全 文 :正交设计优选吴茱萸汁的制备工艺
韩旭阳1,2,边宝林1,李娆娆1,张志杰1,麻印莲1,原思通1
(1中国中医科学院 中药研究所,北京 100700;2江西中医学院,江西 南昌 330006)
[摘要] 目的:研究吴茱萸汁的制备工艺,为该辅料的规模化生产提供实验数据。方法:采用L9(3
4)正交表设计试验,以
吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸内酯为指标,用高效液相色谱法测定3种成分的含量,以加权系数法分析实验结果,确定吴茱萸
汁的制备工艺。结果:吴茱萸汁的制备工艺为煎煮3次,首次煎煮加水量为12倍,浸泡30min后煎煮45min,第2次煎煮加水
量8倍,煎煮20min,第3次煎煮加水量6倍,煎煮20min。经6个产地10批样品中试验证,辅料质量稳定。结论:该工艺方法
简便,能够为该辅料的规范化及工业化生产提供实验数据。
[关键词] 吴茱萸汁;正交设计;制备工艺
[收稿日期] 20090602
[基金项目] 中国中医科学院自选课题(ZZ2006096)
[通信作者] 李娆娆,Tel:(010)640144112975,Email:leeraorao
@163com
[作者简介] 韩旭阳,硕士研究生,Email:rubyhxy@163com
吴茱萸汁又称吴萸汁,为常用的中药炮制辅
料。吴茱萸味辛、苦,性热,有小毒,具有温中下
气,散寒止痛,降逆止呕,温中止泻的功效;与性
味苦寒的药物共制,可缓和药性,如吴茱萸汁制
黄连,可抑制黄连的苦寒之性,使黄连寒而不滞,
善清气分湿热,散肝胆郁火,舒肝和胃而止呕[1]。
该辅料的应用可追溯到明代,李梃在《医学入门》
中记载“吴茱萸水炒黄连调胃厚肠,治冷热不
调”;李时珍在《本草纲目》中记载“黄连,……治
气分湿热之火,则以茱萸汤浸炒”[2]。目前 2005
年版《中国药典》、全国炮制规范及各地炮制规范
中吴茱萸汁的制备工艺均不一致[34],该辅料的
制备工艺目前仅凭经验掌握,尚未见相关文献报
道。本研究采用正交设计对吴茱萸汁的制备工
艺进行研究,以吴茱萸碱、吴茱萸次碱和吴茱萸
内酯为指标,采用加权系数法分析实验结果,确
定了吴茱萸汁的制备工艺并进行10批次的中试
验证,以期对吴茱萸汁的生产应用提供实验
数据。
1 材料
Waters高效液相色谱仪(600Pump,Waters600
Controler,Waters2487Detector),Milennium32色谱
管理软件(美国Waters公司)。
吴茱萸碱对照品(中国药品生物制品检定所,
批号 110802200505);吴茱萸内酯、吴茱萸次碱均
购于上海顺勃生物工程有限公司,经 HPLC面积归
一化法测定纯度均在98%以上。甲醇、乙腈为色谱
纯,水为自制高纯水。其余试剂均为分析纯。
吴茱萸购自河北安国,经中国中医科学院中药
所冯学锋副研究员鉴定为芸香科植物石虎 Evodia
rutaecarpa(Juss)Benthvaroficinalis(dode)Huang
的干燥近成熟果实。
2 方法与结果
21 正交试验设计
经文献查阅,确定浸药时间、煎煮次数、煎煮时
间、首次煎药加水量是影响吴茱萸汁有效成分煎出
量的主要因素,因此选定这4个因素,分别选出常规
可行的4个水平,按照 L9(3
4)正交设计表,进行吴
茱萸汁的制备工艺研究。见表1。
表1 吴茱萸汁正交设计因素和水平
水平
A
浸药时间
/h
B
煎煮次数
/次
C
煎煮时间
/min
D
首次煎药加水量
/倍
1 0 1 30 8
2 05 2 45 10
3 1 3 60 12
注:统一第2次采用煎煮时间20min,加水量8倍;第3次采用
煎煮20min,加水量6倍。
22 色谱条件
AgilentC18色谱柱(46mm ×250mm,5μm);
流动相乙腈水四氢呋喃冰醋酸(40∶60∶1∶02),
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流速10mL·min-1,柱温30℃;吴茱萸内酯、吴茱
萸碱检测波长 225nm、吴茱萸次碱检测波长 343
nm。在此条件下,各对照品和样品的色谱图见图1。
A吴茱萸内酯对照品;B吴茱萸碱对照品;
C吴茱萸次碱对照品;D样品;1吴茱萸内酯;2吴茱萸碱;
3吴茱萸次碱。
图1 吴茱萸汁HPLC图
23 溶液制备
231 对照品溶液 分别取吴茱萸内酯对照品、吴
茱萸碱对照品和吴茱萸次碱对照品适量,加乙腈溶
解,得到3种对照品溶液的质量浓度依次为050,
004,002g·L-1。
232 供试品溶液 取吴茱萸样品9份,每份10
g,按照正交试验设计表煎煮,滤过,取滤液定容至
250mL。每份药汁各取30mL,水浴蒸干,加乙腈
水(6
4)40mL,称重,回流 1h,冷却至室温,称
重,用乙腈水(6
4)补足失重,过045μm的滤
膜,即得。
24 线性关系考察
用乙腈配制吴茱萸内酯对照品溶液 054g·
L-1,吴茱萸碱对照品溶液012g·L-1,吴茱萸次碱
对照品溶液005g·L-1,将3个对照品各稀释2,
4,8,16,32,64倍,分别过滤进样15μL。见表2。
25 方法学考察
表2 线性关系
对照品名称 回归方程 r 线性范围/μg
吴茱萸内酯 Y=29×106X+58×104 09999 051~813
吴茱萸碱 Y=20×108X-22×104 09998 002~182
吴茱萸次碱 Y=10×108X+12×104 09999 001~074
251 精密度试验 取吴茱萸样品,照222项下
的方法制备供试品溶液,连续进样5次,按22色谱
条件测定各峰面积,结果显示吴茱萸内酯 RSD
096%,吴茱萸碱 RSD036%,吴茱萸次碱 RSD
067%,表明仪器性能良好。
252 重复性试验 取同一样品5份,按照222
项下的方法制备供试品溶液,分别进样测定,记录各
成分色谱峰的峰面积,计算吴茱萸内酯 RSD
077%,吴茱萸碱 RSD075%,吴茱萸次碱 RSD
089%,表明样品的制备方法稳定,重复性良好。
253 稳定性试验 取同一供试品溶液,分别在
0,2,4,6,8,12,24h进样,测定各成分色谱峰的峰面
积,计算吴茱萸内酯 RSD12%,吴茱萸碱 RSD
10%,吴茱萸次碱 RSD11%,表明样品溶液在24
h内稳定性较好。
254 回收率试验 采用加样回收法,取2号样品
5份,每份约5g,分别加入吴茱萸内酯对照品3276
mg、吴茱萸碱对照品 199mg、吴茱萸次碱对照品
060mg。按232项下制备供试品溶液,分别进样
15μL,测定,加样回收率均在95%~105%,见表3。
26 样品测定
精密吸取按23项下制备的对照品溶液和供试
品溶液各15μL,进样测定,见表4。
27 结果
以吴茱萸内酯、吴茱萸碱、吴茱萸次碱作为指标
性成分,根据这3种成分在辅料中的含量高低与各自
药理作用的主次,采用加权评分法,对实验数据进行
分析。因吴茱萸中生物碱类成分的活性更为主要,但
是苦味素类的含量很高是生物碱类的几十倍,因此将
生物碱类成分的系数定为06,苦味素类成分的系数
定为04。且在生物碱类成分中吴茱萸碱含量要高于
吴茱萸次碱,所以吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸内酯
3个指标的权重系数宜分别取为04,02,04。为在
同一标准下加权评分,分别将各指标中含量最高的值
定为1,其余为该值与最佳值的比值。最后总分为
y=04y1+04y2+02y3。见表4。
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表3 吴茱萸汁3种成分加样回收率
成分
样品中量
/mg
加入量
/mg
测得量
/mg
回收率
/%
平均值
/%
RSD
/%
吴茱萸内酯 3270 3276 6534 9964 10149 221
3270 3276 6656 10334
3270 3276 6691 10443
3270 3276 6560 10041
3270 3276 6534 9962
吴茱萸碱 187 199 394 10407 10265 151
187 199 394 10380
187 199 390 10182
187 199 392 10320
187 199 387 10035
吴茱萸次碱 061 060 119 9688 10047 242
061 060 122 10203
061 060 121 9971
061 060 121 10035
061 060 123 10339
表4 综合加权评分
No
质量分数/mg·g-1 综合加权评分法
吴茱萸内酯 吴茱萸碱 吴茱萸次碱 吴茱萸内酯 吴茱萸碱 吴茱萸次碱
总分
重复试验1 1 3570 0282 0115 030 022 024 025
2 8947 1013 0348 075 078 071 075
3 10977 1291 0489 092 099 100 096
4 5705 0550 0194 048 042 040 044
5 9135 0913 0273 076 070 056 070
6 11977 1245 0379 100 096 078 094
7 3820 0377 0106 032 029 022 029
8 7227 0898 0354 060 069 073 066
9 11289 1302 0373 094 100 076 093
重复试验2 1 3636 0283 120 030 022 024 025
2 9139 1029 0355 074 079 071 075
3 11158 1320 0501 091 101 100 097
4 5620 0553 0196 046 042 039 043
5 9339 0953 0284 076 073 057 071
6 12311 1291 0391 100 099 078 095
7 3903 0392 0111 032 030 022 029
8 7231 0904 0359 059 069 072 065
9 11233 1310 0376 091 100 075 091
通过直观分析可以看出,4个因素影响力大小
为B>D>C>A,最佳实验方案为 A2B3C2D3。方
差分析可以看出4个因素的3水平之间的差异有显
著性意义,见表5。2次重复实验之间的差别无显著
意义。排除了实验操作的误差。最后优选出吴茱萸
汁的最佳制备工艺为煎煮 3次,首次加水量为 12
倍,浸泡半小时后煎煮45min,第2次加8倍水煎煮
20min,第3次加6倍水煎煮20min。
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表5 方差分析
因素 离差平方和 f 均方 F P
校正模型 1215(a) 9 014 243023 000
截距 778 1 778 13994890 000
重复试验 556×10-6 1 556×10-6 010 076
浸药时间 002 2 001 14560 000
煎煮次数 117 2 058 1049530 000
煎煮时间 002 2 001 19630 000
煎煮水量 001 2 001 9880 000
误差 000 8 556×10-5
总合 899 18
校正 122 17
注:a.R2=1000(校正R2=0999)。
3 讨论
31 指标成分选择的依据
吴茱萸包括生物碱、苦味素、挥发油这3大类主
要成分及其他成分。经实验研究发现吴茱萸汁的制
备过程中(水煎)挥发油已经基本损失,吴茱萸汁中
仅含少量或者不含挥发油类成分,因此挥发油类成
分在吴茱萸汁中不占主导地位。且经 HPLCMS实
验研究确定吴茱萸汁的主要成分为吴茱萸碱、吴茱
萸次碱等生物碱类成分和吴茱萸内酯等苦味素类成
分。从药理作用上来看:吴茱萸碱、吴茱萸次碱与吴
茱萸内酯三者都有镇痛抗炎的药理作用,吴茱萸碱
又能调节体温、吴茱萸次碱保护胃黏膜抗溃疡,这些
药理作用可能在“抑制黄连的苦寒之性,使黄连寒
而不滞,治疗肝胃不合呕吐吞酸”中起着关键的作
用。因此选择吴茱萸碱、吴茱萸次碱和吴茱萸内酯
作为指标成分。
32 正交试验影响因素的选择
吴茱萸汁的制备工艺各地差异较大,2005年版
《中国药典》在黄连炮制项下规定“取吴茱萸,加适
量水煎煮,煎液”;全国中药炮制规范则规定“取净
吴萸,加水适量,煎煮半小时,去渣取汁”,各地炮制
规范中吴茱萸汁的煎煮时间、加水量等均不相同,因
此本实验将浸药时间、煎煮时间、煎煮次数、首次煎
煮的加水量作为该辅料的4个因素。
33 液相色谱条件的选择
331 色谱柱及流动相的选择 比较了AgilentC18
色谱柱与 KromasilC18色谱柱对吴茱萸汁3种成分
的分离效果,结果显示前者能使吴茱萸内酯、吴茱萸
碱、吴茱萸次碱达到基线分离,而用 KromasilC18色
谱柱则吴茱萸内酯与其他成分未能达到基线分离,
因此确定使用 AgilentC18色谱柱。本实验参照文献
[9]并进行流动相的优化,确定以乙腈水四氢呋
喃冰醋酸(40∶60∶1∶02)为流动相。
332 供试品溶液制备方法的选择 在回流溶剂
的选择上进行了实验研究,比较了乙腈水的比例从
10∶0~0∶10作为回流溶剂对有效成分的溶出影响,
结果得出当乙腈水(6∶4)时,有效成分的溶出率
最高。
333 检测波长的确定 吴茱萸内酯的最大吸收
203nm,吴茱萸碱225nm,吴茱萸次碱343nm。当
检测波长225nm时吴茱萸内酯、吴茱萸碱能够基线
分离,而吴茱萸次碱的分离度较差,峰面积也较低,
但在343nm时,吴茱萸次碱能够达到基线分离,并
且吸收最大。而203nm受末端吸收影响太大。因
此选定225,343nm2个波长作为检测波长。
4 小结
本实验采用 L9(3
4)正交设计表,以浸药时间
A(0,05,1h)、煎煮次数 B(1,2,3次)、煎煮时
间 C(30,45,60min)、首次煎煮加水量 D(8,10,
12倍)4因素3水平进行了吴茱萸汁的制备工艺
研究,采用运用综合加权评分法对实验结果进行
分析,得出的最佳工艺为 A2B3C2D3,即煎煮3次,
首次加水量为12倍,浸泡半小时后煎煮 45min,
第2次加8倍水煎煮 20min,第 3次加 6倍水煎
煮20min。经中试验证,该制备方法简单易操
作,适合于大工业生产。
吴茱萸汁作为炮制辅料,是在炮制过程中加入,
其质量的优劣直接影响萸黄连的质量。吴茱萸汁的
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制备工艺是确保该辅料质量的主要因素,对其进行
制备工艺研究对于保证饮片质量、确保临床疗效具
有重要意义。本实验仅是萸黄连研究的开端,把好
吴茱萸汁的质量关,为今后揭示萸黄连炮制机制奠
定了实验基础。
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Optimalprocessingtechniquesofpreparingevodiaejuice
byorthognalexperiment
HANXuyang1,2,BIANBaolin1,LIRaorao1,ZHANGZhijie1,MAYinlian1,YUANSitong1
(1InstituteofChineseMateriaMedica,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100700,China;
2JiangxiColegeofChineseTraditionalMedicine,Nanchang330006,China)
[Abstract] Objective:TostudyandestablishtheoptimaltechnologyforthepreparationofevodiaejuiceMethod:Thecontents
ofevodiamine,rutaecarpineandevodinweresimultaneouslydeterminedwithHPLC,andeachyieldofthethreecompoundswerechosen
astheevaluatingindicatorTheorthogonaltestcoupledwiththeweightedcoeficientmethodwereadoptedtoacquiretheoptimaltech
nologyforthepreparationofevodiaejuiceResult:Thestudyshowedthattheoptimaltechnologyforthepreparationofevodiaejuice
wasasfolows:decoctedthreetimeswhilethefirsttimewaswith12foldofwatersocked30minutesanddecocted45minutes,thesec
ondtimewaswith8foldofwaterdecocted20minutesandthethirdtimewaswith6foldofwaterdecocted20minutesConclusion:
ThismethodissimpleandaccurateTheoptimaltechnologyissuitableforindustrymanufactureofevodiaejuice
[Keywords] evodiaejuice;preparationtechnology;orthogonaltest
[责任编辑 周驰]
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