全 文 ：桑遗传转化体系的建立及槲皮素合成的研究
李想韵!*! 朱鸿! 孙一铭!*! 孙敏!*!
,西南大学 生命科学学院! 重庆 &$$%%
*,三峡库区生态环境教育部重点实验室! 重庆 &$$%#
$摘要%!目的&建立桑的遗传转化体系$并对其毛状根生长特性和次生代谢产物槲皮素含量进行探索) 方法&利用卸甲
型根癌农杆菌410#P.!*0%6+!6+*A.%*)&<(< 侵染桑的黄化无菌苗$建立毛状根的诱导与培养体系*优化毛状根的扩大培养
条件并测定其生长曲线$对桑毛状根R4I;3转化结果进行 E<>检测*利用 >E4YE`<检测槲皮素的含量) 结果&用 <(< 侵
染无菌苗外植体$侵染 $ /N1&分别预培养&共培养 * Q及添加质量浓度为 $$ /D.`e的乙酰丁香酮!38可得最高转化率*
E<>检测结果表明$发根农杆菌>N质粒的0#-G$0#-<基因片段已整合入桑的毛状根基因组中*<(< 侵染桑黄化无菌苗茎段
$ Q后$茎段伤口处陆续产生毛状根$)$ Q后幼茎上产生毛状根的外植体达 7*j*在 =*98 l$g$ /D.`e :G3液体培养基
中培养 $ Q后$由YE`<检测结果表明$毛状根中槲皮素含量相比于原植株增加了 (g 倍) 结论&成功建立桑科毛状根诱导与
离体培养体系$为其他木本植物毛状根培养的研究提供了参考$并进一步为槲皮素等药用活性成分的工业化生产奠定了基
础)
$关键词%!桑* 遗传转化* 毛状根* 槲皮素* YE`<
$稿件编号%!*$$7*)$*
$基金项目%!三峡库区生态环境教育部重点实验室开放基金项目
!UH*$$#$7
$通信作者%!!孙敏$教授$博士生导师$主要从事植物生物学与生
物技术研究$RMS#!$*)#(*&7$$U4/BNS# 0+-O/2O+T,MQT,-1
$作者简介%!李想韵$硕士研究生$主要从事植物生物学与生物技
术研究$RMS# )(()#*#(7$U4/BNS# 5T1%)2O+T,MQT,-1
!!桑B#06&.-P. ,`是桑科9.CB-MBM桑属B#06&多
年生双子叶木本植物) 我国是世界上桑树资源最丰
富的国家$该植物作为药用植物已有很长历史+, )
桑科植物主要药用化学成分为黄酮类化合物+*4), $其
中槲皮素具有抗肿瘤&抗炎&抗血小板聚集&扩张冠
脉等作用+&, ) 发根农杆菌含有 >N质粒$利用其 R4
I;3在 [NC基因胁迫下整合到植物核基因组中$诱
导宿主植物体产生毛状根!?BNCC..@ +, *利用毛状
根生长速度快&分支多&并能持续合成次生代谢产物
等显著特点+#,来生产植物次生代谢产物中的药用
活性成分$已有很多报道+%47, ) 但利用农杆菌对桑科
植物进行遗传转化$利用桑毛状根来生产药用成分$
目前未见报道) 本研究利用卸甲型根癌农杆菌
<(< 侵染桑的黄化无菌苗$从黄化苗幼茎中成功
诱导出毛状根$建立了桑科毛状根诱导与离体培养
体系$其毛状根生产的槲皮素含量相比于原植株增
加了 (g 倍$为今后利用遗传转化对药用植物活性
成分进行工业化生产奠定基础)
!材料与方法
U!黄化无菌苗的获得
桑种子由西南大学余茂德教授惠赠) 选取饱满
的种子在清水中浸泡 $ ?$然后用 %$j的乙醇浸泡
消毒 )$ O$再用 $gj的升汞浸泡消毒 ( /N1$无菌水
冲洗 k# 次$接种于 98 固体培养基上$分 * 批分
别于!* p h恒温培养箱中暗培养和 ) $$$ S6下
光照培养) % Q后种子露白$& Q 后种子萌出子叶$
*$ Q后暗培养种子长成高约 -/的黄化幼苗$光照
培养的种子长成高约 *g -/的正常桑苗$选择茁壮
幼苗作为转化外植体)
U!毛状根的诱导与培养体系的建立
UU !菌种活化!将 e%$ h下保存的 <(< 菌
种按 i $$$ 的比例接种于 aUG液体培养基中$同
时添加>NP!利福霉素至质量浓度 &$ /D.`e$*(
h$*$$ C./N1
e活化 *& ?$再按 i $$$ 的比例转
至aUGl*$ /D.`e JB1 !卡那霉素液体培养基
中&添加质量浓度为 $$ /D.`e的 38!乙酰丁香
酮$于 *( h$*$ C./N1e进行 * 次活化$# k% ?
后菌液4
#$$
达 $g) k$g& 时接种侵染桑幼苗外植体)
UU!毛状根诱导!将无菌苗真叶&幼茎接种在
98固体培养基上$黑暗条件下&!* p h预培养
$ k& Q$用活化好的菌液侵染外植体 ( k* /N1$取
.7).
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VT1M$ *$$
出后用滤纸吸干菌液$置于 98 l$$ /D.`e 38
的滤纸培养基上共培养 $ k) Q$用无菌水冲洗干净
后接种于附加 $$ /D.`e
菌$再转入98固体培养基上诱导毛状根)
UU&!毛状根离体培养体系的建立!待毛状根长
约 $g -/时$选择颜色白且粗壮的毛状根$将其剪
下$接种于 =*98 l:G3液体培养基中&) C.
/N1
e
$于!* p h条件下暗培养$每 % Q 继代
次*或不剪下&连同外植体一起接种在 =*98 固体
培养基上&!* p h暗培养$每 & Q 继代 次) $
Q后收获单克隆毛状根并测鲜重$每个单克隆取少
量用于分子检测$其余液氮速冻后备用于槲皮素含
量检测)
U&!毛状根的E<>检测
根据HTC1MC等+$,的 >N质粒序列设计 0#-G和
0#-<的引物) 0#-G基因的正向引物为 A0#-G# c4
F
h退火 &$ O$%* h反应 /N1$) 个循环*最后 %* h
延伸 ( /N1) E<>扩增产物用 $gj琼脂糖凝胶
!F.SQ4dNM+染色电泳!*$ [$$$ /3$*$ /N1进行
检测) 电泳结果于凝胶成像系统!][*#$ 1/下观
察分析)
U_!毛状根中槲皮素的提取及含量测定
U_U!槲皮素的提取+4),!将桑叶&自然根和毛
状根于 $ h烘箱中杀青 *$ /N1$然后于 #$ h烘箱
中干燥 *& ?) 各称取粗粉 D$各加 $ /` 甲醇萃取
过夜$& $$$ C./N1e离心 /N1$上清液转入 $$ /`
量瓶$滤渣再加 $ /` 甲醇于 $ h超声提取 &$
/N1$同法操作) 合并 * 次滤液$过 $g*
/微孔滤
膜后用甲醇定容至 $$ /` ) 加石油醚萃取过夜脱
脂$弃上层萃取液$下层溶液置于棕色瓶中保存在 &
h冰箱中备用)
U_U!利用 >E4YE`<检测槲皮素的含量+4*,!
XB@MCO*&(% 高效液相色谱仪!美国$槲皮素对照品
!上海生物工程技术有限公司$ 批号 $$$(4
*$$&$#$甲醇为色谱纯$磷酸为分析纯) 85//M@C54
<
(
色谱柱!&g# //m$ //$
/*流动相甲醇4
$g&j磷酸溶液 !%$ i)$$ AY )g *流速 /` .
/N1
e
*柱温 * h*检测波长 )%$ 1/*进样量 $
)`
精确称取槲皮素对照品 * /D$加甲醇溶解并
定容至 * /` $配制成质量浓度为 D.`e的对照
品储备液) 取上述储备液 /` $用甲醇定容至 $
/` $在上述选定色谱条件下分别进样 *g$$%g$
$$
)` 以进样量为横坐标$测得峰面积为纵坐
标$绘制标准曲线$得槲皮素的线性回归方程) 从冰
箱中取出槲皮素提取样品$在上述选定的色谱条件
下$每次进样 $
$`测得各样品中槲皮素的含量)
!结果与分析
U!毛状根的诱导与扩大培养
感染<(< 菌株的无菌黄化苗幼茎离体培养 %
Q后$外植体伤口处开始出现少量白色的愈伤组织$
结果表明$分别预培养&共培养 * Q 为宜*$ Q 后有
毛状根从愈伤处长出$)$ Q 后$侵染时间为 $ /N1
的幼茎上产生毛状根的外植体达 7*j) 其余外植
体$因伤口处有大量农杆菌繁殖而腐败死亡的为侵
染过度和共培养过度者*未经侵染的外植体于 )$ Q
后整个褐化坏死)
桑毛状根代谢旺盛&易褐化$每 % Q 继代 次为
宜$且选用具有毛状根显著特征的单克隆进行培养)
剪下的长约 //的毛状根在 =*98 l$g$ /D.
`
e
:G3液体培养基中离体培养$离体毛状根开始
进行伸长生长并不断分支!图 $$ Q 后平均每个
单克隆系毛状根的干重增加了 $g 倍)
3,真叶上诱导出的毛状根*G,在 =*98固体培养基上真叶毛状
根逐渐生长且褐化*<,正常苗幼茎上长出短小的毛状根*I,黄
化苗幼茎上诱导出的毛状根*U,在 =*98 l:G3$g$ /D.`e
固体培养基上离体培养的毛状根*H,离体培养出现愈伤组织的
毛状根*F$Y,在 =*98 l:G3$g$ /D.`e液体培养基中离体
培养的多分支的毛状根)
图 !桑毛状根的离体培养
U!毛状根中0#-G$0#-<基因+&,的E<>检测
.*7).
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VT1M$ *$$
采用
根I;3为模板的扩增产物作阴性对照$鉴定毛状根
的转化片段) 用于检测的 *$ 个经 $$ /D.`e
基因片段!图 *$由此证明桑毛状根整合了 <(<
菌株质粒的R4I;3片段)
U&!槲皮素含量检测
U&U!槲皮素对照品的 >E4YE`<线性关系!在
上述色谱条件下$槲皮素对照品含量与峰面积的
线性关系良好) 线性方程为 9f%# *$)Jl
* ##(!G
*
f$g77# * $J表示进样量$9表示峰
面积)
U&U!槲皮素对照品和样品的>E4YE`<图!槲皮
素对照品的 >E4YE`<结果表明$该色谱条件下槲
!!
9,核酸相对分子质量标准 I` * $$$*Y kY,不同的
毛状根单克隆系*;,阴性对照!桑自然根*
E,阳性对照!<(< 菌株质粒)
图 *!桑毛状根0#-G$0#-<基因片段的E<>检测
皮素的保留时间为 *g#)( /N1) 以峰面积计$按外标
法+#,分别计算桑叶&自然根和毛状根中槲皮素的质
量分数$分别为 &#g*$&#g#$& *7*g7
D.D
e
) 毛
状根中槲皮素含量相比于原植株增加了 (g 倍
!图 ))
3,槲皮素对照品*G,桑自然根*<,桑叶片*I,桑毛状根)
图 )!槲皮素对照品和样品的>E4YE`<图
&!讨论
根癌农杆菌 <(< 经/INOBC/MQ0改造后$保留
YMSAMC质粒并导入 A>N3& 质粒$失去了使宿主植物
产生冠瘿瘤的能力而发展成为发根农杆菌+%, $可诱
导宿主植物体产生毛状根) 毛状根具有生长速度
快&分支多&并能持续合成次生代谢产物等显著特
点+#, $可用来生产有用的植物次生代谢产物) 桑科
植物内源酚类物质丰富+(, $导致其离体材料在组织
培养过程中极易褐化$这可能是桑科植物毛状根诱
导无一例成功报道的原因之一) 本研究表明$采用
全程暗培养的方式诱导和培养桑的毛状根$可大大
降低褐化程度$以保证毛状根最大的生长量$从而积
累尽可能多的次生代谢产物*勤换培养基是减少褐
化的有效手段$通常情况下$在毛状根扩大培养过程
中每 *$ Q更换 次新鲜培养基$但对于桑科木本植
物$最多 % Q就必须更换 次新鲜培养基) 作为木
本植物$桑毛状根的诱导在外植体选择&侵染时间和
共培养天数上都与其他草本植物和藤本植物有较大
的不同$在毛状根的培养过程中还需要适当添加激
素才能使其生长速度大于褐化速度$以达到扩大培
养毛状根的目的)
通过>E4YE`<对槲皮素进行含量检测$结果表
明桑的叶&自然根和毛状根中均含有槲皮素$与张敉
等+7,的研究结果!桑白皮中黄酮类不包含槲皮素
有一定差异$原因可能在于本实验采用了 >E4YE`<
技术检测含量$精确度高于一般的光谱检测技术*桑
叶中槲皮素的含量为桑自然根!桑白皮中槲皮素
含量的 7g%7 倍$与陈菁菁等+*$,的研究结果一致*桑
毛状根中槲皮素的含量比原植株提高了 (g 倍) 证
明利用毛状根转化技术能够使桑毛状根产生比原植
株中含量更高的槲皮素$这为实现扩大生产该植株
中的其他有效药用成分创造了可行条件)
$参考文献%
+ ,!肖霞$李书渊,桑的药用历史和功效+V,,四川蚕业$*$$%$*#
.)7).
第 ) 卷第 期
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!!!!!! ! ! ! ! ! !!!! ! ! ! !
[.Sg)$ :OOTM!
VT1M$ *$$
#,
+ * ,!买买提.依明$特拉津.那斯尔$夏庆友$等,新疆沙漠桑树
营养成份的分析和药用价值的探讨+V,,北方蚕业$*$$($*7
!# *$,
+ ) ,!唐忠富,桑资源的药用开发与利用+V,,蚕桑通报$*$$($)7
!# #,
+ & ,!王艳芳$王新华$朱宇同,槲皮素药理作用研究进展+V,,天
然产物研究与开发$*$$)$!*# %,
+ ,!%*)&N1OMC@OR4I;3N1@.@?MDM1./MO.P@?M?.O@ASB1@C..@-MSO
+V,,;B@TCM$ 7(*# *7,
+ # ,!FNCN3$ B`ZO?/N;BCBOT 9,RCB1ODM1N-?BNC5C..@O#CM-M1@@CM1QO
B1Q BAASN-B@N.1O+V,,GN.@M-?1.S3Qd$ *$$$$ (# ,
+ % ,!王淑芳$孙一铭$雷桅$等,粘毛黄芩毛状根培养体系的建立
及其黄芩苷的动态合成+V,,中国中药杂志$*$$($))!&#
##7,
+ ( ,!孙敏$曾建军,长春花毛状根培养及抗癌生物碱产生的研究
+V,,中国中药杂志$*$$$)$!$# %&,
+ 7 ,!孙敏$汤绍虎$杨兰英,转化毛状根获得萝芙木生物碱的研究
+V,,生物工程学报$77)$7!)# *(%,
+$,!_?B1D` $ IN1D>K$ $ M@BS,U1DN1MMCN1D@C.AB1M\N.4
O51@?M@N-AB@?+B5N1 K2#.2.+6&)%1*0?BNCC..@-TS@TCMO+V,,
EC.-;B@S3-BQ 8-N]83$ *$$&$ $# #%(#,
+,!孙莲$严雷$石骁呢$等,>E4YE`<测定桑叶&桑枝和桑花中
槲皮素和山奈酚的含量+V,,药物分析杂志$*$$$*!$#
*)$,
+*,!戴开金$罗奇志$侯连兵,YE`<法测定桑叶中芦丁&绿原酸
和槲皮素+V,,南方医科大学学报$*$$7$*7!)# %7,
+),!王立$姚惠源$陶冠军$等,乌饭树树叶中槲皮素的提取分离
与鉴定+V,,食品与生物技术学报$*$$$*&!&#(7,
+&,!IN-.SB$ <.O@B1@N1.E$ 8AB1.` ,
+V,,95-.O5O@M/$ *$$$$7!)# &)&,
+#,!周卫军$唐恒胜$刘文英,>E4YE`<外标法测定黄体酮含量
+V,,中南药学$*$$$)!*# %(,
+%,!9.W.R$ Y..5ZBBOEVV,USM-@C.A.CB@N.1 .P/MDBASBO/NQON1@.
410#P.!*0%6++V,,ESB1@9.SGN.S$ 77$## 7%,
+(,!YNCBZTCBJ$ HT0N/.@.a$ HTZBNR$ M@BS,R+.A?M1.SN-DS5-.4
ONQMOPC./@?MC..@\BCZ .P@?M-TS@NdB@MQ /TS\MC5@CMM!B#06&
S?.d+V,,V;B@EC.Q$ 7(#$&7!*# *(,
+7,!张敉$陈曼$孙视$等,桑白皮的化学成分研究!
!
+V,,中
国中药杂志$*$$7$)&!*# #$,
+*$,!陈菁菁$李向荣,微波萃取法提取桑叶和桑白皮的黄酮类成
分+V,,中药材$*$$#$*7!$# $7$,
+*,!杨雪清,木本曼陀罗毛状根诱导及其植株再生+I,,重庆#
西南大学$*$$%,
*IB-L/.IC,?AB@JBE-AIJ@E,-B.@AIDIB?,.A,G/L?EED -AF
L.@IDABC?I.I@JVG?ER?B.A
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+MCMBOP.S.+O# $ /N1T@MOnN1PM-@N.1$@+.4QB5OACM4-TS@TCMB1Q -.4-TS@TCM$BQQN@N.1BS?5QC.65SB-M@.O5CN1D.1M!3O $$ /D.`
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-./A.T1QOOT-? BObTMC-M@N1,
+ ?^D Z@EFI,!/TS\MC5* DM1M@N-@CB1OP.C/B@N.1* ?BNC5C..@O* bTMC-M@N1* YE`<
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$责任编辑!吕冬梅%
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