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Optimal processing techniques of preparing evodiae juice by orthognal experiment

正交设计优选吴茱萸汁的制备工艺



全 文 :正交设计优选吴茱萸汁的制备工艺
韩旭阳1,2,边宝林1,李娆娆1,张志杰1,麻印莲1,原思通1
(1中国中医科学院 中药研究所,北京 100700;2江西中医学院,江西 南昌 330006)
[摘要] 目的:研究吴茱萸汁的制备工艺,为该辅料的规模化生产提供实验数据。方法:采用L9(3
4)正交表设计试验,以
吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸内酯为指标,用高效液相色谱法测定3种成分的含量,以加权系数法分析实验结果,确定吴茱萸
汁的制备工艺。结果:吴茱萸汁的制备工艺为煎煮3次,首次煎煮加水量为12倍,浸泡30min后煎煮45min,第2次煎煮加水
量8倍,煎煮20min,第3次煎煮加水量6倍,煎煮20min。经6个产地10批样品中试验证,辅料质量稳定。结论:该工艺方法
简便,能够为该辅料的规范化及工业化生产提供实验数据。
[关键词] 吴茱萸汁;正交设计;制备工艺
[收稿日期] 20090602
[基金项目] 中国中医科学院自选课题(ZZ2006096)
[通信作者] 李娆娆,Tel:(010)640144112975,Email:leeraorao
@163com
[作者简介] 韩旭阳,硕士研究生,Email:rubyhxy@163com
  吴茱萸汁又称吴萸汁,为常用的中药炮制辅
料。吴茱萸味辛、苦,性热,有小毒,具有温中下
气,散寒止痛,降逆止呕,温中止泻的功效;与性
味苦寒的药物共制,可缓和药性,如吴茱萸汁制
黄连,可抑制黄连的苦寒之性,使黄连寒而不滞,
善清气分湿热,散肝胆郁火,舒肝和胃而止呕[1]。
该辅料的应用可追溯到明代,李梃在《医学入门》
中记载“吴茱萸水炒黄连调胃厚肠,治冷热不
调”;李时珍在《本草纲目》中记载“黄连,……治
气分湿热之火,则以茱萸汤浸炒”[2]。目前 2005
年版《中国药典》、全国炮制规范及各地炮制规范
中吴茱萸汁的制备工艺均不一致[34],该辅料的
制备工艺目前仅凭经验掌握,尚未见相关文献报
道。本研究采用正交设计对吴茱萸汁的制备工
艺进行研究,以吴茱萸碱、吴茱萸次碱和吴茱萸
内酯为指标,采用加权系数法分析实验结果,确
定了吴茱萸汁的制备工艺并进行10批次的中试
验证,以期对吴茱萸汁的生产应用提供实验
数据。
1 材料
Waters高效液相色谱仪(600Pump,Waters600
Controler,Waters2487Detector),Milennium32色谱
管理软件(美国Waters公司)。
吴茱萸碱对照品(中国药品生物制品检定所,
批号 110802200505);吴茱萸内酯、吴茱萸次碱均
购于上海顺勃生物工程有限公司,经 HPLC面积归
一化法测定纯度均在98%以上。甲醇、乙腈为色谱
纯,水为自制高纯水。其余试剂均为分析纯。
吴茱萸购自河北安国,经中国中医科学院中药
所冯学锋副研究员鉴定为芸香科植物石虎 Evodia
rutaecarpa(Juss)Benthvaroficinalis(dode)Huang
的干燥近成熟果实。
2 方法与结果
21 正交试验设计
经文献查阅,确定浸药时间、煎煮次数、煎煮时
间、首次煎药加水量是影响吴茱萸汁有效成分煎出
量的主要因素,因此选定这4个因素,分别选出常规
可行的4个水平,按照 L9(3
4)正交设计表,进行吴
茱萸汁的制备工艺研究。见表1。
表1 吴茱萸汁正交设计因素和水平
水平

浸药时间
/h

煎煮次数
/次

煎煮时间
/min

首次煎药加水量
/倍
1 0 1 30 8
2 05 2 45 10
3 1 3 60 12
  注:统一第2次采用煎煮时间20min,加水量8倍;第3次采用
煎煮20min,加水量6倍。
22 色谱条件
AgilentC18色谱柱(46mm ×250mm,5μm);
流动相乙腈水四氢呋喃冰醋酸(40∶60∶1∶02),
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流速10mL·min-1,柱温30℃;吴茱萸内酯、吴茱
萸碱检测波长 225nm、吴茱萸次碱检测波长 343
nm。在此条件下,各对照品和样品的色谱图见图1。
A吴茱萸内酯对照品;B吴茱萸碱对照品;
C吴茱萸次碱对照品;D样品;1吴茱萸内酯;2吴茱萸碱;
3吴茱萸次碱。
图1 吴茱萸汁HPLC图
23 溶液制备
231 对照品溶液 分别取吴茱萸内酯对照品、吴
茱萸碱对照品和吴茱萸次碱对照品适量,加乙腈溶
解,得到3种对照品溶液的质量浓度依次为050,
004,002g·L-1。
232 供试品溶液 取吴茱萸样品9份,每份10
g,按照正交试验设计表煎煮,滤过,取滤液定容至
250mL。每份药汁各取30mL,水浴蒸干,加乙腈
水(6

4)40mL,称重,回流 1h,冷却至室温,称
重,用乙腈水(6

4)补足失重,过045μm的滤
膜,即得。
24 线性关系考察
用乙腈配制吴茱萸内酯对照品溶液 054g·
L-1,吴茱萸碱对照品溶液012g·L-1,吴茱萸次碱
对照品溶液005g·L-1,将3个对照品各稀释2,
4,8,16,32,64倍,分别过滤进样15μL。见表2。
25 方法学考察
表2 线性关系
对照品名称 回归方程 r 线性范围/μg
吴茱萸内酯 Y=29×106X+58×104 09999 051~813
吴茱萸碱 Y=20×108X-22×104 09998 002~182
吴茱萸次碱 Y=10×108X+12×104 09999 001~074
251 精密度试验 取吴茱萸样品,照222项下
的方法制备供试品溶液,连续进样5次,按22色谱
条件测定各峰面积,结果显示吴茱萸内酯 RSD
096%,吴茱萸碱 RSD036%,吴茱萸次碱 RSD
067%,表明仪器性能良好。
252 重复性试验 取同一样品5份,按照222
项下的方法制备供试品溶液,分别进样测定,记录各
成分色谱峰的峰面积,计算吴茱萸内酯 RSD
077%,吴茱萸碱 RSD075%,吴茱萸次碱 RSD
089%,表明样品的制备方法稳定,重复性良好。
253 稳定性试验 取同一供试品溶液,分别在
0,2,4,6,8,12,24h进样,测定各成分色谱峰的峰面
积,计算吴茱萸内酯 RSD12%,吴茱萸碱 RSD
10%,吴茱萸次碱 RSD11%,表明样品溶液在24
h内稳定性较好。
254 回收率试验 采用加样回收法,取2号样品
5份,每份约5g,分别加入吴茱萸内酯对照品3276
mg、吴茱萸碱对照品 199mg、吴茱萸次碱对照品
060mg。按232项下制备供试品溶液,分别进样
15μL,测定,加样回收率均在95%~105%,见表3。
26 样品测定
精密吸取按23项下制备的对照品溶液和供试
品溶液各15μL,进样测定,见表4。
27 结果
以吴茱萸内酯、吴茱萸碱、吴茱萸次碱作为指标
性成分,根据这3种成分在辅料中的含量高低与各自
药理作用的主次,采用加权评分法,对实验数据进行
分析。因吴茱萸中生物碱类成分的活性更为主要,但
是苦味素类的含量很高是生物碱类的几十倍,因此将
生物碱类成分的系数定为06,苦味素类成分的系数
定为04。且在生物碱类成分中吴茱萸碱含量要高于
吴茱萸次碱,所以吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸内酯
3个指标的权重系数宜分别取为04,02,04。为在
同一标准下加权评分,分别将各指标中含量最高的值
定为1,其余为该值与最佳值的比值。最后总分为
y=04y1+04y2+02y3。见表4。
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表3 吴茱萸汁3种成分加样回收率
成分
样品中量
/mg
加入量
/mg
测得量
/mg
回收率
/%
平均值
/%
RSD
/%
吴茱萸内酯 3270 3276 6534 9964 10149 221
3270 3276 6656 10334
3270 3276 6691 10443
3270 3276 6560 10041
3270 3276 6534 9962
吴茱萸碱 187 199 394 10407 10265 151
187 199 394 10380
187 199 390 10182
187 199 392 10320
187 199 387 10035
吴茱萸次碱 061 060 119 9688 10047 242
061 060 122 10203
061 060 121 9971
061 060 121 10035
061 060 123 10339
表4 综合加权评分
No
质量分数/mg·g-1 综合加权评分法
吴茱萸内酯 吴茱萸碱 吴茱萸次碱 吴茱萸内酯 吴茱萸碱 吴茱萸次碱
总分
重复试验1 1 3570 0282 0115 030 022 024 025
2 8947 1013 0348 075 078 071 075
3 10977 1291 0489 092 099 100 096
4 5705 0550 0194 048 042 040 044
5 9135 0913 0273 076 070 056 070
6 11977 1245 0379 100 096 078 094
7 3820 0377 0106 032 029 022 029
8 7227 0898 0354 060 069 073 066
9 11289 1302 0373 094 100 076 093
重复试验2 1 3636 0283 120 030 022 024 025
2 9139 1029 0355 074 079 071 075
3 11158 1320 0501 091 101 100 097
4 5620 0553 0196 046 042 039 043
5 9339 0953 0284 076 073 057 071
6 12311 1291 0391 100 099 078 095
7 3903 0392 0111 032 030 022 029
8 7231 0904 0359 059 069 072 065
9 11233 1310 0376 091 100 075 091
  通过直观分析可以看出,4个因素影响力大小
为B>D>C>A,最佳实验方案为 A2B3C2D3。方
差分析可以看出4个因素的3水平之间的差异有显
著性意义,见表5。2次重复实验之间的差别无显著
意义。排除了实验操作的误差。最后优选出吴茱萸
汁的最佳制备工艺为煎煮 3次,首次加水量为 12
倍,浸泡半小时后煎煮45min,第2次加8倍水煎煮
20min,第3次加6倍水煎煮20min。
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表5 方差分析
因素 离差平方和 f 均方 F P
校正模型 1215(a) 9 014 243023 000
截距 778 1 778 13994890 000
重复试验 556×10-6 1 556×10-6 010 076
浸药时间 002 2 001 14560 000
煎煮次数 117 2 058 1049530 000
煎煮时间 002 2 001 19630 000
煎煮水量 001 2 001 9880 000
误差 000 8 556×10-5
总合 899 18
校正 122 17
  注:a.R2=1000(校正R2=0999)。
3 讨论
31 指标成分选择的依据
吴茱萸包括生物碱、苦味素、挥发油这3大类主
要成分及其他成分。经实验研究发现吴茱萸汁的制
备过程中(水煎)挥发油已经基本损失,吴茱萸汁中
仅含少量或者不含挥发油类成分,因此挥发油类成
分在吴茱萸汁中不占主导地位。且经 HPLCMS实
验研究确定吴茱萸汁的主要成分为吴茱萸碱、吴茱
萸次碱等生物碱类成分和吴茱萸内酯等苦味素类成
分。从药理作用上来看:吴茱萸碱、吴茱萸次碱与吴
茱萸内酯三者都有镇痛抗炎的药理作用,吴茱萸碱
又能调节体温、吴茱萸次碱保护胃黏膜抗溃疡,这些
药理作用可能在“抑制黄连的苦寒之性,使黄连寒
而不滞,治疗肝胃不合呕吐吞酸”中起着关键的作
用。因此选择吴茱萸碱、吴茱萸次碱和吴茱萸内酯
作为指标成分。
32 正交试验影响因素的选择
吴茱萸汁的制备工艺各地差异较大,2005年版
《中国药典》在黄连炮制项下规定“取吴茱萸,加适
量水煎煮,煎液”;全国中药炮制规范则规定“取净
吴萸,加水适量,煎煮半小时,去渣取汁”,各地炮制
规范中吴茱萸汁的煎煮时间、加水量等均不相同,因
此本实验将浸药时间、煎煮时间、煎煮次数、首次煎
煮的加水量作为该辅料的4个因素。
33 液相色谱条件的选择
331 色谱柱及流动相的选择 比较了AgilentC18
色谱柱与 KromasilC18色谱柱对吴茱萸汁3种成分
的分离效果,结果显示前者能使吴茱萸内酯、吴茱萸
碱、吴茱萸次碱达到基线分离,而用 KromasilC18色
谱柱则吴茱萸内酯与其他成分未能达到基线分离,
因此确定使用 AgilentC18色谱柱。本实验参照文献
[9]并进行流动相的优化,确定以乙腈水四氢呋
喃冰醋酸(40∶60∶1∶02)为流动相。
332 供试品溶液制备方法的选择 在回流溶剂
的选择上进行了实验研究,比较了乙腈水的比例从
10∶0~0∶10作为回流溶剂对有效成分的溶出影响,
结果得出当乙腈水(6∶4)时,有效成分的溶出率
最高。
333 检测波长的确定 吴茱萸内酯的最大吸收
203nm,吴茱萸碱225nm,吴茱萸次碱343nm。当
检测波长225nm时吴茱萸内酯、吴茱萸碱能够基线
分离,而吴茱萸次碱的分离度较差,峰面积也较低,
但在343nm时,吴茱萸次碱能够达到基线分离,并
且吸收最大。而203nm受末端吸收影响太大。因
此选定225,343nm2个波长作为检测波长。
4 小结
本实验采用 L9(3
4)正交设计表,以浸药时间
A(0,05,1h)、煎煮次数 B(1,2,3次)、煎煮时
间 C(30,45,60min)、首次煎煮加水量 D(8,10,
12倍)4因素3水平进行了吴茱萸汁的制备工艺
研究,采用运用综合加权评分法对实验结果进行
分析,得出的最佳工艺为 A2B3C2D3,即煎煮3次,
首次加水量为12倍,浸泡半小时后煎煮 45min,
第2次加8倍水煎煮 20min,第 3次加 6倍水煎
煮20min。经中试验证,该制备方法简单易操
作,适合于大工业生产。
吴茱萸汁作为炮制辅料,是在炮制过程中加入,
其质量的优劣直接影响萸黄连的质量。吴茱萸汁的
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制备工艺是确保该辅料质量的主要因素,对其进行
制备工艺研究对于保证饮片质量、确保临床疗效具
有重要意义。本实验仅是萸黄连研究的开端,把好
吴茱萸汁的质量关,为今后揭示萸黄连炮制机制奠
定了实验基础。
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Optimalprocessingtechniquesofpreparingevodiaejuice
byorthognalexperiment
HANXuyang1,2,BIANBaolin1,LIRaorao1,ZHANGZhijie1,MAYinlian1,YUANSitong1
(1InstituteofChineseMateriaMedica,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100700,China;
2JiangxiColegeofChineseTraditionalMedicine,Nanchang330006,China)
[Abstract] Objective:TostudyandestablishtheoptimaltechnologyforthepreparationofevodiaejuiceMethod:Thecontents
ofevodiamine,rutaecarpineandevodinweresimultaneouslydeterminedwithHPLC,andeachyieldofthethreecompoundswerechosen
astheevaluatingindicatorTheorthogonaltestcoupledwiththeweightedcoeficientmethodwereadoptedtoacquiretheoptimaltech
nologyforthepreparationofevodiaejuiceResult:Thestudyshowedthattheoptimaltechnologyforthepreparationofevodiaejuice
wasasfolows:decoctedthreetimeswhilethefirsttimewaswith12foldofwatersocked30minutesanddecocted45minutes,thesec
ondtimewaswith8foldofwaterdecocted20minutesandthethirdtimewaswith6foldofwaterdecocted20minutesConclusion:
ThismethodissimpleandaccurateTheoptimaltechnologyissuitableforindustrymanufactureofevodiaejuice
[Keywords] evodiaejuice;preparationtechnology;orthogonaltest
[责任编辑 周驰]
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