全 文 ：参莲提取物对 ＴＮＦα刺激下单核细胞株
ＴＨＰ１功能的影响
李玉洁，杨庆，翁小刚，朱晓新，王怡薇，刘小霓，韩晓
（中国中医科学院 中药研究所，北京 １００７００）
［摘要］　目的：观察参莲（ＳＬ）提取物对炎症因子刺激下单核细胞功能的影响。方法：ＳＬ提取物预孵育，以 ＴＮＦα２０μｇ
·Ｌ－１为刺激因子，观察 ＳＬ提取物对单核细胞株 ＴＨＰ１黏附、迁移、摄脂、分泌功能变化的影响。结果：ＳＬ１～３（０５～２ｇ·
Ｌ－１）可明显降低ＨＵＶＥＣ和ＴＨＰ１的黏附率，与模型组比较有显著性差异。ＳＬ１～５（０１２５～２ｇ·Ｌ－１）均可显著减少 ＴＨＰ１
迁移细胞数，与模型组比较有显著性差异。ＳＬ１～５（０１２５～２ｇ·Ｌ－１）均可显著降低细胞内ＴＣ值。ＳＬ１（２ｇ·Ｌ－１）可显著降
低细胞上清中异常增高的ＩＬ６值，同时升高ＩＬ１０的含量，其他剂量未见明显作用。结论：ＳＬ提取物对 ＴＮＦα刺激下单核细
胞黏附、迁移、摄脂、分泌功能均有显著影响，其作用可能是ＳＬ提取物干预ＡＳ早期炎症反应的机制之一。
［关键词］　动脉粥样硬化；参莲提取物；炎症；ＴＨＰ１
［收稿日期］　２００９１２１６
［基金项目］　国家自然科学基金面上项目（３０９７３９０１）；国家直属科
研院所技术开发研究专项资金项目（ＮＣＳＴＥ２００７ＪＫＺＸ３０１）；中国
中医科学院自主选题项目（ＺＺ２００６１１７）
［通信作者］　朱晓新，Ｅｍａｉｌ：ｚｈｕｘｘ５９＠ｙａｈｏｏｃｏｍｃｎ
　　单核细胞与内皮细胞的相互作用是动脉粥样硬
化（ａｒｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ＡＳ）的始动环节和 ＡＳ早期炎症
发生典型特征之一。这种相互作用不仅是 ＡＳ损伤
局部炎症修复的重要方式，而且在此过程中２种细
胞的功能均发生相应变化，如单核细胞分化、增殖，
受体表达改变等［１３］。单核内皮细胞的相互作用过
程中表达和产生的诸多炎症相关生物活性因子及其
继发效应所致的血管局部级联放大的失控性炎症反
应，与ＡＳ的发生、发展密切相关［４５］。前期研究显
示，防治 ＡＳ有效药物 ＳＬ提取物（由丹参、穿心莲
组成）对 ＡＳ家兔模型内皮细胞表面黏附分子
ＩＣＡＭ１无明显影响，但可选择性地作用于其配
基———单核细胞表面黏附分子 ＣＤ１８，且疗效显
著［６７］。基于单核细胞在 ＡＳ早期形成过程中的
复杂作用，推测 ＳＬ提取物对单核细胞黏附之外
的多种细胞功能可能均有一定的影响。本实验
从 ＳＬ提取物对单核细胞附着、迁移、摄脂、分泌
等角度深入观察 ＳＬ提取物对炎症因子作用下单
核细胞功能变化的影响。
１　材料
１１　仪器和试剂　Ｊ３０１低温超速离心机（美国
Ｂｅｃｋｍａｎ）；８４５３Ｅ紫外可见分光光度计（美国
Ａｇｌｉｅｎｔ）。５５０型 ＭＯＤＥＬ酶标仪（美国 ＢｉｏＲａｄ）。
ＨＵＶＥＣ由北京大学医学部分子免疫教研室王露馈
赠。ＴＨＰ１（中国协和医科大学基础部细胞中心）；
ＲＰＭＩ１６４０培养基（ＧＩＢＣＯＢＲＬ，批号１１６５０６２）；高
糖型 ＤＭＥＭ培养基（ＧＩＢＣＯＢＲＬ，批号 １２９２２９４）；
胎牛血清（ＢｉｏｃｈｒｏｍＡＧ，批号０３７９Ｈ）。ＴＮＦα（Ｐｅｐ
ｒｏｔｅｃｈ，批号 ０６０４ＣＹ２５）。考马斯蓝 Ｇ２５０（Ｓｉｇｍａ，
批号ＢＡ９７１９）。大鼠抗人ＩＬ６Ｋｉｔ，批号１１０３７１，大
鼠抗人ＩＬ１０Ｋｉｔ，批号 Ａ０１１，ＡＤＬ。其他试剂均为
国产分析纯。ＳＬ提取物采用醇提取、大孔吸附树脂
富集纯化的方法制备，主要含丹参酮类、丹酚酸类及
穿心莲内酯类等有效组分，可控成分达５０％以上，
由中国中医科学院中药研究所化学室提供。
１２　动物　健康雄性新西兰兔，体重２２～２８ｋｇ，
北京市通力实验动物养殖场提供，合格证号 ＳＣＸＫ
（京）２００５０００３。
２　方法
２１　药物处理　ＳＬ提取物用 ＤＭＳＯ配成储备液，
使用前用培养基稀释到所需浓度（ＤＭＳＯ终浓度不
超过０１％）。
２２　高脂血清（ｈｙｐｅｒｌｉｐｉｄｅｍｉｃｓｅｒｕｍ，ＨＬＳ）制备　
以球囊导管内皮损伤术和高脂饵食法建立家兔 ＡＳ
模型，模型家兔无菌条件下经腹主动脉取血，４℃静
置１ｈ，３０００ｒ·ｍｉｎ－１离心１５ｍｉｎ分离血清。用酶
比色法检测ＴＣ值为１２０７ｍｍｏｌ·Ｌ－１。过滤分装，
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用于ＴＨＰ１摄脂功能检测。
２３　细胞分组及处置　常规培养 ＴＨＰ１，ＨＵＶＥＣ，
据实验需要按不同浓度接种细胞，分别设对照组（Ｃ
组）、ＴＮＦα（Ｍ组）、ＳＬ＋ＴＮＦα（在 Ｍ组的基础上，
加入 ＳＬ提取物 ２，１，０５，０２５，０１２５ｇ·Ｌ－１，为
ＳＬ１～５组），培养２４～４８ｈ，进行细胞功能检测。
２４　ＨＵＶＥＣ与 ＴＨＰ１黏附功能检测　将 ＨＵＶＥＣ
以５×１０５接种于４８孔板，每组均设４个平行孔。待
细胞生长融合后吸弃培养基，ＰＢＳ洗孔１遍，分别加
入５×１０５个／ｍＬ的 ＴＨＰ１细胞悬液、同时加入 ＳＬ
提取物孵育，２４ｈ后以ＴＮＦα２０μｇ·Ｌ－１继续培养
２ｈ弃去上清，ＰＢＳ洗２次去除未黏附细胞。染色法
检测黏附细胞量［８］，每孔加０２ｍｏｌ·Ｌ－１ＮａＯＨ２００
μＬ溶解各孔细胞。取待测各孔细胞溶解液１００μＬ
于标记管，每管加５００μＬ稀释的考马斯亮蓝 Ｇ２５０
染液，充分混匀，静置 １０～３０ｍｉｎ，５７０ｎｍ测定 Ａ
值，其数值大小代表黏附细胞的多少。
２５　ＴＨＰ１摄脂功能检测［９１０］　将 ＴＨＰ１以５×
１０５接种于４８孔板，每组均设４个平行孔。ＳＬ提取
物孵育２４ｈ后加入终浓度为５％的 ＨＬＳ３７℃孵育
４８ｈ。收集细胞，１０００ｒ·ｍｉｎ－１离心１０ｍｉｎ，弃上
清。用ＰＢＳ洗细胞沉淀１次，加入异丙醇０１ｍＬ，
超声振荡１０ｓ／次 ×３次，再以１０００ｒ·ｍｉｎ－１离心
１５ｍｉｎ，吸取上清液，酶比色法测定ＴＣ值。
２６　ＴＨＰ１迁移功能检测［１１］　将ＴＨＰ１以５×１０５
接种于Ｔｒａｎｓｗｅｌ双层培养板上室，以含 ＳＬ提取物
的无血清培养基孵育２４ｈ。下室加入含 ＴＮＦα２０
μｇ·Ｌ－１及５％血清的培养基，３７℃，５％ＣＯ２培养箱
中温育４ｈ。将上室取出，甲醇固定，结晶紫染色，显
微镜下观察各孔迁移至膜外侧细胞情况，取４个视
野进行计数，以细胞数的平均值为细胞迁移数。
２７　ＳＬ提取物对单核细胞分泌功能的影响［１２］　
ＴＨＰ１细胞接种于４８孔培养板，ＳＬ提取物孵育２４
ｈ。加入ＴＮＦα２０μｇ·Ｌ－１３７℃，５％ＣＯ２培养箱中
温育４ｈ。收集各组细胞培养上清液１００μＬ，ＥＬＩＳＡ
法检测ＩＬ６和ＩＬ１０。
２８　 统计学处理　数据均以 珋ｘ±ｓ表示，采用
ＳＰＳＳ１２０软件进行检验，多组间差异比较采用
ＡＮＯＶＡ，Ｐ＜００５为有显著性差异。
３　结果
３１　ＴＮＦα刺激 ＨＵＶＥＣ与 ＴＨＰ１黏附的量效关
系　ＴＮＦα５μｇ·Ｌ－１对细胞黏附率无明显影响，从
１０μｇ·Ｌ－１已具有显著的诱导作用，１０～４０μｇ·
Ｌ－１ＴＮＦα各组对黏附率的影响无明显的量效关系
（６１０７％，７３１１％，７５８９％，８１５６％）。故选用２０
μｇ·Ｌ－１作为后续试验的ＴＮＦα加入量。
３２　ＳＬ提取物对 ＨＵＶＥＣ和 ＴＨＰ１黏附的影响　
结果显示模型组 Ａ５７０值明显升高，与空白对照组比
较，有显著性差异（Ｐ＜００１）。ＳＬ１，２，３组Ａ５７０值明显
下降，与模型组比较有显著性差异（Ｐ＜００１，
Ｐ＜００５，Ｐ＜００５）。表明 ＳＬ提取物对 ＨＵＶＥＣ和
ＴＨＰ１黏附有明显抑制作用。见表１。
表１　ＳＬ提取物对ＨＵＶＥＣ和ＴＨＰ１黏附
的影响（珋ｘ±ｓ，ｎ＝８）
组别
剂量
／ｇ·Ｌ－１
ＴＮＦα
／μｇ·Ｌ－１
Ａ５７０
Ｃ　 － － ０３３６１±００３１２
Ｍ　 － ２０ ０３６０１±０００８５２）
ＳＬ１ ２００ ２０ ０３４０４±００１６８４）
ＳＬ２ １００ ２０ ０３３０９±００１３９３）
ＳＬ３ ０５０ ２０ ０３３７８±００３３７３）
ＳＬ４ ０２５ ２０ ０３５６４±０００８３
ＳＬ５ ０１２５ ２０ ０３４９８±００１１９
　　注：与 Ｃ组相比１）Ｐ＜００５，２）Ｐ＜００１；与 Ｍ组相比３）Ｐ＜
００５，４）Ｐ＜００１（表２，３同）。
３３　ＳＬ提取物对单核细胞迁移功能的影响　模型
组迁移至ｔｒａｎｓｗｅｌ膜下层的细胞数明显增多，与对
照组比较有显著性差异（Ｐ＜００５）。ＳＬ提取物 ５
个剂量组均可显著减少迁移细胞数，与模型组比较
有显著性差异（Ｐ＜００５，Ｐ＜００１，Ｐ＜００５，Ｐ＜
００１，Ｐ＜００１）。见图１。
３４　ＳＬ提取物对单核细胞摄脂功能的影响　与对
照组比较，模型组细胞内 ＴＣ值明显升高 （Ｐ＜
００１）。ＳＬ提取物各剂量组均可显著降低 ＴＣ值
（Ｐ＜００１）。见表２。
３５　ＳＬ提取物对单核细胞分泌功能的影响　与对
照组比较，模型组细胞上清中 ＩＬ６含量明显升高
（Ｐ＜００１），ＩＬ１０含量明显降低（Ｐ＜００１）。ＳＬ１
可显著降低异常增高的ＩＬ６值 （Ｐ＜００１），同时升
高细胞上清中 ＩＬ１０的含量 （Ｐ＜００１），其他剂量
未见明显作用。见表３。
４　讨论
ＡＳ早期炎症反应过程中迁移、渗出到血管损伤
局部的细胞以单核、淋巴细胞为代表，单核细胞黏附
于内皮表面的数量可高出正常时的１０～１５倍［１３］。
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图１　ＳＬ提取物对ＴＨＰ１迁移功能的影响
表２　ＳＬ提取物对ＴＨＰ１摄脂功能的影响（珋ｘ±ｓ，ｎ＝８）
组别
剂量
／ｇ·Ｌ－１
ＨＬＳ
／μＬ
ＴＣ
／ｍｍｏｌ·Ｌ－１
Ｃ　 － － ２０１±０２２
Ｍ　 － １０ ３３０±０８６２）
ＳＬ１ ２００ １０ １４３±１０１４）
ＳＬ２ １００ １０ １１３±０１２４）
ＳＬ３ ０５０ １０ １２４±０７０４）
ＳＬ４ ０２５ １０ １２８±０３１４）
ＳＬ５ ０１２５ １０ １５７±０５３４）
表３　ＳＬ提取物对ＴＨＰ１分泌功能的影响（珋ｘ±ｓ，ｎ＝８）
组别
剂量
／ｇ·Ｌ－１
ＩＬ６
／ｎｇ·Ｌ－１
ＩＬ１０
／ｎｇ·Ｌ－１
Ｃ　 － １１７７±０５６ １３８６±１２３
Ｍ　 － １５４９±１６２１） ７５４±２４７１）
ＳＬ１ ２００ １１１０±１０５４） １５２９±１５４４）
ＳＬ２ １００ １３８２±１６２ １０８０±４６２
ＳＬ３ ０５０ １５０４±２０９ ８３５±３２４
ＳＬ４ ０２５ １３９５±２２４ ９９８±３８９
ＳＬ５ ０１２５ １３４９±０８９ １０３９±１９７
ＡＳ斑块形成的起始阶段，内皮损伤处浸润的单
核细胞在损伤处附着、滚动、黏附、迁移、分化、摄
脂，最终成为单核细胞源泡沫细胞，是 ＡＳ早期炎
症的典型特征之一。单核内皮细胞相互作用对
其功能的影响主要有［１４１５］，单核细胞通过直接接
触上调内皮细胞黏附分子表达，进一步促进二者
的黏附和相互作用（中性粒内皮细胞接触对这
些分子的表达无显著影响）；单核细胞黏附能诱
导内皮细胞 ＴＮＦα，ＧＭＳＦ，纤溶酶原激活物抑
制１的表达，导致内皮细胞促凝活性增强，并下
调内皮细胞一氧化氮合酶表达。对单核细胞的
功能也产生一系列的影响，如激活并诱导单核细
胞自体表达 ＩＬ１β，ＩＬ８，ＰＤＧＦ，肝素结合性表皮
生长因子，单核细胞组织因子等。此外在此过程
中单核细胞、内皮细胞均可过表达 ＭＭＰｓ。可见，
干预单核细胞的功能对防治 ＡＳ及其炎症反应有
重要的意义。
ＳＬ提取物是根据中医临床经验，融合组分配伍
的理念和方法，针对 ＡＳ炎症反应网络、以活血化
瘀、清热解毒为法组方用以预防、治疗 ＡＳ疾病的中
药复方提取物，提取物中可控成分达５０％以上。本
课题组前期研究结果表明［１６］，ＳＬ提取物对整体动
物具有良好的防治ＡＳ作用，可明显局限 ＡＳ斑块面
积，减轻病变程度，并可阻断 ＡＳ炎症反应，抑制炎
性介质的产生和释放，减少黏附分子、趋化因子和生
长因子等在 ＡＳ过程中的异常表达。同时发现［８］，
以球囊导管内皮损伤术和高脂饵食法建立家兔 ＡＳ
模型中始终存在血清 ＴＮＦα的高表达现象，并且其
表达程度与斑块最大内膜厚度呈正相关。故在体外
实验中，采用ＴＮＦα作为刺激因素，模拟ＡＳ炎症损
伤因子，观察药物的作用。
本实验进一步验证，ＳＬ提取物对ＴＮＦα诱导下
的单核内皮细胞黏附具有直接抑制作用，它对单核
细胞功能的影响除前期体内实验结果已证实的阻断
细胞表面黏附分子ＣＤ１８表达外，对单核细胞迁移、
摄脂、分泌等环节均有不同程度的影响。ＳＬ提取物
对单核内皮细胞交互作用过程中产生的一系列继
发效应的直接或间接干预作用可能是其抑制 ＡＳ炎
症反应的机制之一。
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ＬＩＹｕｊｉｅ，ＹＡＮＧＱｉｎｇ，ＷＥＮＧＸｉａｏｇａｎｇ，ＺＨＵＸｉａｏｘｉｎｇ，ＷＡＮＧＹｉｗｅｉ，ＬＩＵＸｉａｏｎｉ，ＨＡＮＸｉａｏ
（ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ，ＣｈｉｎａＡｃａｄｅｍｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ
Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００７００，Ｃｈｉｎａ）
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ｉｎｐｒｅｍｏｎｏｃｙｔｉｃｃｅｌｌｉｎｅＴＨＰ１ｉｎｄｕｃｅｄｂｙＴＮＦαＭｅｔｈｏｄ：ＳＬｅｘｔｒａｃｔｓ（０１２５２ｇ·Ｌ－１）ｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｉｎｃｕｂａｔｅＴＨＰ１ｆｏｒ２４ｈ
ｂｅｆｏｒｅｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｗｉｔｈＴＮＦα（２０μｇ·Ｌ－１），ｔｈｅａｄｈｅｓｉｏｎ，ｍｉｇｒａｔｉｏｎ，ｌｉｐｉｄｕｐｔａｋｅａｎｄｓｅｃｒｅｔｉｏｎｏｆＴＨＰ１ｗｅｒｅｏｂｓｅｒｖｅｄＲｅｓｕｌｔ：
ＳＬ（０５２ｇ·Ｌ－１）ｈａｄｏｂｖｉｏｕｓｅｆｅｃｔｏｎｄｅｃｒｅａｓｉｎｇｔｈｅＴＨＰ１ａｄｈｅｓｉｏｎ．Ｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆｐａｓｓｅｄｍｅｍｂｒａｎｅｗａｓｍｕｃｈｆｅｗｅｒｔｈａｎｔｈａｔ
ｏｆｃｏｎｔｒｏｌｃｅｌｓｉｎＳＬ（０１２５２ｇ·Ｌ－１）．ＳＬ（０１２５２ｇ·Ｌ－１）ｒｅｄｕｃｅｄｔｈｅｔｏｔａｌｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｃｏｎｔｅｎｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ．ＴｈｅｌｅｖｅｌｓｏｆＩＬ６ｉｎ
ＳＬ（２ｇ·Ｌ－１）ｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄ，ａｎｄＩＬ１０ｗａｓｉｎｃｒｅａｓｅｄｔｈａｎｔｈａｔｂｅｆｏｒｅｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＳＬｅｘｔｒａｃｔｓｃｏｕｌｄ
ｐｒｏｍｏｔｅｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｒｅｃｏｖｅｒｙｓｕｃｈａｓａｄｈｅｓｉｏｎ，ｍｉｇｒａｔｉｏｎ，ｌｉｐｉｄｕｐｔａｋｅａｎｄｓｅｃｒｅｔｉｏｎｏｆＴＨＰ１ｉｎｄｕｃｅｄｂｙＴＮＦα，ｗｈｉｃｈｐｒｏｂａｂｌｙｉｓ
ｏｎｅｏｆｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｒｅａｃｔｉｏｎｉｎｉｎｉｔｉａｔｉｏｎａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＡＳ
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］　ａｒｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ；ｅｘｔｒａｃｔｓｏｆＤａｎｓｈｅｎａｎｄＣｈｕａｎｘｉｎｌｉａｎ；ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ；ＴＨＰ１
ｄｏｉ：１０．４２６８／ｃｊｃｍｍ２０１００８２０
［责任编辑　张宁宁］
·３３０１·
第３５卷第８期
２０１０年４月
　　　　　　 　 　 　 　 　　　　　　 　 　 　 　
Ｖｏｌ３５，Ｉｓｓｕｅ　８
Ａｐｒｉｌ，２０１０