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Isolation, identification and anticancer activity of an endophytic fungi from Juglans mandshurica

一株具有抗HepG2活性的胡桃楸内生真菌的分离及研究



全 文 :·研究论文·
一株具有抗 HepG2活性的胡桃楸内生真菌的
分离及研究
李美芽1,吴运帷1,蒋福升2,于湘莉1,唐克轩1,苗志奇1
(1.上海交通大学 农业与生物学院,上海 200240;
2.浙江中医药大学 生命科学学院,浙江 杭州 310053)
[摘要] 目的:从胡桃楸树皮部分离抗癌活性菌株,筛选抗癌活性菌株,进行菌种鉴定,并对其发酵产物体外抗癌活性进
行初步研究。方法:采用菌丝顶端纯化法从胡桃楸树皮部分离、纯化抗癌活性菌株;以MTT法对上述活性菌株发酵液体外抗
癌活性进行初步评价;形态学观察结合ITS序列分析法对筛选出的高抗癌活性菌株进行了菌种鉴定;单独对高抗癌活性菌株
进行了体外抗癌活性试验。结果:分离得到 FSN001~014共14株内生真菌,初步评价发现菌株 FSN006具有较强的抗癌活
性,鉴定为半知菌亚门,丝孢纲,丛梗孢目,木霉菌属长枝木霉。MTT结果显示 FSN006发酵液对人肝癌 HepG2细胞具有明显
的生长抑制作用,在稀释20倍后仍能达到半数抑制效果。同等条件下阳性对照药姜黄素的IC50为1149mg·L
-1。同时发酵
液对正常肝细胞HL7702的抑制程度仅相当于癌细胞抑制率的1/4左右,表现出较好的癌细胞选择性,有望开发成一种水溶
性的高效低毒的抗癌药物。结论:胡桃楸树皮部存在多种内生真菌,其中分离得到的一个菌株具有较强的抗癌活性;其抗癌
活性成分及其是否与胡桃楸中抗癌活性物质存在相关性等问题有待进一步深入研究。
[关键词] 胡桃楸;内生真菌;发酵液;抗肿瘤
[收稿日期] 20081120
[基金项目] 国家自然科学基金项目(30700061);国家高技术研究
发展计划(863)重点项目(2007AA021501)
[通信作者] 苗志奇,Tel:(021)34206180,Email:zqmiao@sjtu.
edu.cn,zm46@cornel.edu
[作者简介] 李美芽,硕士研究生,Tel:(021)34206180,Email:
lmeiya@126.com
  植物内生真菌(endophyte)是指其生活史的某
一段时期生活在植物组织内,对植物组织没有引起
明显病害症状的真菌,包括那些在其生活史的某一
阶段营表生的腐生菌,对宿主暂时没有伤害的潜伏
性病原菌和菌根菌[1]。其中,某些内生真菌长期
生活在植物体内的特殊环境中,与宿主协同进
化[2],与宿主共同进化的内生真菌可能从宿主获
得相关基因的直接传递,具有与宿主相同的次生代
谢产物合成途径[3]。我国是药用植物大国,资源
丰富,有记载的药用植物 11020种,隶属 2313
属,383科,约占药用资源总数的87%[4]。但目前
绝大多数药用资源来自野生,考虑到植物内生真菌
可能具有与宿主植物相同的代谢合成途径,也就可
能具有类似功能的产物,加上微生物具有繁殖迅
速,容易培养,易于控制,生物量大,不受季节、
气候、地域等自然条件限制,且发酵成本低,易于
通过现代生物技术等改造遗传形状等优点,人们把
目光转向从药用植物中分离内生真菌研究,以期获
得产药用物质的内生真菌。这类内生真菌将是一种
很有潜力的药物来源。
胡桃楸JuglansmandshuricaMaxim是胡桃科胡
桃属的落叶乔木,主要分布于我国黑龙江省东部小
兴安岭、完达山以及张广才岭等山区,为我国珍贵树
种之一[5]。楸树中含有丰富的环烯醚萜类化合物,
不仅有利尿、降血糖作用,还有抗炎、抗氧化、神经保
护作用[6]。王春玲等[78]认为胡桃楸提取液是通过
诱导细胞凋亡从而起到抗肿瘤作用的[8]。胡桃楸
的抗肿瘤研究预示其内生真菌也可能具有产抗癌物
质的能力,因此本研究从胡桃楸树皮部内生真菌入
手,通过形态特征和基因序列特征鉴定纯化后的内
生真菌,寻找高抗癌活性的菌株,以期为治疗癌症提
供新的药物来源。
1 材料
1.1 植物
胡桃楸J.mandshurica树皮,于2006年3月采
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自河北省太行山区,海拔1500m,经浙江中医药大
学丁志山教授鉴定。
1.2 细胞株
人肝正常细胞 HL7702购自中国生命科学院
生化与细胞所;人肝癌HepG2细胞株由浙江中医药
大学生命科学学院分子与遗传研究室赠送。
1.3 试剂和器材
RPMI1640培养基(吉诺生物医药技术有限公
司,批号07012501),MTT(Fluka,批号2060695)、小
牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司,批号
071229)、胰蛋白酶(国药集团化学试剂有限公司,
批号F20080423)、姜黄素(上海爱思试剂有限公司,
批号20060609)、细胞培养板及细胞培养瓶(Nun
clon公司)、二氧化碳细胞培养箱(Thermo公司,HE
PAclass1000)。
1.4 培养基
PDA培养基:200g新鲜土豆,去皮后煮沸 30
min后,过滤收集滤液,20g葡萄糖,加水至1L,pH
68~70,固体培养基加15%琼脂,高压灭菌。
CM,CMX培养基[9],溶液 A:100mL水溶解
CaNO3·4H2O10g;溶液B:100mL水溶解KH2PO4
20g,MgSO4·7H2O25g,以及 NaCl15g调 pH
为53;溶液C:CuSO4·5H2O3930mg·L
-1,FeCl3
·6H2O9482mg·L
-1,H3BO3572mg·L
-1,KI
131mg· L-1,MnSO4· H2O604mg· L
-1,
(NH4)6Mo7O24·4H2O368mg·L
-1,ZnSO4·H2O
54900mg·L-1避光保存,加CHCl32mL·L
-1。
CM培养基:溶液A10mL·L-1,溶液B10mL
·L-1,溶液C05mL·L-1,酵母提取物1g·L-1,
酪蛋白酶水解物 05g·L-1,酪蛋白酶酸水解物
05g·L-1,葡萄糖 10g·L-1。
CMX培养基配方将葡萄糖换成木糖,其他同
CM培养基。
2 方法
2.1 楸树内生真菌的分离纯化及发酵培养
2.1.1 楸树内生真菌的分离 取胡桃楸树皮刮去
浮皮,在自来水下冲洗20min后置于无菌超净工作
台,用无菌水冲洗3~4遍,75%乙醇浸泡3~5min,
然后用1% NaClO消毒处理20min,无菌水反复洗
涤4~5遍,用无菌纸吸干树皮上的无菌水,削去黑
色表层,切取05cm×05cm的小块,置于 PDA固
体平板培养基上,每皿3块,放入25~28℃培养箱
中培养。
2.1.2 楸树内生真菌的纯化 取组织块切口处新
长出的菌丝,及时转接至新鲜的 PDA培养基上培
养,待菌落长出后,根据菌落形态、颜色的差异以
及长出时间的不同,分别挑取各平板上菌落边缘处
的菌丝接于新的 PDA平板上进行分离培养。采用
菌丝顶端纯化法逐步纯化,对菌株进行编号,观察
并记录菌株生长形态,然后放入4℃冰箱保存。
2.1.3 内生真菌诱导孢子培养 将长有菌丝的
PDA培养基切下一小块,放于 CMX培养基上,于室
温下培养,2d后可见有孢子长出,挑取孢子及菌丝
在显微镜下观察。
2.1.4 内生真菌液体发酵培养 挑取分离纯化后
的菌株孢子转接到装有250mLCM液体培养基的
三角瓶中,28℃,150r·min-1摇床振荡培养,1周
后终止发酵,记录菌体生长形态,收集菌液用于抗肿
瘤活性初步分析。
2.2 发酵液抗肿瘤活性初步分析
2.2.1 发酵液的预处理 将发酵液经12000r·
min-1离心10min后,取上清液过022μm滤膜过
滤2次,4℃保存备用。
2.2.2 发酵液对人正常肝细胞以及肝癌细胞株增
殖的影响 用含10%FBS的 RPMI1640培养液培
养的HepG2细胞株以及 HL7702细胞株以1×104
个/孔接种于96孔板,37℃,5%CO2的培养箱中培
养,24h后用系列梯度稀释后的发酵液处理细胞,
每个浓度6个复孔,以未发酵的 CM培养液作空白
对照,以姜黄素作为阳性对照,于37℃,5%CO2的
培养箱中培养,培养至24h后,加入 MTT孵育4h
后,吸弃上清液,加入 150μL/孔 DMSO振荡 10
min,在酶联免疫监测仪上检测570nm处的吸光度
(A)。重复3次,按下列公式计算抑制率。以相同
方法检测对正常肝细胞增殖情况的影响。
IC=(对照组A-实验组A)/对照组A×100%
2.3 真菌的分子生物学鉴定
2.3.1 真菌DNA的提取 将具有抗肿瘤活性的真
菌在CM液体培养基中进行发酵培养,菌体用4层
无菌纱布过滤,先用无菌水冲洗 2次,然后分别用
PBS溶液和无菌生理盐水分别冲洗2~3次,无菌滤
纸尽量挤干水分;将菌体加入灭菌研钵中,倒入液氮
迅速研磨至菌丝体成粉末状;然后按照 SWirsel等
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1996年报道的方法[10]提取真菌DNA。
2.3.2 ITS序列扩增、测定 采用通用引物 ITS1,
ITS4扩增 ITS序列:ITS118SF(5′TCCGTAGGT
GAACCTGCGG3′);ITS428SR(5′TCCTCCGCT
TATTGATATGC3′)。按常规的 50μL体系进行
PCR扩增,PCR扩增程序为:94℃预变性4min,94
℃变性1min,53℃退火1min,72℃延伸45s,35
个循环,最后 72℃延伸 10min,4℃复性 10min。
反应结束后取5μLPCR扩增产物通过1%琼脂糖
凝胶电泳检测。对于检测为好的 PCR产物再次进
行1%琼脂糖凝胶电泳,电泳结束后切胶回收 PCR
产物,用 pMD18T试剂盒将产物连接到 pMD18T
Vector上,送上海英俊生物公司进行测序。测序结
果采用BLAST分析。
3 结果和分析
3.1 菌株分离及纯化
按照2.1.1方法步骤无菌操作接种了81小块
(共27皿)楸树树皮材料于 PDA培养基上,于 25
℃培养2d后,其中部分周围开始出现真菌菌丝,5
d后统计共62块与培养基接触处已形成明显真菌
菌落。然后将各菌落转接至新鲜的 PDA培养基上
培养,待菌落长出后,根据菌落形态、颜色等差异
分别挑取各平板上菌落边缘处的菌丝接种于新的
PDA平板上进行分离培养。采用菌丝顶端纯化法
逐步纯化,根据颜色和菌丝形态的不同,最终分离
到了14株真菌,编号为 FSN001~FSN014。
3.2 抗肝癌活性菌株筛选
将上述14株真菌分别进行液体发酵培养1周,
收集上清液12000r·min-1离心10min,然后用
022μm滤膜过滤2次,4℃保存备用。取指数生
长期的HepG2细胞,以1×104个/孔接种于96孔
板,150μL/孔,并于 37℃,5%CO2的培养箱中
培养,24h后加入50μL前述处理好的1~14株真
菌发酵液处理细胞(即发酵液4倍稀释处理细胞),
每个发酵液处理6个复孔,以未发酵的CM培养液
作空白对照,以姜黄素作为阳性对照,于 37℃,
5%CO2的培养箱中培养,24h后 MTT观察抗肿瘤
活性。菌株FSN006发酵液对体外培养的HepG2肿
瘤细胞的抑制活性非常强(表1),其4倍稀释液抑
制活性大于姜黄素120mg·L-1处理组,而其他
菌株发酵液对 HepG2肿瘤细胞的抑制率都小于
20%,为此,对抗癌活性较强的 FSN006菌株做进
一步研究。
表1 各发酵液体对HepG2细胞增殖抑制率 %
样品 抑制率 样品 抑制率
1 1204±182 9 901±105
2 1675±201 10 1910±135
3 1376±152 11 285±041
4 703±098 12 1786±210
5 2023±139 13 1294±162
6 8002±195 14 1110±124
7 581±054 15 5986±212
8 1196±112    
  注:1~14.FSN001~FSN014发酵液样品50μL;15.阳性对照品
姜黄素120mg·L-1。
3.3 FSN006菌株形态特征
将FSN006菌株接种于PDA平板上,室温下其生
长迅速,并形成白色绒状辐射状菌落。PDA平板上生
长的FSN006能够合成并分泌黄色色素类物质,从反
面可以观察到培养基和接触培养基的菌丝都呈现出
均匀的淡黄色。液体CM摇瓶培养体系中FSN006形
成均匀的圆形菌球,菌球表面粗糙有针状突起,质地
疏松;和固体培养一样,FSN006在液体培养过程中产
生大量黄色色素,使菌球呈现为黄色,同时部分色素
分泌到培养液中,使得发酵液也呈现淡黄色;此外,该
发酵液还具有一种特殊的芳香气味。CMX培养基为
LeachJ等[9]用于诱导真菌产生孢子的特殊培养基,
同样该培养基可迅速诱导FSN006菌株在2d时产生
绿色孢子,从而使菌落变成绿色(图1)。
A.PDA平板正面观;B.PDA平板反面观;
C.分离纯化后的发酵液菌体形态;D.CMX平板正面观。
图1 FSN006菌体形态
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FSN006在CMX平板养上培养2d后就可观察
到孢子的形成。肉眼观孢子为绿色,显微观察可见
孢子为椭球型,表面光滑。分生孢子梗的主轴长而
粗壮,二次分支短,且分枝呈坛形,柄梗常常单生,孢
子着生于二次分支的顶端(图2),其形态符合典型
的木霉属真菌特征,初步鉴定该菌为木霉属
真菌[1112]。
注:黑色小箭头指示的是着生于分支上的未成熟的分生孢子;
黑色大箭头指示的是成熟的已脱落的分生孢子。
图2 FSN006光学显微镜下形态特征(×100)
3.4 FSN006菌株分子生物学鉴定
采用通用的 18S,28S上保守的序列对编号为
FSN006的真菌进行分子生物学鉴定,经过 BLAST
比对分析,发现该菌与 Trichoderimalongibrachiatum
菌的同源性达100%。结合形态学分析,鉴定该菌
为半知菌亚门丝孢纲丛梗孢目木霉菌属长枝木霉。
3.5 FSN006发酵液对人常肝细胞以及肝癌细胞的
增殖的影响
MTT法结合定时显微镜观察记录显示真菌
FSN006发酵液对人肝癌细胞株 HepG2有较强的抑
制作用(图3)。67倍稀释液抑制率达7990%左
右;发酵液在10倍以上稀释浓度时对 HepG2抑制
呈一定的线形关系,对应半数抑制稀释率为20倍。
同等条件下,阳性对照药姜黄素的 IC50为(1149±
012)mg·L-1,显示FSN006发酵液的抗癌效果等
同于230mg·L-1的姜黄素。体外细胞培养实验表
明FSN006发酵液虽然对正常细胞也具有一定的抑
制或杀伤作用,但不如对肝癌细胞作用强。在实现
癌细胞半数抑制的情况下,正常细胞的抑制率不到
12%,显示出较好的癌细胞选择性。同时考虑到发
酵液成分具有较好的水溶性,避免了目前抗癌药物
水溶性差的弊端,具有良好的开发前景。
图3 不同稀释倍数的发酵液对HepG2及
HL7702增殖抑制率
4 结论
植物内生真菌是植物组织内的正常菌群,与寄
生植物间有着非常复杂的关系,研究表明,内生真菌
不仅可以促进宿主植物的快速生长,增强植物抗逆
性,而且能产生丰富的与宿主植物相同或相似的具
有生物活性的次生代谢产物[13]。1993年 Strobel
等[14]从短叶红豆杉的树皮中分离到能合成紫杉醇
的内生真菌,自此,国内外出现了从药用植物中分离
产药用物质内生真菌的热潮,这为本研究寻找抗癌
药物药源提供了新的思路。1994年,邱德有等[15]
从中国不同品种的红豆杉植物树皮中先后分离出
80多个产紫杉醇或其类似物的内生真菌菌株。
1998年,郭波等[16]从抗癌药用植物长春花中分离
到了21株真菌,其中有4株能产长春新碱类似物。
鬼臼毒素也是一类抗肿瘤物质,李海燕等[17]于1999
年从桃儿七植株中分离到了28株真菌,有2株能产
鬼臼毒素类似物。这些研究表明从产某类药用物质
的植物材料中能分离到产相同或相似物质的内生真
菌,基于微生物繁殖迅速,易于培养的优点,寻找产
药用物质的内生真菌具有广阔的应用前景。有些微
生物虽然不产与植物类似的药用物质,但能产具有
相似作用的物质,这类真菌也值得好好研究。2006
年,王兴红[18]从3属4种鬼臼类植物地下茎中分离
到了不产鬼臼毒素但是具有高抗癌活性的内生真
菌。因此,研究药用植物内生真菌是寻找抗癌物质
药源的新途径。
从楸树上分离的内生真菌FSN006,其发酵液对
肝癌细胞具有显著的抑制作用,即使在稀释20倍后
仍能实现对体外培养的肝癌细胞 HepG2的半数抑
制。同时对体外培养的正常肝细胞抑制率只有不到
12%,相当于对肝癌细胞抑制率的1/4左右,显示出
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良好的细胞选择性。通过对该真菌发酵液的进一步
分离纯化,有望进一步提高细胞选择性,获得一种全
新的高效低毒的抗肝癌药物。考虑到细胞癌变的共
性,在以后的研究中将对 FSN006的抗癌谱进行调
查,扩大其潜在应用范围,同时要分离得到活性物
质,进行深入的研究。
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Isolation,identificationandanticanceractivityofanendophytic
fungifromJuglansmandshurica
LIMeiya1,WUYunwei1,JIANGFusheng2,YUXiangli1,TANGKexuan1,MIAOZhiqi1
(1.SchoolofAgricultureandBiology,ShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai200240,China;
2.SchoolofLifeSciences,ZhejiangChineseMedicalUniversity,Hangzhou310053,China)
[Abstract] TheendophyticfungusnamedFSN006wasisolatedfromtheinnerbarkofJuglansmandshurica.Itgrewquicklyand
formedcircularcolonyonPDAplate.Theuppersideofthecolonywaswhite,whilethelowersideofthecolonyandtheconditioned
mediumwerelightyelowasaresultofsignificantyelowpigmentsubstanceswereproducedandsecretedbythefungi.Greeneliptic
conidiaappearedwhenculturedonCMXplate.BasedonthemorphologyidentificationandITSsequence,itwasclearthatthisfungus
belongedtotheDeuteromycotina,HyPhomycetes,Moniliales,Trichodermalongibrachiatum.TheconditionedmediumofFSN006
showedahighanti-tumorabilityagainstlivercancercelHepG2,andreacheditsIC50concentrationafterbeingdiluted20times,
whiletheIC50concentrationofcurcuminewas(11.49±0.12)mg·L
-1.Inaddition,therewaspreeminentselectiveinhibitingefect
againstthenormallivercelstrainHL7702anditscanercounterstrainHepG2.TheinhibitingefectagainststrainHL7702wasonly
onequarterofthatagainstHepG2attheconcentrationofIC50.Therefore,thefermentationofFSN006mayprovideapossiblewayto
produceanticancerdrugwithhighereficiencyandlowertoxicity.
[Keywords] Juglansmandshurica;endophyticfungus;fermentaltionbroth;antitumor
[责任编辑 吕冬梅]
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