，2 种标记系统都可以扩增
出其各自的多态性谱带，均能有效的揭示川党参种
质较为丰富的遗传多样性，但 SRAP 标记的检测位
点、多态性条带比率均稍高于 ISSR 标记。
2.2 基于 SRAP 和 ISSR 标记的遗传相似系数分析
采用 Nei 遗传相似性系数的计算方法，得到 2 种标
记扩增结果的相似性系数矩阵。
SRAP 扩增结果的遗传相似性系数均在 0.50 以
上，平均 0.712 1，处于 0.534 8～0.918 5，其中重
庆巫山县庙宇镇（2）与（3）的遗传相似系数最低，
表明二者亲缘关系最远；陕西平利县正阳乡（6）
与湖北竹溪县丰溪镇（7）的遗传相似系数最高，
表明二者亲缘关系最近。
ISSR 扩增结果的遗传相似性系数平均为
0.778 1，其中湖北竹溪县丰溪镇（8）与湖北恩施
市板桥镇（15）的遗传相似系数最低，为 0.680 0；
陕西平利县正阳乡（6）与湖北竹溪县丰溪镇（7）
的遗传相似系数最高，为 0.957 5，表明二者亲缘关
系最近。
SRAP标记揭示的遗传相似性系数范围比 ISSR
标记广，而平均遗传相似系数小于 ISSR。因此，相
对而言，SRAP 比 ISSR 能反映较多的遗传信息，检
测到种质间较高的遗传差异。
2.3 基于 SRAP 和 ISSR 标记的聚类分析 基于遗
传距离，利用 UPGMA 聚类方法，对 18 个不同来
源地的川党参之间的遗传关系进行聚类分析。结果
表明，川党参种质的聚类与其地理来源相关性不显
著，如来源于重庆巫山县庙宇镇、陕西平利县正阳
乡、湖北竹溪县丰溪镇、重庆南川市黄草坪不同海
拔的种质虽然大多数聚在大分支中，但在小分支中
却并未聚在一起。2 种标记系统得到了相似但并不
完全相同的聚类树，见图 3。18 份川党参种质均分


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为明显的三大类：基于 SRAP 标记和 ISSR 标记的
聚类图中，重庆奉节县长龙乡（16）的川党参均
独为一支（B1，B2），这可能与该产地能检测出的
特异位点较多有关；其余两大类中的川党参来源
地并不完全相同，但还是有部分来源地聚在同一
大类中，如来源于重庆巫山县庙宇镇（17）、重庆
南川市黄草坪（18）、陕西平利县正阳乡（4，6）、
湖北竹溪县丰溪镇（7）、贵州道真县坝羊乡（12）
均聚在 A 大类中，而重庆巫溪县兰英乡（13）、
重庆奉节县兴隆镇（14）、湖北恩施市板桥镇（15）、
重庆奉节县龙桥乡（1）均聚同一大类中（A1，
A2）。

图 3 基于 SRAP（左图）和 ISSR（右图）标记的 18 份川党参种质的 UPGMA 聚类图
(序号对应供试材料见表1)

2.4 SRAP 和 ISSR 标记的相关性分析 为了分析
SRAP 和 ISSR 2 种分子标记的相关性，利用 Mantel
检验对 2 种分子标记分析所产生的居群间遗传距离
矩阵进行相关性分析。检验结果表明，2 种分子标
记所得到的遗传距离矩阵之间呈极显著性相关
(P＜0.01)。
3 讨论
3.1 关于基因组 DNA 质量和 SRAP，ISSR 的反应
条件 本实验条件下提取的川党参基因组 DNA
A260 nm/A280 nm在 1.75～1.85，基本无蛋白质和 RNA
的污染，完全可以作为 PCR 扩增的模板。SRAP 和
ISSR 标记都是基于 PCR 扩增的标记系统，其扩增
反应中多种因子对扩增结果有一定影响。本实验中
所采用的扩增反应条件是在本室对药用植物[5-6]的
SRAP 和 ISSR 反应体系优化的基础上确定的，保证
了实验结果的可靠性、重复性。
3.2 川党参的遗传多样性 川党参药用历史悠久，
由于产地、来源和加工方法不同，形成各具特色的
商品名称，如板党(湖北板桥)、庙党(重庆巫山大庙)、
大宁党(重庆巫溪)、条党(重庆奉节)、八仙党(陕西
平利八仙)等。因此，川党参种质资源的遗传多样性
研究可以为川党参优良品种选育、新种质资源的创
造提供基础。本研究首次采用 SRAP 和 ISSR 分子
标记对不同来源地的川党参进行了遗传多样性研
究，2 种分子标记方法的多态性比率分别达到了
80.85%和 74.44%，均说明川党参具有较高的遗传多
样性。从分子水平上反映了当前川党参的生产状况
和品种来源现状。川党参的栽培主要采用种子和种
根 2 种方式进行繁殖。若是大面积引种栽培，为避
免买到陈种和假种，一般均是在周边地区购买种根
直接进行种植；若是药农的零星栽培，更多的是自
留种或直接采集当地野生种子用于生产。因此川党
参的种源十分混杂，主要有野生种、半野生种和驯
化的栽培种。这种复杂性导致种源整齐度差，增加
了川党参种质的遗传多样性。同时也表明，川党参
在遗传进化过程中，随着时空的变化，其基因组
DNA 发生变异，从而构成了川党参丰富的基因资
源，这可能与川党参分布范围广、生境复杂有关。
3.3 SRAP 和 ISSR 标记在揭示遗传多样性上的比
较 2 种标记系统在多态性水平及检测水平上各有
不同。从平均扩增条带数、平均多态条带数、多态
条带比率上看，SRAP 标记均稍高于 RAPD 标记；
从遗传相似系数分析看，SRAP 标记的遗传相似性
系数的范围比 ISSR 标记广，而其平均遗传相似系


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数小于 RAPD。因此，相对而言，SRAP 标记比 ISSR
标记能反映较多的遗传信息，检测到种质间较高的
遗传差异。SRAP 和 ISSR 2 种标记系统由于都使用
了较高的退火温度和较长的引物，不但保证了扩增
的稳定性，且都能产生各自有效的多态性带，揭示
出川党参种质资源之间在 DNA 水平上的显著遗传
变异，因此均适合用于川党参种质的遗传多样性
研究。
3.4 基于 SRAP 和 ISSR 标记的聚类结果比较 2
种标记方法得到了相似却并不完全相同的聚类结
果，这是由于 SRAP 和 ISSR 2 种标记原理不同，扩
增的是基因组中的不同区域，因此得出了不同的遗
传距离，由此产生的聚类图也存在一定差异。从基
于 2种分子标记的Neis遗传距离所构建的UPGMA
系统树中可以看出，居群间遗传关系的聚类结果基
本一致，即都可以分为 3 支，每支中的多数产地是
相同的。2 种标记方法间存在显著相关性(r=0.802，
P＜0.01)，与其他应用不同分子标记方法分析植物
遗传多样性的研究结果类似[7-8]，说明应用 ISSR 和
SRAP 2 种方法分析川党参遗传多样性是可行的。
川党参种质资源的聚类与来源地相关性不显著，说
明地理环境因素对遗传多样性影响不大，部分来自
不同产地甚至地理距离较远的样品遗传距离非常
相近，这可能是不同地域的川党参具有相似的环境
条件，或相近的人工选择标准有关，或可能是相近
的种质来源。赵茹等[9]认为，不同分子标记检测到
的植物类群遗传多样性水平难以进行简单比较，应
该考虑其他检测手段和遗传参数，因此，分子标记
鉴定中药材需要结合化学分析、形态鉴别等手段，
以提高准确率。
[参考文献]
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Codonopsis species from adulterants by polymerase chain
reaction-restriction fragment length polymorphism[J]. Planta Meda，
1999，65(7)：648.
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chain reaction differentiates Codonopsis pilosula from different
localities[J]. Planta Med，1999，65(2)：157.
[3] 张建清，苏 雪，吴 琼，等. 药用植物党参的 RAPD 分析[J]. 中
药材，2006，29(5)：417.
[4] Li G，Quiros C F. Sequence-related amplified polymorphism(SRAP)，
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to mapping and gene tagging in Brossica[J]. Theor Appl Genet，2001，
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[8] 马丹炜，王胜华，罗 通，等. 岩生植物金发草遗传多样性的 ISSR
和 AFLP 比较研究[J]. 应用与环境生物学报，2006，12(5)：605.
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传多样性估算与取样策略[J]. 科学通报，2006，51(9)：1042.


Study on genetic diversity of Codonopsis tangshen by SRAP and ISSR markers

CHEN Daxia1*，PENG Rui1，LI Longyun1，SUN Nianxi1，ZHONG Guoyue 1，CAI Yingfan2
(1. Chongqing Academy of Chinese Materia Medica,Chongqing 400065，China;
2. Chongqing University of Posts and Telecommunications, Chongqing 400065，China)

[Abstract] Objective：To study the genetic diversity of Codonopsis tangshen. Method: Eighteen germplasmic resources of C.
tangshen were analyzed by SRAP and ISSR molecular markers. The systematic diagram of genetic relationship was made by
TREECONW software and clustered by UPGMA method. Result: Twenty-nine SRAP primer combination amplified 329 bands with
266 (80.85%) polymorphic and 21 ISSR primers amplified 223 bands with 166(74.44%) polymorphic. The average genetic similarity
coefficient was 0.712 1 (by SRAPs) and 0.778 1(by ISSRs). Both SRAP and ISSR analyses revealed a high level of genetic diversity in
C. tangshen. By cluster analysis, the geographical distribution was not distinctive. The significant positive correlation between SRAPs
and ISSRs was observed (r=0.802，P＜0.01), although the dendrograms based on SRAP and ISSR markers were not all the same.
Conclusion: Different germplasms diversity of C. tangshen is high and SRAP and ISSR can be used in genetic diversity study of C.
tangshen.
[Key Words] Codonopsis tangshen; SRAP; ISSR; genetic diversity
[责任编辑 吕冬梅]